特比萘酚及其鹽酸鹽的農(nóng)用抗真菌活性

侯 帥，鄧連波，蔡竟杰，孫然鋒

（海南大學(xué) 熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/植物保護(hù)學(xué)院，?？?570228）

植物病害嚴(yán)重威脅農(nóng)業(yè)健康發(fā)展和糧食安全問題，全世界每年因植物病害造成的糧食損失已達(dá)11%[1-3]。我國棉花受病害的影響，每年造成12% 的經(jīng)濟(jì)損失；1990 年我國小麥條銹病大流行，減產(chǎn)25 億kg；1993 年，我國南方水稻種植區(qū)域稻瘟病大流行，水稻減產(chǎn)150 億kg[4-5]。化學(xué)殺菌劑的濫用，加劇植物病原菌對殺菌劑抗藥性的發(fā)展速度，并嚴(yán)重威脅環(huán)境安全和人類健康[6-7]。因此，研究與開發(fā)高效、低毒、低殘留的新型農(nóng)藥，已成為目前農(nóng)藥創(chuàng)制的首要目標(biāo)[6-8]。特比萘酚（Terbinafine）和鹽酸特比萘酚（Terbinafine hydrochloride）為烯丙胺類廣譜抗真菌藥，商品名為療霉舒（Lamisil），由諾華公司（瑞士）人工合成，具有殺菌及抑菌雙重作用[9]；其具有高度疏水性，因此，傾向在頭發(fā)、皮膚、指甲和脂肪組織累積。特比萘酚位列于世界衛(wèi)生組織基本藥物標(biāo)準(zhǔn)清單中，是基礎(chǔ)醫(yī)療體系的必備藥物之一，適用于淺表真菌引起的皮膚和指甲感染，如各種體癬、手足癬以及皮膚白色假絲酵母菌感染[10]。特比萘酚對高等動物低毒已經(jīng)在醫(yī)藥研究和使用的實(shí)踐中得到了驗(yàn)證[11]。目前，這2 種藥物對植物病害的防治效果尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)通過病原真菌離體培養(yǎng)和盆栽活體實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式，研究特比萘酚和鹽酸特比萘酚對多種植物病原真菌病害的影響，旨在尋找這2 種藥物在農(nóng)作物病害防治領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)的溶劑均來自廣東西隴科技股份有限公司；特比萘酚（濃度為>98%，Damasbeta）、鹽酸特比萘酚（濃度為>98%，Damas-beta）及丙環(huán)唑（濃度為97%，Aladdin）等原藥均購自北京伊諾凱科技有限公司，并可直接使用；寄主植物種子（黃瓜：Cucumis sativus.,津研4 號小麥：Triticum aestivumL.,豫麥8 號；番茄：Lycopersicon esculentumMill.,浙粉202；水稻：Oryza sativaL.,南京46；豇豆：Vigna unguiculata(Linn.) Walp.,幫達(dá)2 號；玉米：Zea maysL.,鄭單958；大豆：Glycine max(Linn.) Merr.,中黃57）播種于裝滿滅菌土的花盆中，在溫室（24±1）℃，相對濕度80%下培養(yǎng)至2 葉期備用；盆栽的土壤來自海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院教學(xué)基地，土壤經(jīng)干熱滅菌（120 ℃，50 min）。

1.2 供試菌種本實(shí)驗(yàn)供試菌種見表1。

表1 供試菌種Tab.1 All fungal strains under test

1.3 特比萘酚、鹽酸特比萘酚和丙環(huán)唑微乳劑的配制分別將1 g 特比萘酚、1 g 鹽酸特比萘芬和1 g 丙環(huán)唑溶于20 mL 乙酸乙酯溶液和20 mL 乙醇溶液中，超聲5 min，再加入20 mL 農(nóng)藥乳化劑1601#和1 mL 乙二醇，最后加入39 mL 水，用磁力攪拌器攪拌30 min（28 ℃，200 r·min-1），配制成穩(wěn)定的1%特比萘酚、鹽酸特比萘芬和丙環(huán)唑微乳劑。

1.4 離體抗真菌活性測定采用菌絲生長速率抑制法檢測體外菌絲抑制率[12-13]。將特比萘酚和鹽酸特比萘芬溶解于N,N-二甲基甲酰胺(v/v=0.5% DMF)中，與PDA 培養(yǎng)基混合至終濃度。以不含化合物的0.5% DMF 作為空白對照，以嘧菌酯和烯唑醇為陽性對照。用滅過菌的打孔器（直徑0.5 cm)將病原菌（已活化）打成菌餅。將帶菌絲的菌餅接入無菌的PDA 平板中心。將處理和對照置于培養(yǎng)箱中（27±1）℃黑暗培養(yǎng)2～6 d，待對照組病原菌長至菌落直徑5.5 cm 以上結(jié)束實(shí)驗(yàn)。所有處理均重復(fù)3 次。使用標(biāo)準(zhǔn)刻度尺，用十字交叉法測量抑菌圈直徑(cm)，取平均值。

菌絲生長抑制率=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/(對照菌落直徑-0.5)×100%。

1.5 盆栽抑菌實(shí)驗(yàn)

1.5.1 孢子懸浮液的配制方法大豆銹病和白粉病孢子懸浮液配制，剪取長滿孢子的植物葉片（溫室中自然發(fā)病的植物葉片），加入含有表面活性劑的去離子水，用毛筆將病葉上的孢子洗下，經(jīng)2 層紗布過濾，制成孢子懸浮液，采用血細(xì)胞計算器計數(shù)，計算出該溶液中孢子濃度，經(jīng)過無菌水稀釋成5×106CFU·mL-1的孢子懸浮液，待用。

玉米大小斑病、黃瓜靶斑病和灰霉病孢子懸浮液配制，在已長滿孢子的培養(yǎng)皿中加入無菌水，輕輕刮取表面孢子，經(jīng)2 層紗布過濾，制成孢子懸浮液，采用血細(xì)胞計算器計數(shù)，計算出該溶液中孢子濃度，經(jīng)過無菌水稀釋成5×106CFU·mL-1的孢子懸浮液，待用。

1.5.2 特比萘酚和鹽酸特比萘酚微乳劑對豇豆白粉病盆栽防效試驗(yàn)方法本實(shí)驗(yàn)在海南大學(xué)溫室中完成。參考《農(nóng)藥生物活性測試標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》測定各藥劑對作物的保護(hù)作用[12]。1%特比萘酚和鹽酸特比萘酚微乳劑用水稀釋至100、25、12.5 mg·L-1實(shí)驗(yàn)溶液，丙環(huán)唑微乳劑用水稀釋至50、25、12.5 mg·L-1實(shí)驗(yàn)溶液，然后用噴霧器將實(shí)驗(yàn)溶液噴霧到2 葉期豇豆植株上（噴霧壓力為1.5 kg·cm-2，藥液量約為675 L·hm-2），直到液體均勻布滿葉片。24 h 后，將孢子懸浮液（5 × 106CFU·mL-1）噴施于豇豆葉片上。處理后的植株均置于溫室（24±1）℃，相對濕度80%條件下培養(yǎng)。每處理重復(fù)3 次。以丙環(huán)唑?yàn)殛栃詫φ?，以不含特比萘酚和鹽酸特比萘酚的微乳劑作為空白對照。14 d 后按病情分級標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查發(fā)病情況，并計算防治效果。

病情分級標(biāo)準(zhǔn)如下:

0 級:無病;

1 級:病變面積占整個葉面積的<5%;

3 級:病變面積占整個葉面積的≥5%～<10%;

5 級:病變面積占整個葉面積的≥10%～<20%;

7 級:病變面積占整個葉面積的≥20%～<40%;

9 級:病變面積占整個葉面積的≥40%以上。

1.5.3 對8 種植物病害的室內(nèi)盆栽防效試驗(yàn)方法本實(shí)驗(yàn)在沈陽化工研究院完成。參考《農(nóng)藥生物活性測試標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》測定各藥劑對作物的保護(hù)作用[12]。將特比萘酚和鹽酸特比萘酚（8 mg）溶于丙酮（1 mL）中，并用含有0.5%（v/v）Tween 80 的無菌水（19 mL）稀釋至400、100、25 mg·L-1溶液。然后用噴霧器將實(shí)驗(yàn)溶液噴霧到寄主植株上（噴霧壓力為1.5 kg·cm-2，藥液量約為675 L·hm-2），直到液體均勻布滿葉片，并以等量溶劑的吐溫水作為空白對照，嘧菌酯、乙霉威、乙醚酚、咪鮮胺和啶酰菌胺作為陽性對照，自然風(fēng)干24 h 后接種病原菌。將配置好的實(shí)驗(yàn)溶液[小麥白粉?。?×106CFU·mL-1）、大豆銹病病菌（5×106CFU·mL-1）、王米小斑病菌（5×106CFU·mL-1）、黃瓜靶斑病菌（5×106CFU ·mL-1）、黃瓜白粉病菌（5×106CFU·mL-1）、玉米大斑病菌（5×106CFU·mL-1）、番茄灰霉病菌（5×106CFU·mL-1）]噴霧于2 葉期寄主植株上，將水稻紋枯病菌的菌餅（直徑0.5 cm）夾在水稻幼苗底部，然后把植物移入溫室中培養(yǎng)[（24±1）℃，濕度RH>80]。5～7 d 后按病情分級標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查發(fā)病情況，并計算防治效果。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。病情分級標(biāo)準(zhǔn)和防治效果計算公式見1.5.2。

1.6 數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計過程均用Excel 2019 和SPSS 26.0 完成。幾率值法建立毒力回歸方程及計算EC50，顯著性檢驗(yàn)則是單因素方差分析后Duncan 法比較均值間的差異顯著性，顯著水平設(shè)定為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 特比萘酚和鹽酸特比萘酚對植物病原菌抑菌活性的測定采用生長速率法測定特比萘酚和鹽酸特比萘酚在不同濃度下對16 種植物病原真菌的抑菌活性，結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，特比萘酚和鹽酸特比萘酚對16 種植物病原真菌都表現(xiàn)出良好的抑菌效果（EC50為0.03～1.22 mg·L-1），其中特比萘酚和鹽酸特比萘酚對9 種植物病原真菌（山茶灰斑病菌、小麥赤霉病菌、玉蜀黍赤霉病菌、芒果蒂腐病菌、橡膠炭疽病菌、串珠鐮孢病菌、油菜菌核病菌、芒果炭疽病菌和黃瓜灰霉病菌等）的抑制效果均顯著高于商品化殺菌劑嘧菌酯和三唑類殺菌劑烯唑醇。特比萘酚對8 種真菌（山茶灰斑病菌、小麥赤霉病菌、玉蜀黍赤霉病菌、茄鏈格孢病菌、火龍果潰瘍病菌、香蕉炭疽病菌、橡膠炭疽病菌和冬瓜炭疽病菌等）的抑制活性較強(qiáng)，其EC50分別為0.10、0.03、0.09、0.07、0.24、0.21、0.11、0.07 mg·L-1，鹽酸特比萘酚對5 種真菌（山茶灰斑病菌、小麥赤霉病菌、玉蜀黍赤霉病菌、茄鏈格孢病菌和火龍果潰瘍病菌等）的抑制活性較強(qiáng)，其EC50分別為0.09、0.03、0.10、0.07、0.22 mg·L-1。植物病原菌抑菌活性測定結(jié)果說明，特比萘酚和鹽酸特比萘酚對農(nóng)業(yè)病菌表現(xiàn)出顯著的抑制活性。

表2 特比萘酚和鹽酸特比萘酚對16 種植物病原真菌的抑菌活性Tab.2 Antifungal activities of terbinafine and terbinafine hydrochloride against 16 species of plant pathogenic fungi

2.2 盆栽試驗(yàn)豇豆白粉病盆栽噴霧法表明，特比萘酚和鹽酸特比萘芬微乳劑對豇豆白粉病均起到良好的抑制效果（圖1，表3）。在濃度為100 mg·L-1時，特比萘酚和鹽酸特比萘酚微乳劑完全抑制了白粉病病原菌的侵染，防治效果與注冊殺菌劑丙環(huán)唑（50 mg·L-1）的防效相似。隨著藥劑濃度的降低，防治效果呈現(xiàn)不同程度的降低，在25、12.5 mg·L-1時，特比萘酚和鹽酸特比萘酚微乳劑防效分別為88.68%、36.97%和94.42%、68.14%，而丙環(huán)唑微乳劑的防效分別為89.70%和57.16%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在高濃度（100 mg·L-1）時，特比萘酚和鹽酸特比萘芬微乳劑的防效與注冊殺菌劑丙環(huán)唑的防效相似，低濃度（25、12.5 mg·L-1）時，特比萘酚和鹽酸特比萘芬微乳劑的防效較差。

表3 特比萘酚和鹽酸特比萘酚微乳劑對豇豆白粉病的室內(nèi)盆栽防效Tab.3 In vivo protective effect of terbinafine and terbinafine hydrochloride microemulsions against Podosphaera xanthii

圖1 特比萘酚和鹽酸特比萘酚微乳劑對豇豆白粉病的活體防效Fig.1 In vivo protective effect of terbinafine and terbinafine hydrochloride microemulsion against Podosphaera xanthii

采用盆栽噴霧法測定濃度為400、100、25 mg·L-1時，特比萘芬的鹽酸特比萘芬溶液對水稻紋枯病、小麥白粉病、大豆銹病和玉米小斑病的防治效果（表4）。由表4 可見，特比萘酚和鹽酸特比萘酚溶液對4 種植物病害均有較好的防效，隨著濃度的降低，防治效果逐漸下降，特比萘酚和鹽酸特比萘酚溶液對水稻紋枯病菌和小麥白粉病的防效最顯著，在400 mg·L-1時，幾乎完全抑制了2 種真菌病害的侵染，與注冊商品殺菌劑嘧菌酯（25 mg·L-1）防效相似；特比萘酚和鹽酸特比萘酚溶液對大豆銹病和玉米小斑病的防效較差。采用室內(nèi)盆栽防效試驗(yàn)測定不用濃度特比萘酚和鹽酸特比萘酚溶液對黃瓜靶斑病菌、黃瓜白粉病菌、玉米大斑病菌和番茄灰霉病菌的防治效果（表5）。由表5 可見，2 種藥劑不同濃度對不同的植物病原菌抑制效果不同，特比萘酚和鹽酸特比萘酚溶液在濃度為400 mg·L-1時，對黃瓜白粉病和番茄灰霉病的防效與化學(xué)殺菌劑乙醚酚（25 mg·L-1）和啶酰菌胺（50 mg·L-1）的防效相似，對黃瓜靶斑病菌和玉米大斑病菌的防效優(yōu)于化學(xué)殺菌劑乙霉威（100 mg·L-1）和咪鮮胺（100 mg·L-1）。

表4 特比萘酚和鹽酸特比萘酚溶液對4 種真菌病害的室內(nèi)盆栽防效Tab.4 In vivo protective effect of terbinafine and terbinafine hydrochloride solution against four species of phytogenic fungi

表5 特比萘酚和鹽酸特比萘酚溶液對4 種真菌病害的室內(nèi)盆栽防效Tab.5 In vivo protective effect of terbinafine and terbinafine hydrochloride solution against four species of phytogenic fungi

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，特比萘酚和鹽酸特比萘芬對植物病原真菌均有良好的抑制作用。在離體條件下，對16 種植物病原真菌的EC50均在0.8 mg·L-1以下，其中特比萘酚對6 種真菌（山茶灰斑病菌、小麥赤霉病菌、玉蜀黍赤霉病菌、茄鏈格孢病菌、橡膠炭疽病菌和冬瓜炭疽病菌等）的抑制活性最強(qiáng)，EC50均在0.10 mg·L-1以下；鹽酸特比萘酚對4 種真菌（山茶灰斑病菌、小麥赤霉病菌、玉蜀黍赤霉病菌和茄鏈格孢病菌等）的抑制活性最強(qiáng)，EC50均在0.10 mg·L-1以下。盆栽試驗(yàn)中，濃度為100 mg·L-1時，能完全抑制豇豆白粉病的侵染，抑制率均在100%；濃度為400 mg·L-1時，對水稻紋枯病、小麥白粉病、黃瓜靶斑病、黃瓜白粉病和玉米大斑病的抑制效果顯著，抑制率均在90%以上，但對番茄灰霉病、大豆銹病和玉米小斑病效果較差，抑制率在70%以上。

特比萘酚和鹽酸特比萘芬對皮膚真菌具有高效抗菌作用[14]。特比萘酚和鹽酸特比萘芬對抗皮膚癬菌的最低抑菌濃度(MIC)為0.005～0.5 mg·L-1，并且其MIC 與最低殺菌濃度(MFC)基本相同；對于雜色曲霉，特比萘芬對雜色曲霉的MIC 為0.01～2 mg·L-1，MFC 為0.02～4 mg·L-1[15-17]。本實(shí)驗(yàn)中特比萘酚和鹽酸特比萘芬對植物病原真菌的抑制效果與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

三唑類麥角甾醇生物合成抑制劑為農(nóng)用殺菌劑的優(yōu)秀代表，因其具有內(nèi)吸治療、高效、低毒、殺菌譜廣、抗藥性風(fēng)險低等特點(diǎn)，吸引眾多農(nóng)藥公司對其進(jìn)行研究和開發(fā)。特比萘酚是丙烯胺類抗真菌藥，作用機(jī)理是通過抑制真菌的角鯊烯環(huán)氧化酶，從而干擾麥角甾醇的生物合成，使真菌細(xì)胞內(nèi)角鯊烯過度堆積和麥角甾醇的合成受阻，最終起到殺菌或抑菌的作用[14]。特比萘酚并不影響細(xì)胞色素P450 酶系統(tǒng)，因此，并不影響人類激素和相關(guān)藥物代謝，對人體安全性高[18-19]。以上這些優(yōu)點(diǎn)對特比萘酚和鹽酸特比萘芬在農(nóng)藥安全性方面提供一定的理論支撐。

4 結(jié)論

特比萘酚和鹽酸特比萘酚對植物真菌病害的抑制效果良好，有的甚至高于現(xiàn)在正在使用的農(nóng)用商品化殺菌劑嘧菌酯和烯唑醇，且安全性較高，筆者建議拓展其在農(nóng)作物病害防治上的新用途，實(shí)現(xiàn)“老藥新用”。