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    LED激發(fā)熒光光譜法快速測(cè)定玉米粉中的黃曲霉毒素B1

    2022-01-09 06:46:18楊卓燃李超逸王文明杜一平
    分析測(cè)試學(xué)報(bào) 2021年12期
    關(guān)鍵詞:玉米粉黃曲霉毒素

    楊卓燃,李 龍,李超逸,吳 瓊,王 芳,王文明,杜一平*

    (1.華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院,上海 200237;2.河南省科學(xué)院化學(xué)研究所,河南 鄭州 450002)

    黃曲霉毒素(AFT)是黃曲霉和寄生曲霉等菌株產(chǎn)生的雙呋喃環(huán)類(lèi)毒素,其衍生物約20 種,分別命名為B1、B2、G1、G2、M1、M2、GM、P1、Q1、毒醇等。其中以黃曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最大,致癌性最強(qiáng)[1]。AFB1 的半數(shù)致死量(LD50)為0.249 mg/kg,其毒性是氰化鉀的10 倍,砷的68 倍,可引起急性中毒和死亡[2-3]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761-2017規(guī)定了AFB1在各種食物中的限定含量,其中在玉米粉制品中的含量不得超過(guò)20μg/kg[4]。目前黃曲霉毒素的主要檢測(cè)方法包括薄層色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和酶聯(lián)免疫法(ELISA)[5-10]等。薄層色譜法快速便捷,但靈敏度較低[11],高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的靈敏度和準(zhǔn)確度均能滿(mǎn)足國(guó)標(biāo)要求[12],但需要使用大型儀器,且樣品前處理較復(fù)雜,檢測(cè)周期較長(zhǎng),不適合大量樣品的快速檢測(cè)。ELISA法是食品樣品中黃曲霉毒素的常規(guī)快檢方法,該方法較靈敏,樣品前處理較簡(jiǎn)單[13],但復(fù)雜樣品的基質(zhì)效應(yīng)會(huì)影響檢測(cè)的可靠性,造成結(jié)果重復(fù)性較差,且易產(chǎn)生假陽(yáng)性[14]。黃曲霉毒素具有較強(qiáng)的熒光信號(hào),有文獻(xiàn)報(bào)道汞離子(Hg2+)對(duì)黃曲霉毒素分子具有熒光增強(qiáng)效應(yīng)[15]。本文采用自行構(gòu)建的LED 燈激發(fā)的小型熒光光譜檢測(cè)裝置,基于Hg2+對(duì)黃曲霉毒素分子的熒光增強(qiáng)效應(yīng)建立了AFB1的熒光光譜檢測(cè)方法。該方法儀器小巧廉價(jià)、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高,適用于食品、飼料等樣品中AFB1含量的快速檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)分析。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器與試劑

    LED 光源(370 nm,5 V,上海聞奕光電科技有限公司);光纖光譜儀(波長(zhǎng)190~800 nm,OEM 機(jī),德國(guó)Insion 公司);PHS-25數(shù)字型精密酸度計(jì)(梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司);超純水凈化系統(tǒng)(≥18.2 MΩ·cm,美國(guó)默克集團(tuán));Lumina熒光分光光度計(jì)(賽默飛世爾(上海)科技有限公司)。

    AFB1(98%,北京百靈威科技有限公司);硝酸汞(分析純,貴州銅仁化學(xué)試劑廠);甲醇、乙腈、氯化鈉、氯化鋅(分析純,上海泰坦科技股份有限公司);硝酸、氯化鉀、氯化鈣(分析純,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司);氫氧化鈉(分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);氯化錳(分析純,阿達(dá)瑪斯試劑有限公司);氯化鋁(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);K-49 型玻璃纖維濾膜(德州市科佳環(huán)境監(jiān)測(cè)用品廠);AFB1免疫親和柱(1 mL,深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司)。

    AFB1 儲(chǔ)備液(10 mg/L):AFB1 標(biāo)準(zhǔn)品使用甲醇配制,-18 ℃冷藏保存,可儲(chǔ)存6 個(gè)月;使用時(shí)用甲醇稀釋?zhuān)? ℃冰箱冷藏,一周內(nèi)使用。

    1.2 LED激發(fā)熒光光譜檢測(cè)裝置

    目前以LED 燈作為光源的小型光譜儀[16-17]與小型光纖光譜儀[18]均已有廣泛報(bào)道,但LED 燈激發(fā)熒光——直接檢測(cè)熒光光譜用于黃曲霉毒素檢測(cè)方面的工作尚未見(jiàn)報(bào)道。在課題組前期工作[19-20]基礎(chǔ)上,本文構(gòu)建了LED激發(fā)熒光光譜檢測(cè)裝置,如圖1 所示。采用中心波長(zhǎng)370 nm 的LED 燈作為光源,對(duì)比色皿內(nèi)的樣品溶液進(jìn)行熒光激發(fā),發(fā)射光通過(guò)光纖導(dǎo)入光譜儀中,使檢測(cè)器產(chǎn)生熒光信號(hào),由電腦軟件采集樣品的熒光發(fā)射光譜。

    圖1 熒光檢測(cè)裝置示意圖Fig.1 The schematic of the fluorescence device

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 玉米粉樣品的前處理稱(chēng)取2 g玉米粉樣品,加入25 mL甲醇-水溶液(體積比4∶1)作為提取液,同時(shí)加入2.0 g NaCl粉末破乳,磁力攪拌提取30 min,隨后過(guò)濾,收集全部濾液于25 mL容量瓶定容;取10 mL濾液,加入20 mL水后以玻璃纖維濾紙過(guò)濾至濾液澄清;取15 mL澄清濾液,以黃曲霉毒素B1專(zhuān)用免疫親和柱進(jìn)行處理,甲醇洗脫,收集洗脫液于10 mL容量瓶定容,備用。提取液于4 ℃冰箱冷藏,可放置3 d。

    1.3.2 黃曲霉毒素B1的熒光光譜測(cè)量配制一系列濃度的AFB1溶液,分別取2 mL不同濃度的AFB1溶液與0.5 mL 0.001 mol/L 的硝酸汞溶液在離心管中混勻,隨后轉(zhuǎn)移至比色皿中,將比色皿放入檢測(cè)池后打開(kāi)LED燈,立即測(cè)定體系的熒光發(fā)射光譜,以443.2 nm處的發(fā)射光強(qiáng)度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    取“1.3.1”中處理好的玉米粉樣品溶液2 mL 于離心管中,加入0.5 mL 0.001 mol/L 的硝酸汞溶液,混勻后立即測(cè)定其熒光發(fā)射光譜,基于443.2 nm 處的發(fā)射強(qiáng)度,使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)玉米粉中的AFB1濃度進(jìn)行定量。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)的選擇

    使用Lumina 熒光分光光度計(jì)測(cè)定AFB1-Hg2+體系的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜,發(fā)現(xiàn)367 nm 處激發(fā)光譜的強(qiáng)度最高,故選擇370 nm 的LED 燈作為激發(fā)光源。在370 nm的LED 燈激發(fā)下,AFB1-Hg2+的最大發(fā)射波長(zhǎng)為443.2 nm,故選擇該波長(zhǎng)為AFB1的分析波長(zhǎng)。

    2.2 汞離子對(duì)AFB1的熒光增強(qiáng)效應(yīng)

    取2 mL 1 mg/L 的AFB1 溶液兩份,一份加入0.5 mL 0.001 mol/L的硝酸汞溶液,另一份加入0.5 mL水,測(cè)定熒光發(fā)射光譜,結(jié)果如圖2 所示。從圖中可見(jiàn),加入Hg2+后,AFB1 的熒光發(fā)射峰峰位基本不變,熒光強(qiáng)度增強(qiáng)約7 倍。有文獻(xiàn)報(bào)道稱(chēng)[21],Hg 作為S0金屬極易形成AFB1-Hg 八面體配合物,而這類(lèi)配合物通常會(huì)發(fā)生配體(AFB1)到金屬離子(Hg2+)的電荷躍遷(LMCT 躍遷),形成2·L 型或者L-L 型或者L-M2+-L 型配體,使反應(yīng)體系中的剛性結(jié)構(gòu)得以加強(qiáng)同時(shí)共軛體系增加,導(dǎo)致發(fā)出的熒光量子數(shù)增多,進(jìn)而熒光發(fā)射光譜大大增強(qiáng)。

    圖2 Hg2+對(duì)AFB1的熒光增強(qiáng)效應(yīng)Fig.2 Fluorescence enhancement effect of introducing Hg2+to AFB1 solution

    2.3 自搭建的光譜儀性能驗(yàn)證

    取2 mL 0.1 mg/L 的AFB1 溶液兩份,加入0.5 mL 0.001 mol/L的硝酸汞溶液,分別使用Lumina熒光分光光度計(jì)與自搭建的小型光譜檢測(cè)設(shè)備檢測(cè)其熒光發(fā)射光譜,發(fā)現(xiàn)兩種儀器的光譜形狀和發(fā)射波長(zhǎng)相近,說(shuō)明所搭建的光譜檢測(cè)設(shè)備可靠。由于激發(fā)光譜LED 燈的單色性和光強(qiáng)不如商業(yè)儀器,因此光譜噪聲相對(duì)較高,導(dǎo)致信噪比較低。但以下研究顯示其性能滿(mǎn)足AFB1 的定量分析要求。

    2.4 衍生化條件的優(yōu)化

    2.4.1 pH值對(duì)反應(yīng)體系的影響用稀硝酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié),獲得不同pH 值的樣品溶液,探索了pH 值對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響,結(jié)果如圖3 所示。從圖可知,在pH 3.0~8.0 范圍內(nèi),體系的熒光強(qiáng)度較為穩(wěn)定;當(dāng)pH > 8.0 時(shí),汞的水解作用嚴(yán)重影響熒光信號(hào),而pH<3.0時(shí),熒光強(qiáng)度也呈現(xiàn)減弱的趨勢(shì),故測(cè)定時(shí)體系pH 值控制在3.0~8.0 范圍。

    圖3 pH值對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 The influence of pH value on the fluorescence intensity of the system

    2.4.2 Hg2+用量對(duì)反應(yīng)體系的影響由于AFB1 分子與Hg2+可結(jié)合的位點(diǎn)較多,Hg2+需過(guò)量加入。衍生化物的熒光強(qiáng)度隨Hg2+用量的增加而增強(qiáng),在Hg2+與AFB1的濃度比大于80∶1時(shí),熒光強(qiáng)度較高,且變化不大。考慮到熒光強(qiáng)度的穩(wěn)定性,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇Hg2+與AFB1的濃度比為200∶1。

    2.4.3 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)反應(yīng)體系的影響溶劑體系可對(duì)熒光發(fā)射強(qiáng)度產(chǎn)生明顯影響,本研究的溶劑體系中,隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大,熒光發(fā)射強(qiáng)度呈增加趨勢(shì),當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)>66.7%時(shí),體系的熒光發(fā)射強(qiáng)度基本趨于穩(wěn)定,且維持在較高的水平。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇體系中甲醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

    2.4.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系的影響探究了反應(yīng)時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),AFB1與Hg2+的反應(yīng)十分迅速,加入Hg2+即刻就能產(chǎn)生穩(wěn)定的熒光信號(hào),且反應(yīng)在2 h 內(nèi)的熒光強(qiáng)度基本不變。故本實(shí)驗(yàn)選擇在加入Hg2+后立即測(cè)定熒光強(qiáng)度。

    2.5 干擾實(shí)驗(yàn)

    選擇玉米粉中可能存在的K+、Na+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Al3+[22-23]進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn),在反應(yīng)體系中加入與汞離子濃度相當(dāng)?shù)纳鲜鼋饘匐x子,熒光強(qiáng)度的測(cè)定結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出,K+、Na+、Ca2+對(duì)原體系基本沒(méi)有干擾,而Zn2+、Mn2+、Al3+則對(duì)體系的熒光強(qiáng)度有較明顯的干擾。對(duì)這3 種離子在實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行了容忍度實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,Zn2+、Mn2+、Al3+在體系中允許存在的最大濃度依次為1.94、1.38、2.42 mmol/L。而通常情況下,玉米粉中不會(huì)含有如此高濃度的這3 種離子,因此本研究不會(huì)產(chǎn)生金屬離子的干擾,即使有也可通過(guò)調(diào)節(jié)pH 值的方法去除。文獻(xiàn)[15]還研究了Cl-、醋酸根、檸檬酸根、H2PO4-對(duì)AFB1-Hg2+體系熒光信號(hào)的影響,發(fā)現(xiàn)前3 種離子對(duì)體系基本無(wú)干擾,而H2PO4-對(duì)體系具有增敏作用。因此實(shí)際測(cè)定中要注意排除H2PO4-的影響。

    圖4 金屬離子對(duì)體系熒光強(qiáng)度的干擾Fig.4 Interference of metal ions on the fluorescence intensity of the system

    2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

    按“1.3.2”方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,AFB1 質(zhì)量濃度(x)在3~90 μg/L 范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度(y)具有良好的線性關(guān)系:y=5.76x+11.9,相關(guān)系數(shù)r2=0.996。方法的檢出限(LOD=3S/K,S為5次空白樣品測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差,K為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)為0.913μg/L。

    2.7 玉米粉樣品中AFB1的測(cè)定

    從不同場(chǎng)所購(gòu)置兩種玉米粉樣品,利用所建立方法對(duì)其中的AFB1 含量進(jìn)行檢測(cè),未檢出AFB1,以加標(biāo)回收率評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度,結(jié)果如表1 所示。數(shù)據(jù)顯示,兩份玉米樣品在低、中、高3 個(gè)水平下的加標(biāo)回收率為84.1%~107%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.1%~7.1%。方法準(zhǔn)確度和精密度較理想,滿(mǎn)足歐盟標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定要求[24-25]。

    表1 玉米粉樣品中AFB1的檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detect results of AFB1 in cornflour

    3 結(jié) 論

    本研究使用LED 激發(fā)的小型熒光光譜檢測(cè)裝置,建立了一種基于汞離子熒光增強(qiáng)效應(yīng)的AFB1 含量的快速檢測(cè)方法。該方法使用小巧廉價(jià)的光譜設(shè)備,樣品前處理步驟少,檢測(cè)時(shí)間短,獲得了較高的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度,具有一定的抗干擾能力,光譜檢測(cè)結(jié)果與商用光譜儀結(jié)果相近。同時(shí),該小型光譜儀體積小,具有便攜性,未來(lái)有望用于食品和飼料樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速分析檢測(cè)。此外,本方法作為一種檢測(cè)樣品中低含量分析物的新方法,也非常適用于農(nóng)業(yè)和環(huán)境領(lǐng)域中有機(jī)污染物的快速檢測(cè)。

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