維生素C對(duì)白斑綜合征病毒(WSSV)侵染后紅螯光殼螯蝦血淋巴免疫機(jī)能的影響

左迪，劉小杰，吳東蕾，劉志權(quán)，張?jiān)骑w，馬長安*

(1.上海城建職業(yè)學(xué)院 健康與社會(huì)關(guān)懷學(xué)院，上海 201415；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，上海 201403；3.華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200062；4.上?？萍拣^ 上海自然博物館,自然史研究中心，上海 200041)

紅螯光殼螯蝦Cheraxquadricarinatus原產(chǎn)于澳大利亞，具有個(gè)體大、產(chǎn)量?jī)?yōu)、生長快、適應(yīng)性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)成本低等養(yǎng)殖優(yōu)勢(shì)，在世界范圍內(nèi)廣泛養(yǎng)殖并具有廣闊的市場(chǎng)前景[1]。自2004年開始，江蘇、浙江等養(yǎng)殖區(qū)域均出現(xiàn)紅螯光殼螯蝦感染白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)后大量死亡的現(xiàn)象，嚴(yán)重制約蝦類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[2]。血細(xì)胞是螯蝦主要的免疫細(xì)胞，而血淋巴中存在很多免疫因子，如溶血素、凝集素、抗菌肽等，在保護(hù)宿主免受病原微生物侵害中起著重要的作用。而蝦類等水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物在集約化養(yǎng)殖條件下，面臨大量的應(yīng)激，如環(huán)境、營養(yǎng)和代謝等，這些容易導(dǎo)致蝦類自身免疫力降低從而誘發(fā)疾病。研究表明，免疫系統(tǒng)的功能和蝦體的營養(yǎng)狀態(tài)密切相關(guān)，營養(yǎng)物質(zhì)與水產(chǎn)動(dòng)物的免疫因子有直接聯(lián)系和相互作用，通過添加營養(yǎng)素來調(diào)控蝦類養(yǎng)殖動(dòng)物的營養(yǎng)狀態(tài)與免疫機(jī)能已成為研究熱點(diǎn)，有關(guān)蝦類營養(yǎng)免疫學(xué)的研究也受到學(xué)者們的關(guān)注[3]。

蝦類不能自身合成維生素或者合成量很少，難以滿足機(jī)體所需，故需要從飼料中獲得。維生素C(VC)具有抗氧化、抗自由基等多方面的功能，同時(shí)還起著增強(qiáng)免疫力的作用[4]。對(duì)南美白對(duì)蝦Litopenaeusvannamei的研究發(fā)現(xiàn)，VC能緩解對(duì)蝦的應(yīng)激狀態(tài)[5]；飼料中添加VC，克氏原螯蝦Procambarusclarkia血清酚氧化酶、溶菌酶、酸性磷酸酶活性可顯著增強(qiáng)，同時(shí)血細(xì)胞總數(shù)及血細(xì)胞呼吸爆發(fā)率也有所提升，VC添加組對(duì)WSSV侵染后的抵抗性也較對(duì)照組有所增強(qiáng)[6]；飼料中未添加VC或過量添加VC均會(huì)導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦Penaeusvannamei血清中酚氧化酶活力、血細(xì)胞總數(shù)及溶菌酶活性的降低[7]；VC可顯著提高中國明對(duì)蝦Fenneropenaeuschinensis幼蝦溶菌酶、酸性磷酸酶及過氧化氫酶等免疫酶活性，適量的VC可增強(qiáng)對(duì)蝦對(duì)副溶血弧菌Vibrioparahaemolyticus的抑菌活性，同時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus的抵抗力也有所增強(qiáng)[8]。

通過在飼料中添加蝦類生長發(fā)育中必需的營養(yǎng)物質(zhì)來增強(qiáng)養(yǎng)殖動(dòng)物機(jī)體免疫機(jī)能，不僅可以避免藥物治療的弊端，還能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病毒的抵御力[9]，這對(duì)紅螯光殼螯蝦的大規(guī)模健康養(yǎng)殖具有重要意義。本研究中，利用酶化學(xué)、分子生物學(xué)等方法，研究了WSSV侵染前后，VC對(duì)紅螯光殼螯蝦血淋巴免疫因子及C-lectin基因表達(dá)量的影響，探究VC對(duì)紅螯光殼螯蝦免疫性能的作用，以期為螯蝦的健康養(yǎng)殖及豐富螯蝦的營養(yǎng)免疫學(xué)資料提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用健康紅螯光殼螯蝦購自上海市金山區(qū)漕涇特種水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，挑選規(guī)格相近、肢體健全、富有活力的成蝦用于正式的養(yǎng)殖試驗(yàn)，試驗(yàn)蝦初始體質(zhì)量為(20.31±2.09)g，體長為(19.88±3.17)cm，共224只。

試驗(yàn)用小鼠(C57/BL6)為華東師范大學(xué)生物醫(yī)學(xué)系惠贈(zèng)，每天定時(shí)定量投喂清水和鼠糧。

包膜VC購自上海捷貝斯生物有限公司，VC含量92%，白色微粒。

WSSV病樣來源于江蘇省某紅螯光殼螯蝦養(yǎng)殖基地，由浙江省淡水水產(chǎn)研究所魚類免疫與健康重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室分離鑒定和保存。將感染后的病蝦(PCR 檢測(cè)WSSV為中國大陸株，呈強(qiáng)陽性)血淋巴等組織按體積比1∶10加入無菌生理鹽水后勻漿，-18 ℃下過夜，解凍后在4 ℃下以6 000 r/min離心5 min，然后以10 000 r/min 離心10 min，經(jīng)微孔濾膜(網(wǎng)目0.22 μm)過濾，所得液體即為WSSV懸液，-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 飼料的配制 以酪蛋白提供蛋白源，阿拉斯加天然魚油和豆油(二者體積比為2∶3)提供脂肪源，配制7組試驗(yàn)飼料?；A(chǔ)飼料中包含魚油20 g/kg、豆油30 g/kg、明膠115 g/kg、多維20 g/kg、多礦30 g/kg、膽固醇5 g/kg、酪蛋白450 g/kg、甜菜堿5 g/kg、氯化膽堿5 g/kg和玉米淀粉255 g/kg，在基礎(chǔ)料中分別添加0(對(duì)照)、100、200、400、800、1 600、3 200 mg/kg的包膜VC，根據(jù)等重替代原則，利用微晶纖維素進(jìn)行調(diào)節(jié)。將基礎(chǔ)飼料所需的原料，粉碎后過網(wǎng)目為198 μm的篩，用雙螺旋擠條機(jī)制成直徑為3.0 mm的顆粒，自然風(fēng)干后密封冰凍保存?zhèn)溆?。紅螯光殼螯蝦飼料一般營養(yǎng)成分如表1所示。

表1 紅螯光殼螯蝦飼料一般營養(yǎng)成分Tab.1 Aproximate nutritional composition of marron Cherax quadricarinatus w/%

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理 將280只螯蝦隨機(jī)分配至28個(gè)養(yǎng)殖箱(長×寬×高為1 m×0.5 m×0.5 m)中，每箱8只，試驗(yàn)共設(shè)置7組，每組設(shè)置4個(gè)平行。養(yǎng)殖箱底部放置4～6塊瓦片、10根PVC管作為遮蔽物，防止螯蝦相互殘殺及避免蛻皮期間被食。養(yǎng)殖期間，試驗(yàn)用水為曝氣24 h的自來水，溶氧量高于6 mg/L，水溫為26 ℃，光周期為14 L∶10 D，每天定時(shí)投喂7種試驗(yàn)飼料，日投喂量為螯蝦濕質(zhì)量的3%～4%，根據(jù)攝食及殘留飼料情況及時(shí)調(diào)整投喂量，每天定時(shí)清除殘留飼料及螯蝦排泄物，隔天換水一次，換水量為養(yǎng)殖水體的1/3～1/2，養(yǎng)殖周期共8周。

1.2.3 養(yǎng)殖期間不同VC組螯蝦血細(xì)胞與血淋巴樣品的采集及免疫指標(biāo)的測(cè)定 螯蝦養(yǎng)殖期間，于第2周、第4周、第6周、第8周，隨機(jī)從每組各取6只螯蝦，冰浴麻醉30 min后，抽取每只蝦的血淋巴，將血淋巴與抗凝劑(包含C6H5O7Na3-2H2O 1.76 g、C6H8O78.42 g、NaCl 5.96 g、EDTA-2Na 0.74 g，pH 7.3～7.4)按質(zhì)量比1∶1混勻，4 ℃下以3 500 r/min離心10 min，底部沉淀即為血細(xì)胞樣品，上清液即為血淋巴樣品。分別測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)血淋巴樣品的溶血活性、凝集活性、抑菌率及血細(xì)胞吞噬活性，然后取其平均值。

1.2.4 WSSV感染試驗(yàn)樣品的采集及免疫指標(biāo)的測(cè)定 8周養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，給0、400、800 mg/kg VC添加組每只紅螯光殼螯蝦人工注射100 μL WSSV病毒懸液，并于病毒侵染后的第0、24、48、96 h分別從每組取1只螯蝦，采集血細(xì)胞和血淋巴樣品，用于血細(xì)胞數(shù)和免疫指標(biāo)及基因表達(dá)分析。

1.2.5 血涂片的制作 用常規(guī)方法制成血涂片，每只紅螯光殼螯蝦制作5張血涂片，每張隨機(jī)選取100個(gè)細(xì)胞(不同視野)分類計(jì)數(shù)，對(duì)不同類型的血細(xì)胞隨機(jī)選取30個(gè)，測(cè)量細(xì)胞和細(xì)胞核的長短徑，計(jì)算細(xì)胞的核質(zhì)比，計(jì)算公式為

(1)

1.2.6 雞血細(xì)胞及小鼠血細(xì)胞懸液的制備 從雞翅下方采集靜脈血，用Alsever’s試劑保存，配制成體積分?jǐn)?shù)3%的雞紅細(xì)胞懸液，4 ℃下保存，用于血淋巴溶血活性的測(cè)定。

從小鼠尾部靜脈取血，放入用肝素浸潤的試管中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%的生理鹽水，配制成體積分?jǐn)?shù)5%的鼠紅細(xì)胞懸液，4 ℃下保存，用于血淋巴凝集活性的測(cè)定。

1.2.7 血細(xì)胞吞噬活性的測(cè)定 參照李海兵等[10]的方法，取抗凝血與嗜水氣單胞菌充分混勻后，28 ℃下孵育40 min，用常規(guī)方法制成血涂片，待涂片完全晾干后滴加甲醛固定，用Wright-Geimsa試劑盒染色，油鏡下觀察涂片并計(jì)數(shù)。血細(xì)胞的吞噬活性(或吞噬率，%)公式計(jì)算為

吞噬活性=(100個(gè)細(xì)胞中吞噬細(xì)菌的

血細(xì)胞數(shù)目/100)×100%。

(2)

1.2.8 RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 采用組織超純RNA提取試劑盒(MiniBEST Universal RNA Extraction Kit，TaKaRa)提取紅螯光殼螯蝦各組織中的RNA。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA，核酸蛋白儀測(cè)定RNA濃度后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time Kit，TaKaRa)反轉(zhuǎn)成cDNA，反應(yīng)體系10 μL，于-20 ℃下保存。

隨機(jī)取未進(jìn)行VC添加試驗(yàn)的1只紅螯光殼螯蝦，提取其肝胰腺、鰓、肌肉、胃、腸、心臟、腦、觸角腺等組織RNA，用于C-lectinmRNA在不同組織中的表達(dá)。提取0、400、800 mg/kg VC添加組各個(gè)時(shí)間段血細(xì)胞的RNA，用于VC對(duì)WSSV侵染后C-lectinmRNA表達(dá)量的分析。

1.2.9 熒光定量(RT-PCR)分析 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室克隆所得紅螯光殼螯蝦C-lectin基因cDNA片段(574 kbp)，設(shè)計(jì)特異性引物qLe-F和qLe-R(表2)檢測(cè)螯蝦不同組織中C-lectinmRNA的表達(dá)，以及VC對(duì)WSSV侵染后各組血細(xì)胞中C-lectin基因表達(dá)量的影響，以β-actin為內(nèi)參基因，反應(yīng)采用qRT-PCR循環(huán)(兩步法)。反應(yīng)條件為：95 ℃下預(yù)變性2 min；95 ℃下變性15 s，60 ℃下退火30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

表2 C-lectins基因及內(nèi)參基因引物序列Tab.2 Oligonucleotide primers of C-lectins gene and reference genes

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 20軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan多重比較，采用2-△△Ct法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 VC對(duì)WSSV侵染后紅螯光殼螯蝦血細(xì)胞數(shù)量的影響

人工注射WSSV懸浮液后，選取0、400、800 mg/kg 3個(gè)VC添加組，分析WSSV感染后紅螯光殼螯蝦血細(xì)胞總數(shù)的變化，結(jié)果如表3所示，3組血細(xì)胞總數(shù)隨病毒侵染時(shí)間的延長，均呈現(xiàn)減少趨勢(shì)，至96 h時(shí)，800 mg/kg VC添加組血細(xì)胞總數(shù)最高，且顯著高于其他兩組(P<0.05)。

表3 VC對(duì)WSSV侵染后紅螯光殼螯蝦血細(xì)胞總數(shù)的影響Tab.3 Effects of dietary VC on total hemocyte count of marron Cherax quadricarinatus challenged with WSSV 106 ind./mL

WSSV感染后，紅螯光殼螯蝦3種類型血細(xì)胞數(shù)量變化如表4所示。從表4可見：3種類型血細(xì)胞所占比例差異顯著(P<0.05)；0 h時(shí)，3個(gè)VC添加組中大顆粒細(xì)胞(GC)所占比例均最低(P<0.05)，其次為透明細(xì)胞(HC)，而小顆粒細(xì)胞(SGC)所占比例均最高(P<0.05)；至96 h時(shí)，與0 h時(shí)不同，3組中透明細(xì)胞所占比例均最低(P<0.05)，其次為小顆粒細(xì)胞，大顆粒細(xì)胞所占比例均最高(P<0.05)，800 mg/kg VC添加組大顆粒細(xì)胞所占比例顯著高于其他兩組(P<0.05)，400 mg/kg VC添加組小顆粒細(xì)胞所占比例較高，但與其他組相比無顯著性差異(P>0.05)。

表4 VC對(duì)WSSV侵染后紅螯光殼螯蝦3種血細(xì)胞數(shù)量的影響Tab.4 Effects of dietary VC on count of three type hemocytes of marron Cherax quadricarinatus challenged with WSSV %

2.2 VC對(duì)WSSV侵染后紅螯光殼螯蝦血細(xì)胞核質(zhì)比的影響

WSSV侵染后，紅螯光殼螯蝦3種類型血細(xì)胞核質(zhì)比表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。從表5可見：至96 h時(shí)，3個(gè)VC添加組大顆粒細(xì)胞的核質(zhì)比均較0 h顯著降低(P<0.05)，其中800 mg/kg VC添加組大顆粒核質(zhì)比高于其他兩組，但無顯著性差異(P>0.05)；3組小顆粒細(xì)胞核質(zhì)比均較0 h有所增大(除對(duì)照組外)，800 mg/kg VC添加組小顆粒細(xì)胞核質(zhì)比顯著大于對(duì)照組(P<0.05)；3組透明細(xì)胞核質(zhì)比顯著小于0 h，其中800 mg/kg VC添加組透明細(xì)胞核質(zhì)比顯著高于其他兩組(P<0.05)。

表5 VC對(duì)WSSV侵染后紅螯光殼螯蝦血細(xì)胞核質(zhì)比的影響Tab.5 Effects of VC on hemocyte NP of marron Cherax quadricarinatus challenged with WSSV

2.3 VC對(duì)養(yǎng)殖期間及WSSV侵染后紅螯光殼螯蝦血淋巴免疫活性的影響

2.3.1 紅螯光殼螯蝦血淋巴的溶血活性 從圖1可見：養(yǎng)殖期間，健康紅螯光殼螯蝦血淋巴溶血活性隨VC添加量的增加呈先增強(qiáng)后降低的趨勢(shì)；VC添加組血淋巴溶血活性顯著高于對(duì)照組(除3 200 mg/kg VC添加組外)(P<0.05)，但各添加組之間無顯著性差異(P>0.05)。

標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05),下同。The means with different letters are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences, et sequentia.圖1 不同水平VC添加組紅螯光殼螯蝦血淋巴的溶血活性Fig.1 Hemolytic activity of the hemolymph of marron Cherax quadricarinatus in different levels of VC

從圖2可見：受到WSSV侵染后，3組血淋巴溶血活性隨侵染時(shí)間的延長總體上呈先升高后降低的趨勢(shì)；至96 h時(shí)，血淋巴溶血活降至最低，且3組之間無顯著性差異(P>0.05)。

圖2 VC對(duì)WSSV侵染后紅螯光殼螯蝦血淋巴溶血活性的影響Fig.2 Effects of different levels of dietary VC on haemolytic activity in the hemolymph of marron Cherax quadricarinatus challenged with WSSV

2.3.2 紅螯光殼螯蝦血淋巴的凝集活性 從圖3可見：養(yǎng)殖期間，健康紅螯光殼螯蝦血淋巴凝集活性隨VC添加量的增加呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減低的趨勢(shì)；800 mg/kg VC添加組血淋巴凝集活性最高，且顯著高于其他兩組(P<0.05)。

圖3 不同水平VC添加組紅螯光殼螯蝦血淋巴的凝集活性Fig.3 Agglutinative activity of the hemolymph of marron Cherax quadricarinatus fed diets containing different levels of VC

從圖4可見：受到WSSV侵染后，血淋巴凝集活性隨侵染時(shí)間的延長總體上呈先升高后降低趨勢(shì)；800 mg/kg VC添加組血淋巴凝集活性在各時(shí)間點(diǎn)均保持在較高水平，至96 h時(shí)該組血淋巴凝集活性顯著高于其他兩組(P<0.05)。

圖4 VC對(duì)WSSV侵染后紅螯光殼螯蝦血淋巴凝集活性的影響Fig.4 Effects of different levels of VC on agglutinative activity in the hemolymph of marron Cherax quadricarinatus challenged with WSSV

2.3.3 紅螯光殼螯蝦血淋巴的抑菌率 從圖5可見：養(yǎng)殖期間，健康紅螯光殼螯蝦血淋巴抑菌率隨VC添加量的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)；VC添加組血淋巴抑菌率均較對(duì)照組顯著增強(qiáng)(P<0.05)，800 mg/kg VC添加組血淋巴抑菌率最高。

圖5 不同水平VC添加組紅螯光殼螯蝦血淋巴的抑菌率Fig.5 Antibacterial activity of the hemolymph of marron Cherax quadricarinatus in different levels of VC

從圖6可見：受到WSSV侵染后，血淋巴抑菌率隨著侵染時(shí)間的延長呈現(xiàn)降低趨勢(shì)；對(duì)照組血淋巴抑菌率最低，且顯著低于其他兩組(P<0.05)；至96 h時(shí)，400、800 mg/kg VC添加組血淋巴抑菌率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但這兩組間無顯著性差異(P>0.05)。

圖6 VC對(duì)WSSV侵染后紅螯光殼螯蝦血淋巴抑菌率的影響Fig.6 Effects of different levels of VC on antibacterial activity in the hemolymph of marron Cherax quadricarinatus challenged with WSSV

2.3.4 紅螯光殼螯蝦血細(xì)胞的吞噬活性 從圖7可見：養(yǎng)殖期間，健康紅螯光殼螯蝦血細(xì)胞吞噬活性隨VC添加量的增加呈先增強(qiáng)后降低的趨勢(shì)；VC添加組血細(xì)胞吞噬活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，當(dāng)飼料中VC含量超過800 mg/kg后，血細(xì)胞的吞噬活性隨VC添加量的增加而顯著降低(P<0.05)。

圖7 不同水平VC添加組紅螯光殼螯蝦血細(xì)胞的吞噬活性Fig.7 Phagocytosis percent of the hemocyte of marron Cherax quadricarinatus in different levels of VC

從圖8可見：受到WSSV侵染后，對(duì)照組血細(xì)胞吞噬活性隨侵染時(shí)間的延長總體上呈先升高后降低的趨勢(shì)，而VC添加組血細(xì)胞吞噬活性則隨WSSV侵染時(shí)間的延長呈持續(xù)降低趨勢(shì)；至96 h時(shí)，800 mg/kg VC添加組血淋巴凝集活性顯著高于其他兩組(P<0.05)。

圖8 VC對(duì)WSSV侵染后紅螯光殼螯蝦血細(xì)胞吞噬活性的影響Fig.8 Effects of different levels of dietary VC on phagocytosis percent in the hemocyte of marron Cherax quadricarinatus challength with WSSV

2.4 VC對(duì)WSSV侵染后紅螯光殼螯蝦C-lectin基因表達(dá)量影響

從圖9可見：在未進(jìn)行VC試驗(yàn)的健康紅螯光殼螯蝦中，C-lectin基因在血細(xì)胞中表達(dá)量最高，顯著高于其他組織(P<0.05)，其次為肝胰腺組織，表達(dá)量顯著高于除血細(xì)胞外的其他組織(P<0.05)，C-lectin在腦、觸角腺、胃、肌肉組織中幾乎不表達(dá)。

從圖10可見：受到WSSV侵染后，VC添加組C-lectin基因表達(dá)量隨著侵染時(shí)間的延長呈先升高后降低的趨勢(shì)；至96 h時(shí)，3組基因表達(dá)量均保持在較低水平，800 mg/kg VC添加組基因表達(dá)量顯著高于其他兩組(P<0.05)。

標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。The means with different letters are significant differences at the 0.05 probabilitylevel, and the means with the same letters are not significant differences.圖9 C-lectin基因在紅螯光殼螯蝦不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.9 qRT-PCR analysis of C-lectin gene expresion in different tissues of marron Cherax quadricarinatus

圖10 VC對(duì)WSSV侵染后紅螯光殼螯蝦血細(xì)胞C-lectin基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.10 Effects of dietary VC on C-lectin gene expression level in the hemocyte of marron Cherax quadricarinatus challength with WSSV

3 討論

3.1 VC對(duì)WSSV侵染后紅螯光殼螯蝦血細(xì)胞總數(shù)、血細(xì)胞吞噬活性的影響

血細(xì)胞是甲殼動(dòng)物主要的免疫細(xì)胞，負(fù)責(zé)體內(nèi)的細(xì)胞免疫和體液免疫[11]。紅螯光殼螯蝦血細(xì)胞分為大顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞，不同類型的血細(xì)胞在免疫反應(yīng)中所起的作用不同[12]。血淋巴中溶血素、凝集素、抗菌因子等是甲殼動(dòng)物重要的免疫因子，在先天免疫中發(fā)揮重要的作用。血細(xì)胞總數(shù)、3種類型血細(xì)胞所占比例及血淋巴中免疫因子的變化一定程度上可以反映蝦免疫狀況[13]。WSSV侵染后，紅螯光殼螯蝦血細(xì)胞總數(shù)顯著降低，可能與WSSV的增殖和釋放最終導(dǎo)致血細(xì)胞的破裂有關(guān)，而血細(xì)胞總數(shù)低于正常水平時(shí)抵御病毒的能力大大降低[14]。透明細(xì)胞具有較強(qiáng)的吞噬能力[15]，本研究中WSSV侵染后透明細(xì)胞數(shù)量的減少一定程度上影響螯蝦對(duì)于病原微生物的吞噬作用，表現(xiàn)為血細(xì)胞總吞噬活性的降低，至96 h時(shí)，800 mg/kg VC添加組血細(xì)胞吞噬活性略高于對(duì)照組，可能與VC一定程度上增強(qiáng)小顆粒細(xì)胞或透明細(xì)胞的吞噬活性有關(guān)，從而表現(xiàn)為血細(xì)胞的吞噬活性有所增強(qiáng)，本研究結(jié)果與對(duì)克氏原螯蝦Procambarusclarkii和草魚Ctenopharyngodonidella的研究結(jié)果相似[16-17]。而小顆粒細(xì)胞負(fù)責(zé)執(zhí)行對(duì)較大異物的包囊作用，是免疫防御反應(yīng)中的關(guān)鍵細(xì)胞[18]，小顆粒細(xì)胞的減少會(huì)影響螯蝦對(duì)病原微生物的識(shí)別和包囊作用，而大顆粒細(xì)胞是酚氧化酶系統(tǒng)的主要儲(chǔ)存細(xì)胞，在一定條件下，大顆粒細(xì)胞中的酚氧化酶原被釋放并激活，啟動(dòng)免疫防御的黑化反應(yīng)，此外，大顆粒細(xì)胞還能釋放抗菌肽等免疫因子[19]。本試驗(yàn)中，WSSV侵染后大顆粒細(xì)胞數(shù)量顯著增加，但核質(zhì)比卻顯著降低，可能影響酚氧化酶系統(tǒng)，這可能與WSSV侵染導(dǎo)致血細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞有直接關(guān)系，而WSSV侵染后800 mg/kg VC添加組血細(xì)胞總數(shù)和大顆粒細(xì)胞總數(shù)顯著高于其他兩組，表明VC可在一定程度上增強(qiáng)機(jī)體的免疫機(jī)能，提高螯蝦對(duì)于WSSV的抵御能力，這與對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦Penaeusmonodon的研究結(jié)果相似[20]。

3.2 VC對(duì)WSSV侵染后紅螯光殼螯蝦血淋巴免疫機(jī)能及基因表達(dá)水平的影響

溶血素在甲殼動(dòng)物免疫防御過程中所起的作用類似于脊椎動(dòng)物的補(bǔ)體系統(tǒng)，可破壞異物細(xì)胞，具有一定的可誘導(dǎo)性，在病原微生物的清除中起重要作用[21]。本試驗(yàn)中WSSV侵染后，隨著侵染時(shí)間的延長溶血活性呈先升高后下降趨勢(shì)，WSSV表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，可能與WSSV在螯蝦體內(nèi)的作用途徑有關(guān)，VC添加96 h時(shí)，VC組溶血活性較對(duì)照組略有升高，紅螯光殼螯蝦血淋巴中的溶血素可能具有一定的可誘導(dǎo)性，而適量的VC可能對(duì)溶血素產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，VC的誘導(dǎo)提高了溶血素濃度進(jìn)而增強(qiáng)了溶血活性。甲殼動(dòng)物體液免疫中的溶菌酶[22-23]、抗菌肽和凝集素是重要的抗菌物質(zhì)[24]，當(dāng)機(jī)體受到病原微生物刺激時(shí)，血細(xì)胞會(huì)將抗菌物質(zhì)釋放到細(xì)胞外，共同發(fā)揮抑菌作用[25]。本試驗(yàn)飼料中添加適量VC后，紅螯光殼螯蝦血淋巴抑菌率增強(qiáng)，意味著機(jī)體對(duì)嗜水氣單胞菌的抵抗力增強(qiáng)，表明VC在機(jī)體抵御細(xì)菌侵染過程中起到積極作用。本試驗(yàn)中WSSV侵染后，800 mg/kg VC添加組血淋巴中凝集素活性顯著高于未添加組，這表明VC可能在機(jī)體抵御病毒侵染過程中起到積極作用，抑菌能力的提升可能與VC提高了體液中的溶菌酶、抗菌肽、凝集素及血細(xì)胞吞噬活性有關(guān)。

凝集素是甲殼動(dòng)物體內(nèi)重要的免疫識(shí)別因子[26]，其作用類似于脊椎動(dòng)物的抗體，具有高度的調(diào)理性，可促進(jìn)血細(xì)胞的吞噬作用[27]。甲殼動(dòng)物因其種類不同，其對(duì)脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞的凝集作用也存在差異。日本沼蝦和南美白對(duì)蝦[25]血淋巴中凝集素對(duì)小鼠紅細(xì)胞和兔細(xì)胞的凝集作用最強(qiáng)。鋸緣青蟹Scyllaserrata[28]血淋巴中凝集素對(duì)小鼠紅細(xì)胞的凝集作用也最強(qiáng)。結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，本研究中選擇小鼠紅細(xì)胞懸液來測(cè)定紅螯光殼螯蝦血淋巴凝集活性，飼料中VC添加量小于或大于800 mg/kg時(shí)，螯蝦血淋巴中凝集活性均有所降低，表明適量的VC能夠增強(qiáng)螯蝦血淋巴的凝集活性，可能與VC是凝集素的誘導(dǎo)因子有關(guān)。本研究中WSSV侵染后，紅螯光殼螯蝦血淋巴中凝集活性和血細(xì)胞中C-lectin基因表達(dá)量在24 h內(nèi)有明顯的上升趨勢(shì)，但隨著病毒侵染時(shí)間的延長，基因表達(dá)量降低，可能與病毒侵害機(jī)體的免疫系統(tǒng)及部分組織導(dǎo)致凝集活性的降低有關(guān)，至96 h時(shí)，800 mg/kg VC添加組凝集素活性和C-lectin基因表達(dá)量均顯著高于未添加組，表明VC能在一定程度上增強(qiáng)凝集素的活性和基因表達(dá)量，從而提高機(jī)體對(duì)于WSSV的抵抗力。

結(jié)合以上研究結(jié)果，表明WSSV侵染后，飼料中添加800 mg/kg的VC能在一定程度上增強(qiáng)紅螯光殼螯蝦血淋巴的免疫機(jī)能、免疫因子的免疫活性及血細(xì)胞總數(shù)和吞噬作用，提高紅螯光殼螯蝦對(duì)于病毒的抵抗力，但WSSV感染后紅螯光殼螯蝦的恢復(fù)問題需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

1)飼料中添加適量的VC可增強(qiáng)紅螯光殼螯蝦血淋巴溶血活性、抑菌活性、凝集活性和吞噬活用。

2)WSSV侵染后，螯蝦血細(xì)胞總數(shù)、血淋巴免疫因子活性及C-lectin基因表達(dá)量顯著降低。

3)飼料中添加800 mg/kg的VC效果最好，可在一定程度上增強(qiáng)螯蝦免疫力及對(duì)WSSV的抵抗力。