大豆異黃酮對(duì)體外氧化應(yīng)激仔豬腸上皮細(xì)胞的影響及機(jī)制研究

胡勝蘭 肖 昊 王 麗 黃 琳 蔣宗勇

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，畜禽育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，廣東省畜禽育種與營(yíng)養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640)

仔豬出生后腸道發(fā)育非常迅速，但由于各種病原菌入侵、飼料發(fā)生霉變或氧化等可誘導(dǎo)新生仔豬腸道發(fā)生氧化應(yīng)激(oxidative stress)，從而影響仔豬消化吸收、生長(zhǎng)發(fā)育和抵抗病原菌入侵，并伴隨著機(jī)體免疫力的下降[1]。研究表明抗氧化劑在保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激損傷方面發(fā)揮重要作用，可有效地防御氧化應(yīng)激[2]。大豆異黃酮(soybean isoflavones，SI)是一類從大豆中提取的、具有多酚羥基結(jié)構(gòu)的生物活性物質(zhì)，主要分為游離型苷元和結(jié)合型糖苷兩大類。作為一種天然的植物雌激素，大豆異黃酮具有多種生理生化功能，目前被廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中。研究表明，大豆異黃酮能夠提高動(dòng)物機(jī)體的生長(zhǎng)性能，例如，泌乳母豬飼糧中添加大豆異黃酮可提高母豬泌乳性能，提高乳蛋白和乳脂含量，顯著提高哺乳仔豬生長(zhǎng)性能[3]；飼糧中添加適量大豆異黃酮可以提高肉雞的飼料轉(zhuǎn)化率[4]，提高蛋雞種蛋孵化率及蛋品質(zhì)[5-6]。由于大豆異黃酮可抑制自由基的產(chǎn)生并清除自由基，可誘導(dǎo)增強(qiáng)內(nèi)源抗氧化酶活性，近年來(lái)大豆異黃酮的抗氧化作用已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[7-9]。本課題組前期動(dòng)物試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，飼喂氧化魚油對(duì)新生仔豬腸道黏膜產(chǎn)生了氧化應(yīng)激，腸道絨毛受損，同時(shí)腸道的免疫細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)和白細(xì)胞介素-10(IL-10)等]和核因子-κB(NF-κB)含量產(chǎn)生了變化；添加大豆異黃酮提高了機(jī)體抗氧化能力，顯著緩解了腸道氧化應(yīng)激造成的損傷，同時(shí)降低了腸道黏膜的炎癥反應(yīng)[10]。氧化應(yīng)激條件下，大豆異黃酮是否參與調(diào)控細(xì)胞的免疫功能及相關(guān)信號(hào)通路目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，為了進(jìn)一步探討大豆異黃酮緩解豬腸上皮細(xì)胞氧化損傷的作用機(jī)理，本研究采用更貼近早期斷奶仔豬腸道生理狀態(tài)的仔豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-1為研究對(duì)象，利用FeSO4/H2O2建立體外氧化應(yīng)激模型，研究大豆異黃酮對(duì)體外氧化應(yīng)激仔豬腸上皮細(xì)胞免疫細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)及相關(guān)信號(hào)通路的影響，為大豆異黃酮的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大豆異黃酮為廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所研制，含量為98.5%。仔豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-1由美國(guó)德州農(nóng)工大學(xué)伍國(guó)耀教授惠贈(zèng)。DMEM/F12培養(yǎng)基由Gibco公司提供。MTT試劑盒購(gòu)自Sigma公司。乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-2、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D公司。誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)、NF-κB和抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗以及用于Western Blot試驗(yàn)的二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量試劑盒、裂解液和化學(xué)顯色試劑盒均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 試驗(yàn)分組與設(shè)計(jì)

用DMEM-F12培養(yǎng)基調(diào)整IPEC-1細(xì)胞濃度至約2×105個(gè)/mL，將細(xì)胞接種在6孔板上，37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，隨機(jī)分組并進(jìn)行如下處理：1)正常對(duì)照組，正常DMEM-F12培養(yǎng)基；2)氧化對(duì)照組，含400 μmol/L FeSO4/H2O2的DMEM-F12培養(yǎng)基，氧化處理2 h；3)不同濃度大豆異黃酮組，先按照氧化對(duì)照組的操作氧化處理2 h后，再分別添加含有不同濃度的大豆異黃酮完全培養(yǎng)基。每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)。

1.3 細(xì)胞增殖的測(cè)定

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且同代的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度后接種于96孔培養(yǎng)板，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)處理。培養(yǎng)基中加入400 μmol/L FeSO4/H2O2，氧化處理2 h后，更換含0～320 μmol/L大豆異黃酮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1、3、5 d后，每孔加入MTT染色液(5 g/L)25 μL，于37 ℃、5% CO2條件下孵育4 h后去掉上清，隨后加入100 μL Formazan溶解液，37 ℃繼續(xù)孵育3～4 h。處理完成后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)吸光度值。

1.4 細(xì)胞凋亡的測(cè)定

采用Annexin V熒光染色和流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。收集處理后的細(xì)胞2×106個(gè)，l mL預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1～2次。加入10 μL Annex V-FITC，混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，隨后加入300 μL Binding Buffer重懸，用于后續(xù)流式細(xì)胞儀測(cè)定和熒光顯微鏡觀察。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性與細(xì)胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

用不同濃度大豆異黃酮處理仔豬腸上皮細(xì)胞48 h后，取上清于-20 ℃保存，用于后續(xù)LDH活性的檢測(cè)。同時(shí)，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞，將其刮下后轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)，冰浴條件下超聲波破碎細(xì)胞，3 000 r/min離心5 min，取上清液-20 ℃凍存，根據(jù)南京建成生物工程研究所試劑盒說(shuō)明，采用比色法測(cè)定細(xì)胞中MDA、GSH-Px、還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、T-SOD、CAT、一氧化氮(NO)和iNOS的含量/活性。

1.6 細(xì)胞內(nèi)免疫細(xì)胞因子及免疫和氧化相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白含量的測(cè)定

細(xì)胞收集方法同1.5。采用ELISA試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)IL-1β、IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ含量，同時(shí)測(cè)定免疫和氧化相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白NF-κB、Jun N-末端蛋白激酶(JNK)、激活蛋白-1(AP-1)的含量/活性。

1.7 Western Blot

用含不同濃度大豆異黃酮的完全培養(yǎng)基處理細(xì)胞48 h后，去掉細(xì)胞培養(yǎng)上清，預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞后，加入120 μL細(xì)胞裂解緩沖液，14 000×g離心10 min，吸上清液。BCA蛋白定量法定量后，加入等體積上樣緩沖液，通過(guò)12%十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分離的蛋白用半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，室溫封閉1 h后分別加入1∶1 000稀釋的兔抗鼠iNOS和NF-κB p65一抗，4 ℃孵育過(guò)夜后用1∶1 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗兔IgG二抗室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參，重復(fù)3次。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS v8.2的GLM程序進(jìn)行方差分析，顯著水平為P<0.05，極顯著水平為P<0.01。數(shù)據(jù)采用最小均方平均值(LS mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。同時(shí)對(duì)氧化應(yīng)激條件下大豆異黃酮濃度進(jìn)行線性和二次回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆異黃酮對(duì)氧化應(yīng)激仔豬腸上皮細(xì)胞增殖的影響

圖1所示，經(jīng)過(guò)1、3和5 d的培養(yǎng)，氧化對(duì)照組細(xì)胞活性顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)，添加10～40 μmol/L大豆異黃酮顯著提高了氧化處理后的細(xì)胞活性(P<0.05)，但添加160～320 μmol/L的大豆異黃酮無(wú)法緩解氧化處理對(duì)細(xì)胞造成的損傷，結(jié)果顯示細(xì)胞活性較正常對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。

2.2 大豆異黃酮對(duì)氧化應(yīng)激仔豬腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的影響

如圖2所示，正常培養(yǎng)條件下，仔豬腸上皮細(xì)胞形態(tài)完整，規(guī)則的貼壁生長(zhǎng)(圖2-A)。經(jīng)過(guò)氧化處理后，仔豬腸上皮細(xì)胞嚴(yán)重收縮，大量細(xì)胞破裂溶解(圖2-B)。添加不同濃度的大豆異黃酮對(duì)氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞損傷具有不同程度的緩解作用，通過(guò)顯微鏡觀察，經(jīng)10～40 μmol/L的大豆異黃酮處理后，大部分細(xì)胞能夠保持完整形態(tài)，細(xì)胞破裂和收縮均有不同程度的緩解(圖2-C、圖2-D和圖2-E)，但隨著大豆異黃酮濃度的提高，160和320 μmol/L大豆異黃酮處理后，并未觀察到對(duì)細(xì)胞氧化損傷的緩解作用(圖2-G和圖2-H)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3同。Data columns with the same letters mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as Fig.3.圖1 大豆異黃酮對(duì)氧化應(yīng)激仔豬腸上皮細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of SI on proliferation of intestinal epithelial cells of piglets under oxidative stress

圖2 不同處理下仔豬腸上皮細(xì)胞的形態(tài)Fig.2 Morphology of intestinal epithelial cells of piglets after different treatments (200×)

2.3 大豆異黃酮對(duì)氧化應(yīng)激仔豬腸上皮細(xì)胞凋亡的影響

由表1可知，與正常對(duì)照組相比，氧化處理顯著提高了仔豬腸上皮細(xì)胞凋亡率和半胱天冬酶(Caspase)-3活性(P<0.05)。添加10、20、40和80 μmol/L的大豆異黃酮能顯著或極顯著緩解氧化處理引起的仔豬腸上皮細(xì)胞凋亡(P<0.05或P<0.01)，使其達(dá)到與正常對(duì)照組相當(dāng)?shù)乃?P>0.05)。添加不同濃度大豆異黃酮后，觀察到促進(jìn)凋亡的Caspase-3活性均在一定程度上低于氧化對(duì)照組(P>0.05)。由此可見(jiàn)，添加大豆異黃酮對(duì)氧化應(yīng)激引起的仔豬腸上皮細(xì)胞凋亡具有抑制作用，以10～20 μmol/L大豆異黃酮效果較佳。

表1 大豆異黃酮對(duì)氧化應(yīng)激仔豬腸上皮細(xì)胞凋亡的影響Table 1 Effects of SI on apoptosis of intestinal epithelial cells of piglets under oxidative stress

2.4 大豆異黃酮對(duì)氧化應(yīng)激仔豬腸上皮細(xì)胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)的影響

由表2可知，與正常對(duì)照組相比，氧化處理仔豬腸上皮細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)T-SOD活性顯著降低(P<0.05)，添加不同濃度大豆異黃酮后能在一定程度上提高T-SOD活性(P>0.05)。氧化處理后，細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)，添加10～80 μmol/L大豆異黃酮后MDA含量降低，但與氧化對(duì)照組和正常對(duì)照組均差異不顯著(P>0.05)。細(xì)胞內(nèi)GSH-Px和CAT活性、GSH含量和GSH/GSSG在各組之間差異不顯著(P>0.05)。

表2 大豆異黃酮對(duì)氧化應(yīng)激仔豬腸上皮細(xì)胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)的影響Table 2 Effects of SI on antioxidant indexes in intestinal epithelial cells of piglets under oxidative stress

2.5 大豆異黃酮對(duì)氧化應(yīng)激仔豬腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性的影響

由表3可得，氧化處理不會(huì)造成仔豬腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性的變化(P>0.05)，且不同濃度大豆異黃酮處理后也未觀察到各組之間的顯著差異(P>0.05)。

表3 大豆異黃酮對(duì)氧化應(yīng)激仔豬腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性的影響Table 3 Effects of SI on LDH activity in intestinal epithelial cells medium of piglets under oxidative stress U/L

2.6 大豆異黃酮對(duì)氧化應(yīng)激仔豬腸上皮細(xì)胞內(nèi)免疫細(xì)胞因子含量的影響

由表4可知，與正常對(duì)照組相比，氧化處理顯著提高了細(xì)胞內(nèi)IL-1β、IL-2和TNF-α的含量(P<0.05)；與氧化對(duì)照組相比，添加不同濃度大豆異黃酮后，未觀察到細(xì)胞內(nèi)IL-1β、IL-2和IL-4含量的顯著變化(P>0.05)。與正常對(duì)照組相比，氧化處理顯著提高了細(xì)胞內(nèi)TNF-α含量(P<0.05)，10～80 μmol/L大豆異黃酮組細(xì)胞內(nèi)TNF-α含量顯著低于氧化對(duì)照組(P<0.05)，與正常對(duì)照組則無(wú)顯著差異(P>0.05)。細(xì)胞內(nèi)IFN-γ含量在各組之間差異不顯著(P>0.05)。

表4 大豆異黃酮對(duì)氧化應(yīng)激仔豬腸上皮細(xì)胞內(nèi)免疫細(xì)胞因子含量的影響Table 4 Effects of SI on immunological cytokine contents in intestinal epithelial cells of piglets under oxidative stress

2.7 大豆異黃酮對(duì)氧化應(yīng)激仔豬腸上皮細(xì)胞內(nèi)免疫和氧化相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的影響

由表5可知，仔豬腸上皮細(xì)胞經(jīng)氧化處理后，氧化對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)NF-κB含量和JNK活性均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)，添加10～20 μmol/L大豆異黃酮后NF-κB含量與正常對(duì)照組和氧化對(duì)照組均差異不顯著(P>0.05)，而添加40～80 μmol/L大豆異黃酮后NF-κB含量與氧化對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)；10～40 μmol/L大豆異黃酮組細(xì)胞內(nèi)JNK活性顯著低于氧化對(duì)照組(P<0.05)，但80 μmol/L大豆異黃酮組JNK活性與氧化對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。細(xì)胞內(nèi)AP-1含量在各組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表5 大豆異黃酮對(duì)氧化應(yīng)激仔豬腸上皮細(xì)胞內(nèi)免疫和氧化相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的影響Table 5 Effects of SI on key proteins of signaling pathway-related immune and oxidation in intestinal epithelial cells of piglets under oxidative stress

2.8 大豆異黃酮對(duì)氧化應(yīng)激仔豬腸上皮細(xì)胞內(nèi)NO和iNOS含量的影響

由表6可得，氧化處理極顯著提高了細(xì)胞內(nèi)NO含量(P<0.01)；10～20 μmol/L大豆異黃酮組細(xì)胞內(nèi)NO含量顯著低于氧化對(duì)照組(P<0.05)，與正常對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。40～80 μmol/L大豆異黃酮組細(xì)胞內(nèi)NO含量極顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)，與氧化對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。氧化對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)iNOS含量顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)，10～40 μmol/L大豆異黃酮組細(xì)胞內(nèi)iNOS含量與氧化對(duì)照組和正常對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，80 μmol/L大豆異黃酮組細(xì)胞內(nèi)iNOS含量顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)。隨著大豆異黃酮濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)NO含量呈先下降后上升的變化趨勢(shì)。

表6 大豆異黃酮對(duì)氧化應(yīng)激仔豬腸上皮細(xì)胞內(nèi)NO和iNOS含量的影響Table 6 Effects of SI on NO and iNOS contents in intestinal epithelial cells of piglets under oxidative stress

2.9 大豆異黃酮對(duì)氧化應(yīng)激仔豬腸上皮細(xì)胞內(nèi)NF-κB和iNOS蛋白表達(dá)的影響

由圖3可知，與空白對(duì)照組相比，氧化處理顯著提高了細(xì)胞內(nèi)NF-κB和iNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。添加不同濃度大豆異黃酮后細(xì)胞內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)相對(duì)量顯著低于氧化對(duì)照組(P<0.05)；10～40 μmol/L大豆異黃酮處理均顯著降低了氧化處理誘導(dǎo)的iNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量的顯著提高(P<0.05)，然而80 μmol/L大豆異黃酮處理則顯著提高了該蛋白的相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。

圖3 大豆異黃酮對(duì)氧化應(yīng)激仔豬腸上皮細(xì)胞內(nèi)NF-κB和iNOS蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of SI on protein expression of NF-κB and iNOS in intestinal epithelial cells of piglets under oxidative stress

3 討 論

H2O2通過(guò)形成高活性的羥自由基引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，損傷生物膜的結(jié)構(gòu)和功能，從而造成腸上皮細(xì)胞的氧化損傷[10-11]。本試驗(yàn)以Fenton反應(yīng)(H2O2+Fe2+→Fe3++OH-+OH·)產(chǎn)生活性極強(qiáng)的羥自由基，構(gòu)建體外仔豬小腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，結(jié)果顯示，氧化處理顯著降低仔腸上皮細(xì)胞增殖率，使細(xì)胞內(nèi)MDA和GSSG含量上升，T-SOD活性降低，說(shuō)明體外氧化應(yīng)激模型降低細(xì)胞抗氧化能力，對(duì)仔豬腸上皮細(xì)胞具有損害作用，這與Racz等[12]的報(bào)道一致。加入10～40 μmol/L大豆異黃酮后細(xì)胞增殖率顯著高于氧化對(duì)照組，T-SOD活性上升，說(shuō)明適量的大豆異黃酮能有效緩解Fe2+/H2O2對(duì)仔豬腸上皮細(xì)胞的損害，提高細(xì)胞的抗氧化能力。但高劑量(80～320 μmol/L)大豆異黃酮?jiǎng)t表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞損傷的加重，并且觀察細(xì)胞形態(tài)也可看出，適量的大豆異黃酮能夠改善氧化處理后細(xì)胞的收縮狀態(tài)，高劑量大豆異黃酮?jiǎng)t無(wú)法緩解氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，該結(jié)果與Hsu等[13]的報(bào)道一致。本試驗(yàn)從細(xì)胞水平說(shuō)明了添加10～40 μmol/L大豆異黃酮對(duì)氧化應(yīng)激仔豬腸上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，但濃度提高到80～360 μmol/L則對(duì)細(xì)胞呈抑制作用。

細(xì)胞凋亡是生物體發(fā)育和組織平衡的重要機(jī)制[14]。細(xì)胞膜磷脂肽絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)向胞膜外是細(xì)胞凋亡的一種早期現(xiàn)象。Annexin V是一種鈣依賴磷脂結(jié)合蛋白(分子質(zhì)量35～36 ku)，對(duì)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外的PS有高度的親和性，所以利用FITC標(biāo)記的Annexin V染色，結(jié)合核酸染料(PI)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙染色，能夠更早地辯別凋亡細(xì)胞。Racz等[12]利用0.1 mol/L H2O2構(gòu)建雞內(nèi)耳細(xì)胞的氧化應(yīng)激模型，利用FITC標(biāo)記的Annexin V染色檢測(cè)出氧化應(yīng)激細(xì)胞中細(xì)胞凋亡增加，并且細(xì)胞中Caspase-3表達(dá)水平顯著提高。Xu等[15]利用H2O2和高劑量葡萄糖構(gòu)建人臍靜脈原代上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，培養(yǎng)基中添加大豆異黃酮后能緩解H2O2引起的臍靜脈上皮細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，氧化處理后細(xì)胞凋亡率顯著高于正常對(duì)照組，添加適量大豆異黃酮后細(xì)胞凋亡率顯著降低，細(xì)胞中Caspase-3的活性變化與細(xì)胞凋亡率的改變一致。因此，通過(guò)本試驗(yàn)的開(kāi)展，證實(shí)了大豆異黃酮能夠保護(hù)仔豬腸上皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡。

氧化應(yīng)激狀態(tài)下，腸上皮細(xì)胞可以分泌IL-1β、TNF-α等的一系列炎癥因子[16]。研究表明，炎癥因子的產(chǎn)生可直接造成腸上皮細(xì)胞損傷，減少緊密連接蛋白分泌，進(jìn)而導(dǎo)致腸屏障功能下降[17]。體外TNF-α的添加抑制上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白之一閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)的產(chǎn)生[18]。活性氧簇(ROS)引起氧化損傷細(xì)胞中TNF-α表達(dá)水平增加[19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，氧化處理顯著提高了細(xì)胞Th1型細(xì)胞因子(IL-1β、IL-2和TNF-α)的含量，而Th2型細(xì)胞因子(IL-4)的含量顯著低于正常對(duì)照組，添加適量大豆異黃酮后，Th1型細(xì)胞因子的含量顯著降低，IL-4的含量則顯著升高。本研究通過(guò)體外細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)仔豬腸上皮細(xì)胞Th1免疫反應(yīng)，添加大豆異黃酮能緩解仔豬腸上皮細(xì)胞的Th1免疫應(yīng)答，使細(xì)胞Th1/Th2系統(tǒng)趨于平衡。

正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的NF-κB以復(fù)合物的形式存在，當(dāng)細(xì)胞受到自由基的作用后，NF-κB將從復(fù)合物中解離并移動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而激活下游的基因表達(dá)，因此，測(cè)定NF-κB在細(xì)胞中的變化可直接反映細(xì)胞受自由基作用的程度[20-21]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，氧化對(duì)照組仔豬腸上皮細(xì)胞中NF-κB含量和JNK活性均顯著高于正常對(duì)照組，添加10～20 μmol/L大豆異黃酮后，NF-κB的表達(dá)受到抑制，10～40 μmol/L大豆異黃酮可以抑制JNK的活性，同時(shí)檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)Th1型細(xì)胞因子(IL-1β、IL-2和TNF-α)的含量降低，這與Wang等[22]的研究結(jié)果一致，結(jié)果提示大豆異黃酮的添加可能通過(guò)調(diào)控NF-κB的表達(dá)，從而影響Th1型細(xì)胞因子的分泌。此外，細(xì)胞內(nèi)NO對(duì)抗氧化和免疫都具有重要的作用。何姜等[23]研究表明，一氧化氮合酶抑制劑NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)能夠顯著抑制氧化劑第三丁基過(guò)氧化氫(t-BHP)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞NO表達(dá)上調(diào)。大豆異黃酮能夠通過(guò)下調(diào)NO的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[13]。本試驗(yàn)結(jié)果提示，氧化對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)NO和iNOS含量顯著高于正常對(duì)照組，添加適量的大豆異黃酮能夠降低NO和iNOS含量，但高濃度的大豆異黃酮?jiǎng)t促進(jìn)NO和iNOS的表達(dá)，說(shuō)明氧化應(yīng)激可引起腸上皮細(xì)胞損傷，適量濃度的大豆異黃酮可能通過(guò)NF-κB-iNOS-NO途徑緩解細(xì)胞的氧化損傷，與本課題組前期動(dòng)物試驗(yàn)[10]結(jié)論一致。

4 結(jié) 論

① 10～40 μmol/L大豆異黃酮能減輕氧化應(yīng)激對(duì)仔豬腸上皮細(xì)胞的損害，提高細(xì)胞的抗氧化能力，顯著降低細(xì)胞凋亡率。

② 大豆異黃酮可以抑制仔豬腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激時(shí)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，使腸道黏膜的Th1/Th2系統(tǒng)趨向于Th2型細(xì)胞因子分泌，抑制腸黏膜免疫的炎癥應(yīng)答。

③ 大豆異黃酮通過(guò)抑制NF-κB和JNK的產(chǎn)生，調(diào)控仔豬腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激信號(hào)通路。

④ 10～20 μmol/L大豆異黃酮對(duì)氧化應(yīng)激仔豬腸上皮細(xì)胞內(nèi)NO和iNOS的分泌有抑制作用。