皂角刺提取液對人鼻咽癌CNE-2細胞增殖和凋亡的影響

錢湃梓，彭桂原，郭 賽，林潔玲

鼻咽癌是中國的高發(fā)惡性腫瘤之一，尤其多發(fā)于南部地區(qū)如廣東、廣西、福建等省份。流行病學(xué)研究[1]顯示，中國的鼻咽癌發(fā)病率達(30～50)/10萬，病人數(shù)量約占世界總病人數(shù)的50%。放療、化療是當前鼻咽癌的共識性治療方法，但常常難以避免地伴隨治療損傷，甚至致使部分病人不能耐受并終止治療，影響病人的生活質(zhì)量[2]。故此研究新型輔助抗腫瘤治療藥物以減少放化療治療的劑量、降低放化療損傷，對于提升鼻咽癌病人的生存預(yù)期與生活質(zhì)量顯示出重要的意義。中藥是中國傳統(tǒng)醫(yī)療的知識瑰寶，其在現(xiàn)當代研究中顯示出多靶點、多層次、多效應(yīng)的藥效特點，中藥的抗腫瘤作用逐漸成為當前研究的新浪潮，近年來如木鱉子[3]、高麗參[4]、尖尾芋[5]的提取物等抗腫瘤作用也逐漸得到相關(guān)研究證實。因此探尋中藥的抗腫瘤作用，有望改善鼻咽癌的傳統(tǒng)治療方式，提升治療效果。皂角刺是傳統(tǒng)醫(yī)籍中具有行氣化痰、散結(jié)消癥功效的藥物，多項研究[6-8]表明皂角刺及其提取物對肝癌、肺癌、結(jié)腸癌均有一定的的抗腫瘤作用。本研究主要探索皂角刺提取液對鼻咽癌 CNE-2 細胞增殖與凋亡的影響，為鼻咽癌治療探尋新型輔助抗腫瘤藥物提供理論基礎(chǔ)與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞來源、主要試劑與設(shè)備 人低分化鼻咽癌細胞株(CNE-2)，由中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院提供；皂角刺提取液，由康美藥業(yè)股份有限公司提供并于廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院提取制備(產(chǎn)品批號20180716)；RPMI 1640培養(yǎng)液、FBS胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化液、PBS磷酸鹽緩沖液、MTT二苯基四氮唑溴鹽溶液均購自Thermo Fisher Scientific公司；青鏈霉素混合液(100X)購自Solarbio公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自Roche公司；超凈工作臺購自海爾公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱、移液器、酶標儀均購自Thermo Fisher Scientific公司；流式細胞儀購自BD公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自鄭州長城科工貿(mào)易公司；凍干機購自LABCONCO公司。

1.2 方法

1.2.1 制備皂角刺提取液 將皂角刺飲片置入烘箱 70 ℃干燥3 h后取100 g粉碎，使用3號篩過篩取得皂角刺粗藥粉。將粗藥粉干燥至恒重并冷卻后精密稱取600 g置于圓底燒瓶中，加入純水600 mL回流提取2 h，將處理液通過0.22 μm微孔濾膜濾過，收集濾液并置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，調(diào)整壓力至-400 mmHg、轉(zhuǎn)速為100 r/min條件下加熱蒸餾20 min，收集殘留物。取殘留物置于凍干機，調(diào)整溫度為-50 ℃、壓力至3 MPa條件下凍結(jié)升華，收集藥粉作為皂角刺提取物。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及藥液制備 使用RPMI 1640培養(yǎng)液，并于其中加入10%的胎牛血清、1%的青鏈霉素混合液后充分混勻配置為完全培養(yǎng)液。將鼻咽癌 CNE-2 置于6 cm培養(yǎng)皿中，加入8 mL完全培養(yǎng)液，并置于95%飽和濕度、5% CO2、37 ℃條件下的培養(yǎng)箱中孵育，每24～48 h更換1次培養(yǎng)基，并于光鏡下觀察細胞生長狀態(tài)。待貼壁細胞處于對數(shù)生長期，視野中呈80%左右融合后，加入胰蛋白酶液消化分離，待鏡下觀察細胞體回縮變圓、細胞間分離解除后，加入完全培養(yǎng)液終止消化。將消化后的細胞轉(zhuǎn)移至無菌離心管內(nèi)，使用離心機以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，吸棄上清液，再加入完全培養(yǎng)液充分混懸，調(diào)節(jié)細胞濃度至105/mL后轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿，加入8 mL完全培養(yǎng)液進行孵育，每24～48 h更換1次培養(yǎng)基，光鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，每3～4天傳代1次。實驗分為皂角刺組與陰性對照組。皂角刺提取液使用皂角刺提取物充分混懸于完全培養(yǎng)液制備而成。

1.2.3 MTT比色法檢測鼻咽癌細胞增殖 取對數(shù)期生長的細胞，用胰蛋白酶液進行消化分離，轉(zhuǎn)移至無菌離心管內(nèi)，調(diào)節(jié)細胞濃度為5×104/mL后轉(zhuǎn)移接種于96孔培養(yǎng)板中，每次共接種3板，分別標記后置于培養(yǎng)箱中孵育12 h，光鏡下觀察細胞貼壁后吸棄培養(yǎng)液，每張培養(yǎng)板內(nèi)分為10組，其中8組為皂角刺組，每組設(shè)置4個復(fù)孔，分別加入濃度為0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6 mg/mL的皂角刺提取液；2組為陰性對照組，每組設(shè)置4個復(fù)孔，加入完全培養(yǎng)液；剩余孔內(nèi)加入PBS液作為調(diào)零組。將處理完成的3塊孔板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育。分別于加入藥物的12、24、48 h后各取一塊板，吸棄孔內(nèi)溶液，每孔加入MTT溶液10 μL、完全培養(yǎng)液100 μL，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后吸棄孔內(nèi)液體；再予每孔加入150 μL DMSO溶液，置于微孔板搖床以90 r/min搖勻10 min。待結(jié)晶完全溶解后，在室溫條件下(20～26 ℃)將96孔板用酶標儀以波長490 nm進行比色，測定每孔的吸光度(OD)值。采集數(shù)據(jù)結(jié)果并計算增殖抑制率，增殖抑制率(%)=[1-(皂角刺組OD值-調(diào)零孔OD值)/(陰性對照組OD值-調(diào)零孔OD值)]×100%。

1.2.4 流式細胞儀檢測鼻咽癌細胞凋亡 取對數(shù)生長期的細胞，用胰蛋白酶液進行消化分離，調(diào)整細胞濃度為4×105/mL后，使用移液器以每孔2 mL轉(zhuǎn)移接種于6孔培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h。光鏡下觀察孔板內(nèi)貼壁細胞達90%融合度后吸棄培養(yǎng)液，于皂角刺組孔內(nèi)加入2、2.5、3 mg/mL皂角刺提取液，陰性對照組孔內(nèi)加入完全培養(yǎng)液，調(diào)零孔加入PBS液，置于培養(yǎng)箱孵育48 h，光鏡下觀察細胞貼壁生長后消化并收集細胞；予PBS液重懸洗滌并使用離心機以1 500 r/min離心10 min，重復(fù)2次；再向每支離心管內(nèi)分別加入200 μL Binding Buffer液、10 μL Annexin V-FITC液、5 μL PI液輕柔混勻，室溫下(20～26 ℃)避光孵育，10 min后進行流式細胞儀檢測。采集數(shù)據(jù)并計算凋亡率，總凋亡率=早期凋亡細胞率(LR區(qū)域)+晚期細胞凋亡率(UR區(qū)域)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測鼻咽癌細胞的增殖抑制情況 通過進行MTT比色法檢測，結(jié)果顯示，不同濃度(0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6 mg/mL)的皂角刺溶液作用于鼻咽癌CNE-2細胞12、24、48 h后，較低濃度藥物組(0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL)在作用12、24 h后均對細胞增殖產(chǎn)生抑制效應(yīng)，在作用48 h后僅0.2 mg/mL濃度藥物對細胞增殖產(chǎn)生抑制效應(yīng)。較高濃度藥物組(3.2、6.4、12.8、25.6 mg/mL)作用12、24、48 h后均可顯著抑制細胞增殖，其增殖抑制率均高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中3.2、6.4、12.8 mg/mL濃度藥物作用48 h后對細胞增殖的抑制效應(yīng)較為明顯。根據(jù)6次重復(fù)實驗的結(jié)果計算，計算皂角刺提取液作用于鼻咽癌細胞48 h后的半數(shù)抑制濃度(IC50)為(2.53±0.25)mg/mL (見表1)。

表1 不同濃度皂角刺提取液作用于鼻咽癌 CNE-2細胞的增殖抑制率

2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡 流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，將濃度分別為2、2.5、3 mg/mL的皂角刺提取液分別作用于鼻咽癌CNE-2細胞48 h后，其總凋亡率分別為(15.61±1.21)%、(22.08±1.70)%、(37.62±2.07)%，結(jié)果均高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見表2)。

表2 不同濃度皂角刺提取液作用于鼻咽癌CNE-2細胞的凋亡率

3 討論

皂角刺為豆科植物皂莢的干燥棘刺，分布于廣東、廣西、河北、山東、河南等地，作為傳統(tǒng)中藥，在多部古籍中均有記載，如《藥鑒》記載皂角刺“主治諸般腫毒惡瘡，能引諸品直至潰處，外科之圣藥也”，《本草崇原》記載其可“化痰，敗毒攻毒”，《本草備要》則論其可“消痰破堅”。近年來通過高效液相色譜法測定皂角刺成分，結(jié)果顯示皂角刺中化學(xué)物質(zhì)組成以黃酮類化合物為主[9]。李崗等[10]對皂角刺黃酮類化合物進行分離純化后取得紫鉚查耳酮，作用于人乳腺癌細胞后顯示出較為明顯的細胞增殖抑制作用。曹冉冉等[11]研究發(fā)現(xiàn)，皂角刺提取獲得的槲皮素、二氫黃酮醇類化合物等對肝癌 HepG2細胞、肺癌 A549 細胞和食管癌 EC109 細胞均表現(xiàn)出抑制增殖作用。對于中草藥抗腫瘤作用機制的研究有多項研究結(jié)果，YI等[12]使用皂角刺經(jīng)乙醇提取物進行體內(nèi)及體外實驗，發(fā)現(xiàn)其可以通過降低促血管生成蛋白、內(nèi)皮素-1和基質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達，達到抑制腫瘤細胞侵襲、腫瘤組織相關(guān)血管生成的效果，對腫瘤組織的增殖及發(fā)展產(chǎn)生抑制作用，并呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系。龍玲等[13]發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的增殖抑制與細胞核抗原PCNA及突變型P53蛋白表達的調(diào)節(jié)有關(guān)。RAYCHAUDHURI等[14-15]學(xué)者研究顯示腫瘤細胞的增殖抑制與血清Trk水平的調(diào)節(jié)有關(guān)，李哲等[16]則研究發(fā)現(xiàn)抑制作用與TNF-α/STAT3通路的激活相關(guān)。本研究使用皂角刺提取液對鼻咽癌細胞作用后顯示，在一定的濃度及時間范圍內(nèi)，皂角刺提取液對體外培育的鼻咽癌CNE-2細胞的增殖均有抑制作用；干預(yù)48 h后，3.2、6.4、12.8、25.6 mg/mL的皂角刺提取液對鼻咽癌細胞的增殖抑制率分別達到(89.61±1.88)%、(96.99±0.66)%、(93.88±1.24)%、(84.15±0.86)%，結(jié)果明顯高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05～P<0.01)，而較高藥物濃度組(3.2、6.4、12.8、25.6 mg/mL)的抑制細胞增殖效應(yīng)較為明顯。表明皂角刺提取液能夠抑制鼻咽癌細胞CNE-2的增殖，并且作用48 h后抑制增殖效應(yīng)較為明顯。本研究通過流式細胞儀檢測分析，發(fā)現(xiàn)一定濃度范圍內(nèi)的皂角刺提取液均能誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-2細胞凋亡，3 mg/mL皂角刺提取液作用48 h后，細胞凋亡率為(37.62±2.0%)，明顯高于陰性對照組凋亡率(4.64±0.60%)，表明皂角刺提取液能夠誘導(dǎo)鼻咽癌細胞CNE-2凋亡。凋亡是細胞受基因調(diào)控的自身消解過程，是復(fù)雜的連鎖反應(yīng)，涉及多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、通路調(diào)節(jié)及多種物質(zhì)釋放，一般認為其機制與抗凋亡基因Bcl-2和促調(diào)亡基因Bax轉(zhuǎn)錄合成的相關(guān)蛋白量以及比例有關(guān)，何峰等[17]研究發(fā)現(xiàn)皂角刺含藥血清通過調(diào)節(jié)凋亡基因 Bcl-2、Bax的表達從而誘導(dǎo)直腸癌細胞凋亡。

綜上所述，本實驗結(jié)果表明皂角刺提取液可抑制鼻咽癌細胞CNE-2增殖，并可誘導(dǎo)其凋亡。目前尚未得知皂角刺提取液對鼻咽癌細胞抑制增殖與誘導(dǎo)凋亡作用的機制，可進一步深入研究體內(nèi)環(huán)境下皂角刺對腫瘤生長的影響，及組織內(nèi)腫瘤相關(guān)標志物含量的變化。