蝦夷扇貝HSP90 基因克隆及組織表達(dá)分析

嚴(yán)俊麗，張廣明，吳 彪，孫秀俊，石 英，李學(xué)麗，王 強(qiáng)，劉建勝，孔垂民

（1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，山東濰坊 261000；2.濰坊海洋科技職業(yè)學(xué)院海洋生物學(xué)院，山東濰坊 261000；3.濰坊科技學(xué)院招生就業(yè)處，山東濰坊 261000；4.農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)試驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071）

蝦夷扇貝Mizuhopecten yessoensis 隸屬于軟體動(dòng)物門(mén)Mollusca、瓣鰓綱Lamellibranchia、翼形亞綱Pterimorphia、珍珠貝目Pterioida、扇貝科Pectinidae、蝦夷扇貝屬M(fèi)izuhopecten[1]。原產(chǎn)于俄羅斯千島群島南部、日本北海道和本州北部以及朝鮮半島東部海域，屬于冷水性雙殼貝類[2]。其肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，受到廣大養(yǎng)殖戶和消費(fèi)者一致好評(píng)[3]。自20 世紀(jì)80 年代從日本引入我國(guó)開(kāi)展人工育苗和增養(yǎng)殖以來(lái)，蝦夷扇貝迅速在我國(guó)黃海北部和山東半島北部部分沿海形成產(chǎn)業(yè)規(guī)模[4]。近年來(lái)，蝦夷扇貝夏季高溫死亡給養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)，一定程度上制約了我國(guó)扇貝養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[5]。探討蝦夷扇貝的高溫應(yīng)激機(jī)理，旨為解決高溫死亡問(wèn)題打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

熱休克蛋白（heat shock protein，HSPs）是高度保守的應(yīng)激蛋白，在生物體應(yīng)對(duì)高溫、缺氧、有機(jī)物污染和病原體侵染等環(huán)境脅迫時(shí)發(fā)生作用[6]。正常生理狀態(tài)下，HSPs 作為分子伴侶和不同的多肽鏈非特異性結(jié)合催化介導(dǎo)蛋白質(zhì)特定構(gòu)象的形成，表達(dá)量較少；出現(xiàn)環(huán)境脅迫時(shí)，其表達(dá)量激增幫助生物體免受傷害[7]。HSPs 家族種類較多，根據(jù)分子量大小分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40 和小分子熱休克蛋白等類型[8]。

HSP90 作為HSPs 家族中重要的成員之一，在多種生物體內(nèi)均有表達(dá)，除了行使分子伴侶的功能外，還參與機(jī)體信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期及免疫調(diào)節(jié)，對(duì)于維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要作用[9]。目前，HSP90 已成為細(xì)胞免疫、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及腫瘤研究的前沿課題。關(guān)于軟體動(dòng)物HSP90 的研究主要有：魁蚶Scapharca broughtonii[10]、三角帆蚌Hyriopsis cumingii[11]、獨(dú)角雪冰魚(yú)Chionodraco hamatus 和伯氏肩孔南極魚(yú)Trematomus bernacchii[12]、近江牡蠣Craassostrea hongkongensis[13]、厚殼貽貝Mytilus edulis[14]、海灣扇貝Argopecten irradians[15]。然而，關(guān)于蝦夷扇貝HSP90 基因（命名為MYHSP90）的相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)從蝦夷扇貝轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中鑒定出HSP90 基因的UniGene 序列，利用RACE 技術(shù)克隆了該基因的cDNA 全長(zhǎng)序列；分析其核酸、氨基酸序列及蛋白結(jié)構(gòu)；利用qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)分析其組織分布特點(diǎn)，以期為蝦夷扇貝的免疫研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

試驗(yàn)用蝦夷扇貝（殼長(zhǎng)70 mm 左右）取自青島市膠南海區(qū)，試驗(yàn)室條件下暫養(yǎng)充氣海水中1 周（20 ℃），每日換水2 次，期間投喂硅藻，試驗(yàn)前2 天停止投喂。

1.2 MYHSP90 基因全長(zhǎng)cDNA 的獲得

1.2.1 RNA 提取和cDNA 合成異硫氰酸胍法提取總RNA，詳細(xì)方法參照文獻(xiàn)[16]。1.2%瓊脂糖檢測(cè)總RNA 完整性，核酸分析儀BioPhotometer D30（Eppendorf）檢測(cè)RNA 的純度與濃度。

1.2.1.1 RACE 模板的制備

根據(jù)SMARTerTMRACE cDNAAmplication Kit 說(shuō)明書(shū)分別合成5’-RACE-Ready cDNA 和3’-RACEReady cDNA。

1.2.1.2 cDNA 克隆測(cè)序及序列分析

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室建立EST 轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，利用Primer primer 5.0 及Oligo 6.0 軟件設(shè)計(jì)RACE 特異性引物MYHSP90-F/R。RACE 擴(kuò)增體系為30 μL：cDNA 模板1 μL，dNTP Mixture（each 2.5 mmol·L-1）4 μL，MYHSP90-F 1 μL，MYHSP90-R 1 μL，10×LA PCR bufferⅡ（Mg2+Plus）3 μL，TaKaRa LA Taq（5 U·μL-1）0.3 μL，滅菌ddH2O 19.7 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃，1 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min；4 ℃保存。巢式PCR 利用NUP 和巢式引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用MiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit（TaKaRa）回收，膠回收產(chǎn)物與pMD18-T 連接，亞克隆至Escherich coli Top10 感受態(tài)細(xì)胞，并挑陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

序列分析DNAStar 軟件對(duì)cDNA 序列的開(kāi)放閱讀框進(jìn)行搜索、氨基酸預(yù)測(cè)；ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)HSP90 蛋白的分子量（Mw）及等電點(diǎn)pI；SignalIP 4.0Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)HSP90 蛋白N 端信號(hào)肽;SMART（http://www.expasy.ch/SMART）預(yù)測(cè)分析HSP90 蛋白功能域；BLASTp（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）在線對(duì)HSP90 核苷酸序列進(jìn)行同源檢索分析；MEGA 5.0 構(gòu)建基于不同物種HSP90 氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3 MYHSP90 組織分布

1.3.1 組織取樣

隨機(jī)取3 個(gè)個(gè)體，活體解剖取上外套膜、下外套膜、肝胰腺、大閉殼肌、小閉殼肌、斧足、鰓、性腺，立即置于液氮中，將同一組織混合研磨提取RNA。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

根據(jù)定量引物設(shè)計(jì)原則,Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)定量引物Q-F/R，選取β-actin 基因作為內(nèi)參基因[16]。qRT-PCR 擴(kuò)增（ABI 7500 PCR 儀）體系為：SYBRPremix EX Taq TM Ⅱ10 μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4 μL，Q-F/R 0.8 μL，cDNA 2 μL，滅菌ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，34 s，40個(gè)循環(huán)。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

得到的數(shù)據(jù)采用2-△△CT方法[17]進(jìn)行分析，獲得基因的相對(duì)表達(dá)量。采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)P＜0.05 為存在顯著性差異，P＜0.01 為存在極顯著性差異。

表1 MYHSP90 擴(kuò)增所用引物序列Tab.1 The primers used in the cloning of MYHSP90

2 結(jié)果

2.1 MYHSP90 基因的cDNA 序列分析

將擴(kuò)增并測(cè)序的5’-RACE、3’-RACE 序列及已知序列拼接后得到蝦夷扇貝的HSP90 基因的cDNA全長(zhǎng)序列，命名為MYHSP90（GenBankAccssion No.MW175520）。MYHSP90 基因的cDNA 全長(zhǎng)2 524 bp：開(kāi)放閱讀框（ORF）2 181 bp，5’-非編碼區(qū)（5’-UTR）67 bp，3’-非編碼區(qū)（3’-UTR）325bp。該基因編碼一個(gè)由726 個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，預(yù)測(cè)蛋白分子量為83.21 kDa，理論等電點(diǎn)pI 為4.81，具有5 個(gè)保守的HSP90 蛋白功能域家族序列標(biāo)簽：FLRELISNASSDALDKIR（260-311），LGTIAKSGT（450-475），IGQFGVGFYSAYLVAD（522-567），IKLYVRRVFI（1 203-1 229），GVVDSEDLPLNISRE（1 278-1 322）。結(jié)構(gòu)特征分析結(jié)果表明：該氨基酸序列無(wú)信號(hào)肽，也非線粒體靶向肽，無(wú)明顯的跨膜區(qū)域；該蛋白具有多個(gè)功能化位點(diǎn)，第233 位有表皮生長(zhǎng)因子受體磷酸化位點(diǎn)；第242 位有丙氨酸脫氫酶磷酸化位點(diǎn)；第393 位有絲氨酸蛋白酶磷酸化位點(diǎn)；第1 160 位有DNA 裂解酶鐵-硫結(jié)合結(jié)構(gòu)域磷酸化位點(diǎn)。C 末端存在保守的MEEVD多肽結(jié)構(gòu)。圖1 為MYHSP90 的預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)，圖2 為核苷酸序列和相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。

圖1 MYHSP90 預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.1 The modeled tertiary structures of MYHSP90

圖2 MYHSP90 核苷酸序列及相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列Fig.2 The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of MYHSP90

2.2 MYHSP90 同源性分析

在線BLASTp 同源性分析結(jié)果如圖3 所示，MYHSP90 編碼的氨基酸序列與其它物種編碼的氨基酸序列同源性很大。與櫛孔扇貝C.farreri 相似性最高，為92.3%，海灣扇貝A.irradiaas 為86.5%，縊蟶S.constricta 為81.9%，近江牡蠣C.hongkongensis 為79.9%，魁蚶S.broughtonii 為79.1%。

DNAman 8.0 對(duì)15 個(gè)物種的HSP90 的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，HSP90 的氨基酸序列高度保守，HSP90家族的5 個(gè)簽名序列和C 端的MEEVD 短肽序列也極其保守。

Mega 5.0 軟件以鄰位相接法（Neighbor-joining 法），構(gòu)建了HSP90 氨基酸的進(jìn)化樹(shù)，結(jié)構(gòu)如圖4 所示，在HSP90 分子進(jìn)化樹(shù)中可以看到脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物分為2 支，在無(wú)脊椎動(dòng)物中，MYHSP90 雙殼類HSP90 分子聚類后再與斧足類HSP90 聚在一起。

圖4 HSP90 的Neighbour-Joining 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 The phylogenetic tree of HSP90s

2.3 MYHSP90 基因的組織表達(dá)

qRT-PCR 檢測(cè)的組織分布結(jié)果顯示（圖5），MYHSP90 分布于蝦夷扇貝外套膜、肝胰腺、斧足、鰓、性腺中。性腺和肝胰腺中的基因表達(dá)量差異極顯著，且在各組織中表達(dá)量差異極顯著，其中在性腺中表達(dá)量最高，在性腺中表達(dá)量次之。

圖5 蝦夷扇貝MYHP90 的組織表達(dá)Fig.5 The tissue expression of MYHP90

3 討論

本文以蝦夷扇貝轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中注釋得到的Uni-Gene 為基礎(chǔ)，克隆得到HSP90 基因全長(zhǎng)序列，并分析其氨基酸序列。MYHSP90 基因全長(zhǎng)2 524 bp，ORF 為2 181 bp，編碼了726 個(gè)氨基酸?？繱.broughtonii 的HSP90 基因全長(zhǎng)2 707 bp，ORF 為2 187 bp，編碼了728 個(gè)氨基酸[16]。大黃魚(yú)HSP90 基因全長(zhǎng)2 715 bp，ORF為2 178 bp，編碼了725 個(gè)氨基酸[18]。獨(dú)角雪冰魚(yú)C.hamatus ORF 為2 184 bp，編碼了728 個(gè)氨基酸，尼羅羅非魚(yú)O.niloticus ORF 為2 175 bp，編碼了725 個(gè)氨基酸[12]。這表明海洋生物HSP90 基因大小相當(dāng)，氨基酸數(shù)量相差不大，氨基酸序列的保守性推測(cè)可能具有高等動(dòng)物HSP90 相同的功能和活性。

HSP90 作為真核生物體內(nèi)重要的分子伴侶，廣泛介導(dǎo)了脅迫信號(hào)的傳遞，在細(xì)胞免疫、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及抗腫瘤研究較多[19]。同時(shí)因其高度保守性，被廣泛應(yīng)用于分子進(jìn)化和分子系統(tǒng)學(xué)研究[20-21]，在極端的溫度適應(yīng)中也發(fā)揮著重要的作用[22-23]。溫度脅迫時(shí)，HSP90 表達(dá)量有明顯變化[24-25]。低溫（0.5 ℃）和高溫（25 ℃）分別脅迫中國(guó)大鯢A.davidianus，發(fā)現(xiàn)低溫時(shí)在腸道、胰腺和胃中HSP90 表達(dá)量下調(diào)，高溫時(shí)上調(diào)[26]。溫度脅迫刺參A.japonicus，HSP90 的表達(dá)量在不同組織中也呈現(xiàn)顯著性差異[27]。正常生理狀態(tài)下的蝦夷扇貝，HSP90 基因的表達(dá)具有組織特異性，在性腺、肝胰腺和鰓中表達(dá)量較高，且在性腺中的表達(dá)量明顯高于其它組織，這一結(jié)果和近江牡蠣C.hongkongensis 中的表達(dá)量相似[28]，推測(cè)產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因是HSP90 有阻斷凋亡酶激活因子Apaf-1寡聚糖化，阻斷凋亡體形成的作用[29]，而性腺中可溶性蛋白、多肽的種類較其他組織更為豐富[30-33]，推測(cè)在蝦夷扇貝體內(nèi)，性腺承擔(dān)了重要免疫器官的作用，可能參與了蛋白質(zhì)和酶類分子的合成、應(yīng)激反應(yīng)等過(guò)程。當(dāng)溫度脅迫三角帆蚌H.cumingii 時(shí)，HSP90 表達(dá)量最高的器官分別是肝胰腺和性腺，得到了類似的結(jié)果[11]。分析HSPs家族的其它基因在蝦夷扇貝的表達(dá)情況，正常溫度下HSP60 在肝胰腺和腎臟中表達(dá)量最高，升溫后在腎臟中表達(dá)量極顯著，而HSP70 在鰓組織中的表達(dá)量明顯高于閉殼肌和外套膜中[34]。關(guān)于HSPs 家族的成員在蝦夷扇貝的不同組織中呈差異性表達(dá)的原因，將在接下來(lái)的工作中進(jìn)一步研究。

熱脅迫對(duì)生物體的影響較大。日本三角渦蟲(chóng)Freshwater planarian dugesia japonica 由18 ℃升高至30 ℃，熱處理48 h，HSP70 表達(dá)量是對(duì)照組的2 倍[35]。溫度的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)對(duì)馬氏珠母貝鰓HSP70 基因表達(dá)量影響顯著[36]。熱脅迫下，機(jī)體的消化功能、免疫功能、生長(zhǎng)、行為、神經(jīng)內(nèi)分泌等方面受影響明顯，主要原因在于熱脅迫影響細(xì)胞內(nèi)自由基的穩(wěn)定性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體氧化損傷，從而引起脂肪、蛋白質(zhì)、糖類資源的重新整合[37]。高溫脅迫菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum，鰓中HSP90 基因表達(dá)量在6 h 達(dá)到最高表達(dá)量[38]。37 ℃熱激厚殼貽貝，肝胰腺和鰓中HSP70 基因表達(dá)量在2 h 即達(dá)到對(duì)照組的30 倍[14]。試驗(yàn)結(jié)果可為研究蝦夷扇貝HSP90 基因上調(diào)表達(dá)，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，以及探討因地理分布和異地增養(yǎng)殖的功能適應(yīng)提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究采用RACE 技術(shù)克隆獲得蝦夷扇貝熱休克蛋白90（HSP90）基因cDNA 全長(zhǎng)序列。并分析了核苷酸、氨基酸序列，蛋白結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)，并做了同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化研究。qRT-PCR 結(jié)果表明，MYHSP90基因在蝦夷扇貝8 種組織中均有表達(dá)，性腺中表達(dá)量最高，而閉殼肌中表達(dá)量最低。