保育期仔豬盲腸微生物菌群多樣性分析

田博雅，馬億珈，奚夢瑤，路 暢，楊 陽，蔡春波，趙 燕，高鵬飛

（山西農(nóng)業(yè)大學動物科學學院 030801）

腸道微生物是指動物腸道中存在的數(shù)量龐大，種類繁多，功能多樣的微生物，其有利于維持宿主腸道微生態(tài)平衡，在營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收中起著關(guān)鍵作用[1-2]。它們大部分與機體細胞密切接觸，交換能量物質(zhì)，傳遞信息。Filippo等人的研究發(fā)現(xiàn)宿主飲食習慣會對腸道微生物菌群的組成產(chǎn)生深遠影響[3]。左斌等人在探討影響仔豬腸道微生物早期定植的因素的研究中發(fā)現(xiàn)，仔豬生命早期建立良好的腸道菌群不僅有利于仔豬前期的健康生長，而且對后期的生長育肥也具有重要影響[4]。這些年來，越來越多的研究表明腸道菌群與宿主健康之間存在密切聯(lián)系。顏桂花等人的研究發(fā)現(xiàn)，在仔豬日糧中添加可溶性玉米纖維可以改變仔豬盲腸內(nèi)微生物多樣性，從而提高盲腸內(nèi)有機酸濃度，降低腸道滲透性，改善仔豬腸道健康[5]。丁酸梭菌作為一種新型的抗生素替代品，可以促進仔豬腸道的生長發(fā)育和消化吸收，提高腸道中有益菌群的數(shù)量和腸道的屏障功能[6,7]。

仔豬腸道健康對于自身后期生產(chǎn)性能的發(fā)揮至關(guān)重要。本試驗以山西省地方優(yōu)勢豬種馬身豬、大白豬、山西黑豬和晉汾白豬為研究對象，采用16s測序技術(shù)對仔豬階段盲腸微生物多樣性進行檢測，分析不同豬品種盲腸微生物特性，擬探尋仔豬保育期盲腸微生物的變化規(guī)律，為仔豬保育提供理論參考。

1 材料與分析

1.1 試驗動物與樣品采集

按照行業(yè)飼養(yǎng)標準，統(tǒng)一將試驗動物飼養(yǎng)于大同市（中國山西?。┓N豬場，試驗動物組建時選擇日齡一致，體重相近的馬身豬、山西黑豬、大白豬和晉汾白豬四個品種的仔豬進行試驗。在仔豬斷奶末期（28d）和保育末期（70d）進行屠宰，每個品種仔豬各取3頭，屠宰前禁食8h，但可自由飲水，采集盲腸段的內(nèi)容物置于凍存管于液氮中保存，每個采樣點的樣品隨機抽取3份進性16S rRNA測序分析。

1.2 樣本DNA抽提與16S rRNA測序

腸道內(nèi)容物DNA的提取采用北京天根生物科技有限公司產(chǎn)品DNA提取試劑盒進行，并檢測其DNA純度，濃度及質(zhì)量。根據(jù)細菌V 3-V 4可變區(qū)進行引物設計，引物序列：341 F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806 R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）,進行PCR擴增。擴增程序：95 ℃預變形3 min；27個循環(huán)（95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s）；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統(tǒng)進行定量檢測。樣品在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司Miseq PE 300平臺進行檢測。序列數(shù)據(jù)根據(jù)PE reads之間的重疊關(guān)系，使用FLASH軟件進行拼接，采用Trimmomatic軟件對拼接質(zhì)量進行質(zhì)控過濾及數(shù)據(jù)優(yōu)化。

1.3 OTU菌群聚類分析

對優(yōu)化序列提取非重復序列，便于降低分析中間過程冗余計算量，然后去除沒有重復的單序列，而后再按照97%相似性對非重復序列進行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列，最后對所得OTU進行不同分類學水平的注釋，生成OTU分析結(jié)果。使用97%相似度的OTU，利用Mothur做Rarefaction分析，利用R Studio（v.3.0.2）工具制作Shannon和Chao指數(shù)上的稀釋曲線圖。

1.4 菌群多樣性分析

利用R語言工具做出不同分組在門和屬水平上的群落豐度組成圖（群落Bar圖）。采用Mothur（v.1.34.0）軟件進行菌群Alpha多樣性分析，計算不同隨機抽樣下微生物群落的多樣性和豐富度，分別選擇Sobs指數(shù)，Heip指數(shù)指數(shù)和Simpson指數(shù)進行分析。采用PCoA分析（Principal co-ordinates analysis），即主坐標分析，用來研究樣本群落組成的相似性或差異性。利用R語言對一系列特征值和特征向量進行排序，然后選擇排在前幾位的最主要特征值，最后將其表現(xiàn)在坐標系里。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Excel軟件對OTU數(shù)據(jù)進行基礎(chǔ)分析處理，同一品種不同日齡間采用T檢驗分析，不同品種同一日齡間采用單因素方差分析，選用SSR法進行組間比較，0.05和0.01為顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 OTU聚類分析

16S rRNA測序結(jié)果經(jīng)過濾質(zhì)控之后獲得了648216條序列，共獲得888個OTU，每個樣品平均獲得393個OTU。

2.2 稀釋曲線分析

利用Mothur做Rarefaction分析后得到稀釋曲線，圖 1中分別呈現(xiàn)了Shannon和Chao指數(shù)稀釋曲線，可見稀釋曲線均達到了平臺期，包含了樣本中絕大多數(shù)微生物多樣性的樣本信息，說明試驗數(shù)據(jù)符合條件。

圖1 稀釋曲線分析結(jié)果

2.3 Alpha多樣性分析

Sobs指數(shù)可以用來描述群落豐富度的實際觀測值。由Sobs指數(shù)圖（圖 2A）可知，在28日齡時，大白豬盲腸腸道微生物豐富度最高，馬身豬最低；在70日齡時，大白豬盲腸腸道微生物豐富度最高，晉汾白豬最低。在整個保育期，大白豬的盲腸腸道微生物豐富度都是最高的。隨著仔豬生長發(fā)育，大白豬，晉汾白豬和山西黑豬的盲腸腸道微生物豐富度逐漸降低，而馬身豬逐漸升高。

Heip指數(shù)是用來描述Heip群落均勻度的指數(shù)。由Heip指數(shù)圖（圖 2B）可知，在28日齡時，晉汾白豬盲腸腸道微生物均勻度最差，其他三個品種較為一致；在70日齡與28日齡相反，大白豬盲腸腸道微生物均勻度最差，山西黑豬和晉汾白豬次之，馬身豬最低。隨著仔豬生長發(fā)育菌群均勻度均發(fā)生顯著變化，馬身豬均勻度升高但變化不顯著，而大白豬變化最大，菌群發(fā)生較大變化。

Simpson指數(shù)是用來估算樣本中微生物多樣性的指數(shù)，在生態(tài)學中常用來定量描述一個區(qū)域的生物多樣性。由Simpson指數(shù)圖（圖 2C）可知，在28日齡時，晉汾白豬盲腸微生物多樣性最高，馬身豬最低；在70日齡時，馬身豬盲腸微生物多樣性最高，大白豬最低。隨著仔豬生長發(fā)育，大白豬，晉汾白豬和山西黑豬的盲腸微生物多樣性逐漸降低，而馬身豬逐漸升高。

圖2 Sobs指數(shù)圖(A) Heip指數(shù)圖(B) Simpson指數(shù)圖(C)

Alpha多樣性結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，Sobs和Simpson指數(shù)的變化趨勢基本一致，大白豬，晉汾白豬和山西黑豬隨著日齡增長逐漸降低，馬身豬逐漸升高。而在Heip指數(shù)中，隨著日齡增長，大白豬，晉汾白豬和馬身豬逐漸降低，山西黑豬逐漸上升。

2.4 Beta多樣性分析

PCoA分析是一種對數(shù)據(jù)進行簡化分析的技術(shù)，可以有效的找出數(shù)據(jù)中最“主要”的元素和結(jié)構(gòu)，用來研究樣本群落組成的相似性和差異性?；诩訖?quán)UniFrac距離進行的PCoA分析的結(jié)果，在屬水平分析發(fā)現(xiàn)，大白豬仔豬的盲腸微生物菌群在保育期（28～70日齡）較為集中，而其余品種仔豬的盲腸微生物菌群分布在不同區(qū)域。在相同的日齡上，不同品種樣本都能完全區(qū)分，差異很顯著（圖 3）。在28日齡時，四個品種樣本都處于一、三象限；而在70日齡時，不同品種之間分布比較分散，一、三、四象限都有，差異比較顯著。

圖3 PCoA分析圖

X軸和Y軸表示兩個選定的主坐標軸；X軸和Y軸的刻度是相對距離，無實際意義；不同顏色或形狀的點代表不同分組的樣本，兩樣本點越接近，表明兩樣本物種組成越相似。

2.5 群落組成分析

分類學分析結(jié)果表明，微生物菌群分布于17個門（圖4），四個品種的盲腸腸道微生物優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門（Firmicutes），其中70日齡的晉汾白豬和28日齡的馬身豬中微生物群落豐度僅次于厚壁菌門的是變形菌門（Proteobacteria），所占比例分別為32.9%和19.6%；其余分組中微生物群落豐度僅次于厚壁菌門的是擬桿菌門（Bacteroidetes)。隨著日齡增加，大白豬和山西黑豬仔豬盲腸中的厚壁菌門豐度呈逐漸升高的趨勢，而晉汾白豬和馬身豬仔豬盲腸中的厚壁菌門均是呈逐漸降低的趨勢。晉汾白豬仔豬在28日齡時盲腸中的厚壁菌門所占比重為73.3%，顯著高于（P＜0.05）其他相同日齡的品種。山西黑豬仔豬在28日齡時盲腸中的厚壁菌門的占比最少，為26.8%，而在70日齡時，山西黑豬仔豬盲腸中厚壁菌門所占比例顯著高于其他品種，為70.3%，并且擬桿菌門在山西黑豬仔豬保育期所占的比例下降最為迅速，從69.4%降到6.7%。馬身豬仔豬的盲腸中擬桿菌門所占的比例是隨著仔豬的生長發(fā)育逐漸升高，而在大白豬、山西黑豬和晉汾白豬中都是隨著仔豬生長發(fā)育逐漸降低。

圖4 門水平上樣本的群落豐度組成圖

進一步分析17個門中包含的257個屬（圖 5）。在菌屬水平分析發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、普雷沃氏菌屬（Prevotellaceae_NK3B31_group）、大腸志賀氏桿菌屬（Escherichia_Sh-igella），狹義梭狀芽孢桿菌屬（Clostrid-ium sensu stricto 1）為所有分組中的優(yōu)勢菌屬，在馬身豬保育期盲腸微生物中這四種菌屬所占比例分別為13.2%，7.1%，9.6%，1.7%；在山西黑豬中所占比例分別為1.6%，4.6%，6.2%，4.0%；在大白豬中所占比例分別為0.9%，16.9%，5.6%，4.1%；在晉汾白豬中所占比列分別為16.8%，1.9%，9.6%，9.3%。馬身豬在28日齡的優(yōu)勢菌屬為大腸志賀氏桿菌屬，在70日齡的優(yōu)勢菌屬為乳酸桿菌屬；山西黑豬在28日齡的優(yōu)勢菌屬為擬桿菌屬（Bacteroiders），在70日齡的優(yōu)勢菌屬為Subdoligranulum；晉汾白豬在28日齡的優(yōu)勢菌屬為乳酸桿菌屬，在70日齡的優(yōu)勢菌屬為擬桿菌屬；大白豬在28日齡和70日齡的優(yōu)勢菌屬都為普雷沃氏菌屬。隨著仔豬生長發(fā)育，在保育前期乳酸菌比例較高，在保育后期普雷沃氏菌屬豐度逐漸升高。

圖5 屬水平上樣本的群落豐度組成圖

3 討論

仔豬的健康生長需要一個平衡的腸道微生態(tài)環(huán)境。新生仔豬從母體及分娩環(huán)境中獲得胃腸道菌群并以此形成較為穩(wěn)定的微生態(tài)環(huán)境。健康的腸道菌群具有促進豬的營養(yǎng)代謝，調(diào)節(jié)免疫應答，抑制病原感染等功能[8,9]。本研究結(jié)果表明，馬身豬、山西黑豬和大白豬在保育期（28～70d）腸道微生物多樣性雖然處于一個動態(tài)變化范圍，但差異不顯著（P ＞ 0.05）。而晉汾白豬仔豬在保育期的微生物多樣性發(fā)生較大變化（P＜ 0.05），說明不同品種間腸道微生物的發(fā)展與成熟有著顯著的差異。隨著日齡增長，馬身豬的盲腸腸道微生物多樣性逐漸升高但變化范圍不大，山西黑豬、晉汾白豬和大白豬品種不同時間點豐度范圍變化較大，而且大白豬變化最大，說明我國地方豬品種腸道微生物較為穩(wěn)定，推測可能與馬身豬較高的抗逆性能有關(guān)。

研究表明腸道變形菌門能夠反映微生態(tài)失調(diào)或不穩(wěn)定，在某些腸道環(huán)境下，他們會成為可引發(fā)炎癥的腸道微生物，動物易出現(xiàn)代謝疾病和生殖障礙[10]。本研究發(fā)現(xiàn)70日齡的晉汾白豬腸道內(nèi)變形菌門的數(shù)量顯著上升，而其他品種中變形菌門的豐度并不高，提示應該加強對晉汾白豬仔豬保育工作，保證仔豬腸道健康。擬桿菌為革蘭氏陰性菌，是形態(tài)一致或多形態(tài)的專性厭氧桿菌，與其他菌群及宿主之間有著復雜的聯(lián)系，是條件致病菌，與宿主健康有著緊密的聯(lián)系[11]。

近年來普雷沃氏菌屬獲得了越來越多的關(guān)注，因為他能夠降解廣譜的植物多糖[12]，周波蘭等人的研究表明普雷沃氏菌屬豐度升高會促進腸道消化碳水化合物和膳食纖維，從而有利于維持腸道菌群穩(wěn)定，增強免疫功能[13]。普雷沃氏菌屬還可以分解引發(fā)腸道疼痛的黏腸液。而本試驗中晉汾白豬在整個保育期內(nèi)普雷沃氏菌屬的豐度處于較高水平，說明其對碳水化合物的消化能力強。

4 結(jié)論

本研究對馬身豬、山西黑豬、大白豬和晉汾白豬四個品種的仔豬保育階段腸道微生物多樣性進行分析，發(fā)現(xiàn)不同品種仔豬的盲腸微生物多樣性具有一定顯著差異。厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門是此階段的優(yōu)勢菌門，乳酸桿菌在保育前期處于較高水平，普雷沃氏菌屬在保育后期豐度逐漸升高。本研究結(jié)果可為探析腸道微生態(tài)對仔豬生長發(fā)育的作用機制提供參考。