直接多肽結(jié)合試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證

黎硯書 熊友文 徐麗瑛 肖小華

摘要：目的：本文旨在實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)化和建立直接多肽結(jié)合試驗(yàn)（DPRA）方法， 并在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)現(xiàn)對(duì)化學(xué)物可能引起皮膚致敏性的預(yù)測(cè)。方法：選擇五種已知皮膚致敏性化合物分別與半胱氨酸多肽和賴氨酸多肽在25℃暗處條件下共孵育24h，使用HPLC測(cè)定兩種特征多肽消耗百分率并依據(jù)DPRA預(yù)測(cè)模型判定受試物致敏性程度，再進(jìn)一步比較試驗(yàn)數(shù)據(jù)與OECD TG 442C指南參考結(jié)果。結(jié)果：DPRA準(zhǔn)確的劃分了五種受試物的致敏性。2，4-硝基氯苯和甲醛判定為極強(qiáng)致敏物，肉桂醛判定為中致敏物，正丁醇和6-甲基香豆素為非致敏物。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)室建立的DPRA 可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)單一化合物的皮膚致敏性及其程度，完成本實(shí)驗(yàn)室直接多肽結(jié)合試驗(yàn)的驗(yàn)證。

關(guān)鍵詞：直接多肽結(jié)合試驗(yàn);皮膚致敏;替代方法

【中圖分類號(hào)】R-1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1673-9026（2022）01--01

近年來，隨著致敏免疫分子研究體系的逐漸清晰和動(dòng)物福利原則的推行，建立體外評(píng)價(jià)化學(xué)物致敏性的方法就顯得尤為重要?；谟泻Y(jié)局通路（AOP）概念的提出，多種體外替代方法被嘗試并通過驗(yàn)證[1～2]。如DPRA[3]、人細(xì)胞系活化試驗(yàn)[4] 、角質(zhì)細(xì)胞ARE-Nrf2熒光素酶檢測(cè)方法[5]等。在皮膚致敏的發(fā)生過程中，化學(xué)物質(zhì)與皮膚蛋白質(zhì)的結(jié)合是一個(gè)關(guān)鍵步驟。大多數(shù)化學(xué)致敏原都具有親電性，能與氨基酸（半胱氨酸和賴氨酸）的親核中心共價(jià)結(jié)合[6]。DPRA就是基于該原理開發(fā)的一種體外化學(xué)分析方法。

1試驗(yàn)材料

1.1主要儀器

高相液相色譜儀（美國(guó)waters儀器公司）;色譜柱、保護(hù)柱（含柱芯）（安捷倫科技有限公司）;超微量電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）;電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2主要試劑

半胱氨酸多肽（Ac-RFAACAA-COOH，分子量751.9）、賴氨酸多肽（Ac-RFAAKAA-COOH，分子量776.2），購于南京萊昂生物科技有限公司;肉桂醛（上海麥克林生化科技有限公司）;2，4-二硝基氯苯（成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司）;甲醛（西隴化工股份有限公司）;正丁醇（西隴化工股份有限公司）;6-甲基香豆素（上海源葉生物科技有限公司）。

HPLC流動(dòng)相A：往500mL水中加入500uL三氟乙酸。HPLC流動(dòng)相B：往1L乙腈中加入850uL三氟乙酸。

2試驗(yàn)方法

2.1 樣品處理

分別將肉桂醛，2，4-二硝基氯苯，甲醛，正丁醇，6-甲基香豆素用乙腈配制成3mL 100mM的溶液作為儲(chǔ)備液。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

將半胱氨酸多肽和賴氨酸多肽分別配制標(biāo)準(zhǔn)品1（0.667mmol/L）、標(biāo)準(zhǔn)品2（0.267 mM）、標(biāo)準(zhǔn)品3（0.1335 mM）、標(biāo)準(zhǔn)品4（0.0667 mM）、標(biāo)準(zhǔn)品5（0.0334 mM）、標(biāo)準(zhǔn)品6（0.0167 mM），依次進(jìn)行高效液相色譜進(jìn)樣分析，用濃度與峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，此次試驗(yàn)我們半胱氨酸多肽和賴氨酸多肽的R 2均大于0.990。

2.3共孵育及HPLC進(jìn)樣

按下列表格（見表1）配制樣品，加樣于2mL進(jìn)樣瓶中，待充分混勻后再置于電熱恒溫培養(yǎng)箱中，25℃暗處條件下孵育24h。每個(gè)樣品組和對(duì)照組均配制三個(gè)平行樣。24h后將樣品組和對(duì)照組置于HPLC中進(jìn)行檢測(cè)分析。

2.4 HPLC條件

用50%流動(dòng)相A+50 %流動(dòng)相B在柱溫為30℃下平衡色譜柱2h，流量0.35mL/min。進(jìn)樣量為7uL，樣品溫度為25攝氏度。洗脫條件如下。

2.5數(shù)據(jù)處理

計(jì)算樣品和對(duì)照品的峰面積，根據(jù)峰面積計(jì)算多肽消耗率。

多肽消耗率=[1-（平行樣多肽峰面積均值/空白對(duì)照C多肽峰面積均值） ] ×100%

2.6預(yù)測(cè)模型

根據(jù)DPRA預(yù)測(cè)模型對(duì)受試物進(jìn)行判定[5]。當(dāng)受試物均不與兩種多肽共洗脫時(shí)，則計(jì)算兩種多肽消除率的均值，均值≤6.38%，反應(yīng)程度為無或較弱，為非致敏物;6.38%<均值≤22.62%，22.62%<均值≤42.47%，均值>42.47%，此3種情況均為致敏物，反應(yīng)程度分別為低、中、高。當(dāng)受試物與賴氨酸多肽發(fā)生共洗脫時(shí)，僅用半胱氨酸多肽消除率進(jìn)行判斷，非致敏物為消除率≤13.89%;13.89%<消除率≤23.09%，23.09%<消除率≤98.24%，消除率>98.24%，致敏物反應(yīng)程度分別為低、中、高。當(dāng)受試物與兩種多肽均發(fā)生共洗脫時(shí)，則無法判斷。

5、試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示（見表2），此5種物質(zhì)均不與兩種多肽發(fā)生共洗脫。肉桂醛、2，4-二硝基氯苯、甲醛的多肽消耗率均值分別為64.75%、59.6%、33.6%，根據(jù)DPRA預(yù)測(cè)模型均為致敏物，反應(yīng)程度分別為高、高、中。正丁醇、6-甲基香豆素多肽消耗率均值分別為0.4%、0.5%，根據(jù)DPRA預(yù)測(cè)模型均為非致敏物。五種受試物測(cè)試結(jié)果均與OECD TG 442C指南參考結(jié)果趨于一致。與體內(nèi)致敏潛能（LLNA數(shù)據(jù)）相比程度判定有2個(gè)不一樣，但判定致敏物和非致敏物分類一致。

6討論

傳統(tǒng)的化學(xué)物致敏性評(píng)價(jià)主要以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為主，而近年來出于對(duì)動(dòng)物保護(hù)的需求，使得建立可靠有效的皮膚致敏體外評(píng)價(jià)體系成當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。皮膚致敏的有害結(jié)局通路是從分子起始事件、關(guān)鍵事件到產(chǎn)生系統(tǒng)效應(yīng)的連續(xù)發(fā)生過程[7]。其分子起始事件是致敏原與皮膚蛋白發(fā)生結(jié)合反應(yīng)形成半抗原化合物。DPRA使用化學(xué)方法模擬致敏原與人工合成多肽（半胱氨酸肽和賴氨酸肽）結(jié)合，采用HPLC分析反應(yīng)液中多肽的損耗，以評(píng)估受試物的肽反應(yīng)性，從而評(píng)估化學(xué)物質(zhì)是否可能為皮膚致敏原。

本實(shí)驗(yàn)完成了在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)建立和驗(yàn)證DPRA方法，其驗(yàn)證結(jié)果與LLNA結(jié)果趨于一致。但在實(shí)驗(yàn)過程中仍出現(xiàn)過許多問題，如HPLC體系的干擾，樣品配制誤差，多肽降解，加樣量過少等。本實(shí)驗(yàn)由于實(shí)驗(yàn)室條件限制只驗(yàn)證了五種受試物的致敏性，在產(chǎn)品檢測(cè)應(yīng)用中還需要積累大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。

參考文獻(xiàn)：

[1]瞿小婷，程樹軍，秦瑤，等.有害結(jié)局通路指南及毒性測(cè)試應(yīng)用分析[J].日用化學(xué)品工業(yè)，2016，46（8）：473-478.

[2]陳彧，喻歡，程樹軍，等.基于有害結(jié)局通路原理的皮膚致敏測(cè)試替代方法進(jìn)展[J].日用化學(xué)品科學(xué)，2016，39（4）：4-9.

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[4]OECD.Test No.442D：In Vitro Skin Sensitisation：ARE-Nrf2 Luciferase Test Method[S].Organization for Economic cooperation and Development，Paris，2015.

[5]OECD.Test No.442E：In Vitro Skin Sensitisation：ARE-Nrf2 Luciferase Test Method[S].Organization for Economic cooperation and Development，Paris，2015.

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