反芻動物包被緩釋尿素飼料的研究進(jìn)展

田錦秀 鄭 楠 王加啟 趙圣國*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院(草業(yè)學(xué)院)，青島 266109)

隨著反芻動物養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，牛、羊等反芻動物對蛋白質(zhì)飼料的需求愈加旺盛，飼料資源短缺問題逐漸顯露。我國是世界上最大的大豆消費(fèi)國，2020年我國大豆進(jìn)口量達(dá)到創(chuàng)紀(jì)錄的1.003 3億t，進(jìn)口依存度高達(dá)87%，已成為我國養(yǎng)殖業(yè)“卡脖子”問題，嚴(yán)重制約我國反芻動物養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[1]。因此，迫切需要尋找可以替代豆粕的蛋白質(zhì)飼料。《飼料添加劑品種目錄(2013)》(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第2045號)文件中指出，可以在反芻動物飼料中添加的非蛋白氮有10種，分別為尿素、碳酸氫銨、硫酸銨、液氨、磷酸二氫銨、磷酸氫二銨、異丁叉二脲、磷酸脲、氯化銨、氨水，其中尿素是最常用的一種非蛋白氮。《飼料添加劑安全使用規(guī)范》(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第2625號)文件中明確，在配合飼料或全混合日糧中尿素的最高限量為1%(以干物質(zhì)含量88%為基礎(chǔ)計算)。歐洲食品安全局(European Food Safety Authority)2012年研究報告表明，飼料中添加1%尿素(干物質(zhì)基礎(chǔ))對動物而言是安全的，不會增加環(huán)境氮負(fù)荷，也不會對消費(fèi)者的安全產(chǎn)生任何影響[2]。尿素除了具有替代豆粕節(jié)約飼糧成本的作用之外，更重要的是尿素能促進(jìn)纖維分解菌生長、補(bǔ)充瘤胃氨氮不足、提高瘤胃微生物蛋白(MCP)合成[3]、壓縮飼糧配制空間用于提升能量原料含量，發(fā)揮重要的營養(yǎng)學(xué)功能。

尿素進(jìn)入瘤胃后能迅速被瘤胃內(nèi)脲酶水解為氨，繼而合成瘤胃MCP被機(jī)體利用，MCP是小腸可代謝蛋白質(zhì)的主要來源，占60%～85%。瘤胃內(nèi)脲酶的活性過強(qiáng)時，尿素水解速度大于利用速度，會導(dǎo)致微生物合成MCP所需的氨與降解氨數(shù)量不匹配，造成瘤胃內(nèi)氨的積累或者隨尿排出而污染環(huán)境。包被緩釋尿素是一種高效的非蛋白氮，飼喂后在瘤胃中能緩慢釋放氨，從而降低瘤胃內(nèi)氨的峰值濃度[4]，促進(jìn)能氮同步釋放，保證瘤胃微生物對氨的充分利用，從而減少氨的積累與浪費(fèi)。Kottegoda等[5]試驗證明，普通尿素氮在水中立即釋放，而包被尿素氮釋放緩慢。因此，為降低瘤胃內(nèi)尿素水解速度，最大限度提高微生物對氨的利用率，開發(fā)尿素緩釋技術(shù)尤為重要。尿素舔磚、膨潤土尿素、糊化淀粉尿素[6]等傳統(tǒng)緩釋尿素的緩釋效果不佳導(dǎo)致其在實際生產(chǎn)中應(yīng)用受影響。通過化學(xué)反應(yīng)制備尿素的化學(xué)衍生物用于尿素緩釋，如磷酸脲、雙縮脲、羥甲基尿素等[7]，其價格高，緩釋效果也不理想，甚至有的(比如雙縮脲)被禁止添加到飼料中。

1 尿素包被技術(shù)

包被緩釋尿素是以尿素作為飼料芯，用一層或多層特殊的包被材料包裹尿素而成。圖1為未包被和包被尿素的釋放模式以及雙層包被的緩釋尿素模型。常用的緩釋包被材料主要包括天然合成或人工合成的聚合物、生物復(fù)合材料(改性后的淀粉)以及黏土礦物的納米復(fù)合材料等，根據(jù)其釋放模型可分為包膜型緩釋和骨架型緩釋。

圖1 包被和未包被尿素樣品的氮釋放模式(a)和雙層包被緩釋尿素模型(b)Fig.1 Nitrogen release patterns of coated and uncoated urea samples (a) and double coated slow-release urea model (b)[11]

1.1 包膜型緩釋尿素

包膜型緩釋尿素外層一般為疏水性或低親水性的單層(或多層)的包衣材料，核芯為尿素。包膜材料一般為天然聚合物如淀粉、纖維素等。圖2為聚合物包被尿素的控釋擴(kuò)散機(jī)理[12]，水滲透進(jìn)包衣層溶解尿素，隨后溶解的尿素通過包衣層向外擴(kuò)散。在制作時也可向水不溶性包膜材料中加入致孔劑，尿素通過小孔向外釋放。Zhang等[11]使用乙基纖維素為內(nèi)包衣，改性淀粉為外包衣制作雙層包被尿素，改性淀粉作為第1道屏障，乙基纖維素作為第2道屏障，水分子首先通過改性淀粉滲透到層間空間，隨后，滲透的水分子進(jìn)入內(nèi)部疏水層乙基纖維素中，最終溶解內(nèi)部尿素芯，溶解的尿素透過雙層屏障得以釋放。

a：帶有聚合物涂層的尿素芯；b：水滲透到涂層和芯顆粒中；c：溶解和滲透壓升高；d：通過溶脹的涂層膜控制尿素釋放。a: urea core with polymer coating; b: water penetrates into the coating and core granule; c: fertilizer dissolution and osmotic pressure development; d: controlled release of urea through swollen coating membrane.圖2 控釋擴(kuò)散機(jī)理Fig.2 Mechanism of slowed-release diffusion of polymer coated urea[12]

1.2 骨架型緩釋尿素

骨架型緩釋尿素是將尿素包裹在特殊骨架材料中，或者是通過不同物質(zhì)分子間化學(xué)交聯(lián)形成具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的高分子聚合物，尿素通過骨架或者網(wǎng)絡(luò)中彎曲孔道得以溶解釋放。可作為骨架的材料較多，包括溶蝕性骨架材料如氫化植物油、蜂蠟、巴西棕櫚蠟等，親水性凝膠骨架材料如甲基纖維素、海藻酸鹽等，不溶性骨架材料如乙基纖維素，目前在生產(chǎn)中以氫化植物油使用最為普遍[13]。De Medeiros等[14]和Carvalho等[10]分別用巴西棕櫚蠟和蜂蠟對尿素進(jìn)行包封，所得骨架型緩釋尿素的包封率高并且有較好的尿素緩釋性能。通過不同分子間的交聯(lián)形成高聚物也能達(dá)到緩釋效果，例如，Sarkar等[15]采用聚乙二醇(PEG)和硫酸鈉為交聯(lián)劑，合成了生物相容性好、無毒、環(huán)境友好的聚乙烯醇(PVA)基高分子水凝膠，再加入尿素進(jìn)行改性，所制成的凝膠基質(zhì)同時具有緩釋尿素和高吸附Fe3+的潛力。

1.3 綜合型緩釋尿素

除單純的包膜型和骨架型緩釋尿素外，也可將二者相互結(jié)合，以包衣膜為外層，將骨架型結(jié)合尿素包裹在膜內(nèi)制成綜合型緩釋尿素。水分子依次通過包膜層、骨架進(jìn)入內(nèi)部溶解尿素，釋放時先通過骨架材料的內(nèi)部孔道滲透到層間，再通過疏水性或低親水性包膜材料最終釋出。綜合型緩釋尿素的釋放速率會比單層更加緩慢，當(dāng)一種包被方式的釋放速率難以達(dá)到某些要求時，綜合型緩釋尿素不失為一種更好的選擇。

2 天然聚合物包被材料

表1 天然聚合物包被的緩釋尿素Table 1 Slow-release urea coated with natural polymer

續(xù)表1緩釋包被材料Slow-release coating material作用效果Effect文獻(xiàn)Literature內(nèi)層卡拉膠+海藻酸鈉,外層卡拉膠、聚丙烯、硅藻土共聚物κ-carrageenan-sodium alginate and cross-linked κC-g-poly (acrylic acid)/celite superabsorbent 土壤中25 d釋放94.2%Wang等[25]環(huán)氧大豆油多元醇低聚物Epoxy soybean oil polyol oligomer水中7 d溶出率53.68%～64.76%張宇東等[26]

3 尿素緩釋效果的體外評價技術(shù)

制成的包膜型、骨架型緩釋尿素產(chǎn)品需要從體外對其一系列性能進(jìn)行評價，才能為進(jìn)一步的動物試驗提供可靠依據(jù)。評價指標(biāo)包括包被產(chǎn)率和效率，孔隙度、交聯(lián)密度和吸水率，微觀結(jié)構(gòu)，熱穩(wěn)定性，化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變，尿素釋放模式及其與能量釋放的同步性等。

3.1 包被產(chǎn)率和效率

通過對包被產(chǎn)率和效率進(jìn)行計算，可以評估包衣物質(zhì)是否適合做尿素的涂層材料。

包被產(chǎn)率取決于制備時加入的包衣材料、交聯(lián)劑、尿素等物質(zhì)的干重和最終產(chǎn)物的干重。

MY(%)=(Wfinal/Winitial)×100[10]。

式中：MY為包被產(chǎn)率；Wfinal為包被產(chǎn)品的干重;Winitial為制備時加入的包衣材料、交聯(lián)劑、尿素的干重。

包被效率可評價包衣材料的尿素保留能力，根據(jù)制備時尿素的加入量和加工后尿素的剩余量計算，公式如下：

ME(%)=(Ureal/Utheoretical)×100[10]。

式中：ME為包被效率；Ureal為存留尿素的實際含量；Utheoretical為插入的尿素含量。

3.2 孔隙度、交聯(lián)密度和吸水率

表征緩釋尿素的性能需要對其孔隙度、交聯(lián)密度和吸水率進(jìn)行測定?？紫抖仍叫?，交聯(lián)密度越高，尿素釋放時間就越長，二者呈負(fù)相關(guān)。而交聯(lián)密度越高，吸水性就越小，緩釋時間也會變長?？紫抖群臀拾凑杖缦鹿接嬎悖?/p>

ε(%)={[(Ww-Wd)/ρw]/[(Ww-Wd)/
ρw+Wd/ρp]}×100[27]。

式中：ε為孔隙度；Ww為包膜吸水后的濕重；Wd為包膜吸水前的干重；ρw為水的密度；ρp為緩釋包膜的密度。

吸水率(%)=[(W2-W1)/W1]×100[27]。

式中：W1為包膜未吸水前的干重；W2為包膜吸水后的重量。

交聯(lián)密度采用核磁共振交聯(lián)密度分析儀檢測。

3.3 微觀結(jié)構(gòu)

常用掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)觀察包被緩釋尿素的微觀結(jié)構(gòu)。SEM是一種用于高分辨率微區(qū)形貌分析的大型精密儀器。TEM可以看到小于0.2 μm的亞顯微結(jié)構(gòu)或超微結(jié)構(gòu)。通過SEM與TEM的圖像可以看到包膜涂層的數(shù)量、厚度等參數(shù)隨噴涂時間或其他工藝改變的變化情況，從而進(jìn)一步為分析尿素緩釋機(jī)制提供依據(jù)。Kottegoda等[5]制作出一種以羥基磷灰石為骨架的緩釋尿素產(chǎn)品，SEM和TEM圖像顯示為一個納米尺度的晶體結(jié)構(gòu)。Zhang等[11]對淀粉和酯化后的淀粉進(jìn)行了SEM分析，圖像中可以看到未酯化的天然淀粉顆粒飽滿，呈橢圓形或圓形，表面光滑沒有空隙，而酯化后的淀粉顆粒不規(guī)則，表面有凹痕裂紋，證明酯化反應(yīng)對淀粉的晶體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響。圖3為包膜緩釋尿素放大25倍的SEM顯微照片。

圖3 包膜緩釋尿素放大25倍的SEM顯微照片F(xiàn)ig.3 SEM micrograph of coated slow release urea at 25 times magnification[28]

3.4 熱穩(wěn)定性

熱重分析(TG)是在程序控制溫度下，測量物質(zhì)的質(zhì)量與溫度或時間的關(guān)系。差示掃描量熱法(DSC)是在程序升溫的條件下，測量試樣與參比物之間的能量差隨溫度變化的一種分析方法。這2種方法都是熱分析方法，可以用來檢測緩釋尿素產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性。Rahim等[21]采用殼聚糖與天然橡膠等制作了一種生物復(fù)合材料用于尿素緩釋，用TG分別對殼聚糖、天然橡膠和生物復(fù)合材料進(jìn)行比較，圖像顯示殼聚糖為兩步降解，而天然橡膠和生物復(fù)合材料均為單降解且降解溫度較高(圖4)，說明做成生物復(fù)合材料克服了殼聚糖溶解性低的缺點，從而提高了其作為緩釋尿素載體材料的熱穩(wěn)定性。De Medeiros等[14]采用DSC分析了巴西棕櫚蠟、尿素及其按照不同比例制成的緩釋尿素產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性，所有物質(zhì)只顯示出熔融的吸熱行為，棕櫚蠟的熔點為83.9 ℃，尿素的熔點為135.83℃，與分離的尿素相比，緩釋尿素產(chǎn)品中的尿素熔融溫度略有升高，這表明即使在熔融的情況下，巴西棕櫚蠟也能夠保護(hù)尿素，具有較好的熱穩(wěn)定性。

圖4 TG曲線(a)[21]與DSC曲線(b)Fig.4 TG curve (a)[21] and DSC curve (b)[14]

3.5 化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變

傅里葉紅外光譜(FTIR)能對樣品進(jìn)行定性定量的微觀分析，可以從圖像波數(shù)、強(qiáng)度等信息中推導(dǎo)出緩釋材料中化學(xué)鍵基團(tuán)的改變。Shi等[29]采用FTIR對所制成的顆粒狀生物炭-礦物尿素復(fù)合材料(Bio-MUC)進(jìn)行微觀分析，結(jié)果顯示，與母體生物炭(BC)相比，Bio-MUC光譜在較高和較低波數(shù)下均顯示出強(qiáng)度增加，Bio-MUC的N—H和/或O—H相關(guān)峰的強(qiáng)度更大(約3 500 cm-1)，尤其是在3 620 cm-1的峰伴隨著膨潤土和海泡石Al-OH和Mg-OH拉伸振動(圖5)，表明尿素和生物炭之間發(fā)生了反應(yīng)。在Dubey等[30]的FTIR分析中，以丙烯酸樹脂為黏結(jié)劑的沸石包膜尿素(UZ-AP)顯示出與丙烯酸聚合物和尿素相似的峰形，說明UZ-AP具有類似于尿素和沸石的表面功能。

圖5 Bio-MUC與BC的FTIRFig.5 FTIR of Bio-MUC and BC[29]

3.6 尿素釋放模式及其與能量釋放的同步性

制作緩、控釋產(chǎn)品，其相對生物利用度應(yīng)當(dāng)是普通常釋制劑的80%～120%，穩(wěn)態(tài)時的峰谷濃度之比(Cmax/Cmin)要低于普通制劑，并且整個緩釋時間不能比再次給予緩釋產(chǎn)品的間隔時間低，累計釋放率要高于90%以上[13]。不同包被材料的物理化學(xué)性質(zhì)不同，其尿素的釋放機(jī)制也會有所差別[31]。用零級動力學(xué)、一級動力學(xué)、Higuchi和Korsmeyer-Peppas等動力學(xué)模型擬合尿素釋放的動力學(xué)，得到速率常數(shù)和R2，用于研究和識別尿素的釋放機(jī)制。Silva[32]的擬合試驗結(jié)果表明，2種不同方法制作的納米雜化材料(SOD和SMW)釋放行為均符合Korsmeyer-Peppas模型，R2分別為0.99和0.99(圖6)，這表明尿素的釋放受到其通過二氧化硅納米顆?；|(zhì)的擴(kuò)散速率控制。同樣，Kottegoda等[5]用線性擬合方式對尿素和尿素與羥基磷灰石納米雜化物(U-HA)的釋放動力學(xué)進(jìn)行分析，根據(jù)R2，Higuchi模型最為合適，因此U-HA的釋放機(jī)制是尿素通過擴(kuò)散從均勻骨架中釋放。評價緩釋產(chǎn)品的釋放首先應(yīng)從釋放速率上評價，可以制作釋放率-時間曲線，引入合理的釋放“區(qū)間”，取3個時間點用于評價緩釋產(chǎn)品的釋放速率，讓3個時間點的釋放率分別滿足25%～45%、50%～70%、70%～90%，以此作為緩釋效果的參考指標(biāo)，評價所制備緩釋尿素的可適用性[13]。另外，還可以從能氮同步的角度出發(fā)，由于瘤胃微生物的生長依賴于能量供應(yīng)，維持瘤胃中氨的產(chǎn)生速度與碳水化合物的消化速度相協(xié)調(diào)非常重要。因此，需要從體外找到一個最佳的尿素釋放速率?？梢苑謩e向瘤胃液中加入預(yù)先設(shè)定不同釋放速率的尿素，例如，以1～10 mL/min遞加的速度釋放，5 mL/min恒定的速率度釋放，以及以10～1 mL/min遞減的速度釋放，或者前幾小時遞加后幾小時遞減等多種不同的釋放速率，釋放12 h。取釋放0、2、4、6、8、10、12 h的瘤胃液樣品，檢測不同釋放速率對瘤胃發(fā)酵和MCP合成的影響。通過這種方法，可以找到能促進(jìn)瘤胃發(fā)酵以及MCP合成的最大尿素釋放速率，作為緩釋效果評價的參考指標(biāo)。

圖6 比較尿素(A)、SOD(B)和SMW(C)的釋放行為(Ⅰ)以及SOD(Ⅱ)和SMW(Ⅲ)的Korsmeyer-Peppas模型的釋放動力學(xué)Fig.6 Comparison of release behavior of urea (A), SOD (B) and SMW (C) (Ⅰ) and release kinetics for Korsmeyer-Peppas model of SOD (Ⅱ) and SMW (Ⅲ)[32]

4 尿素緩釋效果的動物試驗評價

動物試驗是評價緩釋尿素產(chǎn)品作用效果最重要的部分。一般評價緩釋尿素產(chǎn)品在反芻動物養(yǎng)分消化率、瘤胃發(fā)酵、泌乳性能，生長性能等方面的影響。

4.1 對反芻動物養(yǎng)分消化率的影響

4.2 對反芻動物瘤胃發(fā)酵的影響

牛、羊等反芻動物與單胃動物相比，最大的區(qū)別就是反芻動物的瘤胃中棲息著大量的微生物，這些微生物一方面可以幫助反芻動物降解攝入的纖維性碳水化合物，生成能量物質(zhì)，如揮發(fā)性脂肪酸(VFA)；另一方面可以將攝取的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為MCP，被宿主動物吸收利用。開發(fā)緩釋尿素產(chǎn)品就是為了降低瘤胃內(nèi)氨態(tài)氮(NH3-N)的釋放速率，保持瘤胃微生物利用與NH3-N釋放的同步性，改善瘤胃發(fā)酵，促進(jìn)更多MCP的合成。Cherdthong等[19]采用體外培養(yǎng)技術(shù)，研究了不同尿素產(chǎn)品[尿素和尿素鈣混合物(UCM)]在不同能源(木薯片或玉米粉)條件下對瘤胃發(fā)酵的影響，在整個體外試驗中，使用尿素產(chǎn)生的NH3-N濃度最高，尿素鈣混合物與木薯片配合使用顯著降低瘤胃NH3-N濃度，其原因可能是尿素鈣混合物與尿素相比，NH3-N的釋放速率較慢，這與Gardinal等[33]的試驗結(jié)果一致。在Chegeni等[20]的試驗中，使用聚合物包膜尿素(PCU)能使瘤胃中的NH3-N濃度持續(xù)升高，飼喂后3 h達(dá)到最高水平，并持續(xù)到飼喂后7 h。在瘤胃發(fā)酵過程中，緩慢釋放尿素的飼糧可以延長微生物對額外氮源的利用。Cherdthong等[34]試驗證明，在高水平木薯片精料中添加U-Cal或U-Cas，除丙酸外，VFA的濃度和VFA的摩爾比均無顯著差異，肉牛瘤胃中的VFA總量不受緩釋尿素的影響，丙酸濃度的提高可能與該組較高的精料采食量有關(guān)，說明U-Cal或U-Cas不會對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生不利影響。

4.3 對反芻動物泌乳性能的影響

使用緩釋尿素能降低NH3-N的釋放速率，促進(jìn)MCP合成，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)化為牛奶的效率。Highstreet等[18]的研究中，在高可溶性粗蛋白質(zhì)飼糧中使用緩釋尿素Nitroshure替代尿素，結(jié)果表明，飼喂緩釋尿素Nitroshure可以增加泌乳早期高產(chǎn)奶牛乳中乳蛋白、能量、乳脂的含量，而飼喂等氮基礎(chǔ)的尿素對泌乳早期高產(chǎn)奶牛乳中乳蛋白、能量、乳脂的含量影響不大。與尿素相比，緩釋尿素的釋放速率較慢，這可能降低了瘤胃氨的峰值濃度，足以影響瘤胃中產(chǎn)生的VFA的分布，從而對乳脂合成等產(chǎn)生積極影響。Xin等[35]分別比較了飼喂飼料級尿素、聚氨酯包衣尿素和豆粕飼糧對奶牛泌乳性能的影響，與飼喂飼料級尿素飼糧相比，飼喂聚氨酯包衣尿素飼糧的奶牛乳中乳蛋白含量和產(chǎn)奶量較高，但與豆粕飼糧差異不大，因此，聚氨酯包被尿素可以在飼糧中部分替代豆粕[36]。此外，有試驗表明，通過使用玉米青貯或玉米粒中的干物質(zhì)填充緩釋尿素創(chuàng)造的飼糧配方空間，也可能改善了瘤胃的可發(fā)酵碳水化合物和能量狀態(tài)，從而提高乳中乳蛋白和乳脂的含量[17]。

4.4 對反芻動物生長性能的影響

5 存在的問題與展望

盡管近幾年緩釋包被尿素技術(shù)的研究越來越多，但仍有一些問題沒有解決。首先，包被材料過于單一，大多數(shù)以氫化植物油為基礎(chǔ)，未來需要挖掘價廉易得、安全性高、緩釋效果好的包被材料；其次，緩釋包被尿素產(chǎn)品的評價體系和標(biāo)準(zhǔn)仍為空白，尤其缺乏與瘤胃發(fā)酵、能氮同步、MCP合成等聯(lián)系起來的綜合評價技術(shù)。另外，緩釋包被尿素產(chǎn)品的效果還不穩(wěn)定，有的緩釋效果好，有的并沒有緩釋效果，主要是對瘤胃微生物脲酶分解尿素的機(jī)制尚不明確，因此，篩選適當(dāng)?shù)奶烊话踩忈尣牧?、建立緩釋尿素評價標(biāo)準(zhǔn)、揭示脲酶分解尿素機(jī)制，是未來緩釋尿素研究的重要內(nèi)容，將有助于新型緩釋尿素產(chǎn)品的開發(fā)，提高尿素利用率，支撐反芻動物健康養(yǎng)殖。