丁基苯酞通過miR-548a-5p 調(diào)控NF-κB 在大鼠心力衰竭中的影響及作用機制

陳偉釗，王懷龍（通訊作者），胡秀媚，黎春光，陳敏琪

（東莞市寮步醫(yī)院心血管內(nèi)科 廣東 東莞 523400）

心力衰竭是多種心臟疾病的終末階段，具有較高的病死率。近年來隨著我國人口老齡化，我國慢性心力衰竭（chronic heart failure,CHF）的發(fā)病率呈升高趨勢，嚴重威脅人們健康。目前，臨床上對于CHF 主張早期診斷，早期治療[1-2]。既往N 末端B 型利納肽原或B 型利納肽等標記物是評價CHF 病情進展與預后的主要指標，但臨床應用效果欠佳。因此，探索一個或多個指導CHF 早期準確診斷和治療的指標成為臨床學者關(guān)注的焦點，而了解心力衰竭形成機制對于指導臨床治療、改善心力衰竭患者生活質(zhì)量具有重要意義。先前大量研究[3-5]表明丁基苯酞在缺血的腦組織中具有提高能量代謝，抗氧化作用，促進微循環(huán)，減少神經(jīng)細胞凋亡以及抑制炎癥反應的作用。然而丁基苯酞在心力衰竭患者房顫發(fā)生過程中是否具有保護效應尚不得知。microRNAs（miRNAs）在神經(jīng)發(fā)育和多種神經(jīng)疾病中有著重要作用，而miR-548a-5p 作為一個靈長類特有的miRNA 家族，其在多種疾病中異常表達，NF-κB 廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，是細胞中一個重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)miR-548a-5p可與NF-κB的3’-URT結(jié)合，進而調(diào)控炎癥因子NF-κB，提示miR-548a-5p 可能是NF-κB 的調(diào)控分子。故本研究建立大鼠心力衰竭模型，并通過給予藥物丁基苯酞觀察大鼠心力衰竭的發(fā)生，探討丁基苯酞通過miR-548a-5p 調(diào)控NF-κB 在大鼠心力衰竭中的影響及作用機制，為臨床心力衰竭治療提供參考。

1.資料與方法

1.1 實驗動物

成年雄性Sprague-Dawley 大鼠54 只（SPF 級），體重237～286 g，平均體重（262±13）g，飼養(yǎng)于溫度22 ℃、濕度60%的無菌環(huán)境中。光周期為12 h 光/暗周期。所有大鼠在5 d 適應期后進行測試。將將左心室射血分數(shù)（left ventricular ejection fractions,LVEF）＜45%的心力衰竭模型大鼠隨機分為丁基苯酞組（NBP）、模型組（Model）和假手術(shù)組（Sham），每組18 只。將丁苯酞溶解于大豆油中制備10 mg/mL 丁苯酞溶液。丁基苯酞組大鼠灌胃80 mg/kg 體重，模型組和假手術(shù)組大鼠灌胃等量大豆油。假手術(shù)組大鼠不結(jié)扎左冠狀動脈前降支行同樣的手術(shù)。本研究已獲我院動物保護委員會批準。

1.2 方法

心力衰竭模型的制作：結(jié)扎左冠狀動脈前降支建立心肌梗死模型。大鼠腹腔注射7%水合氯醛（250 mg/kg體重）麻醉后，用自制的可連接呼吸機的插管。呼吸機的呼吸頻率設定為70 次/min，潮氣量為1 mL/100 g 體重。胸部在第三和第四肋間打開，心臟完全暴露。用尼龍線結(jié)扎左心房邊緣下2.5 mm 的ladca。當ladca 區(qū)由鮮紅色變?yōu)榈t色，心肌收縮力下降，心電圖ST 段抬高改變時，說明ladca 結(jié)扎成功。然后關(guān)閉胸骨和皮膚，將大鼠轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中。當大鼠開始吞咽時，氣管插管被移除。

1.3 觀察指標

（1）評估三組心功能：術(shù)后3 d 收集血清評估左心室射血分數(shù)（LVEF），B 型腦鈉肽（BNP），N 末端B 型腦鈉肽原（NT-proBNP）水平；（2）甲醛固定好HE 染色，Masson 染色和免疫組化以及NF-κB/MAPK 信號通絡相關(guān)蛋白的表達；運用western Blot 檢測NF-κB 及NFκB/MAPK 信號通絡相關(guān)蛋白表達水平以及實時定量RTPCR miR-548a-5p 的mRNA 的表達水平；（3）運用熒光素酶報告基因，RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀、凝膠電泳遷移率試驗等方法檢測NF-κB 和miR-548a-5p 之間的相互關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計分析軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，采用t檢驗,計數(shù)資料用頻數(shù)、率（%）表示，行χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

miR-548a-5p 的表達水平在模型組大鼠心肌組織樣本中上調(diào)，丁基苯酞顯著下調(diào)miR-548a-5p 的表達水平（P＜0.05），見圖2。

羅爹爹急喊無用，轉(zhuǎn)眼便不見他的人影。羅爹爹腿力不行，忙打電話給兒子羅四強。羅爹爹說：“四強，你趕緊過來。阿里跑不見了，我追不到他?！?/p>

2.結(jié)果

2.1 心功能及BNPNT-proBNP 指標

從圖4可以看出,隨著通信半徑的增加,網(wǎng)絡連通性提高,所以各算法的平均定位誤差均降低,本文定位算法平均定位誤差始終保持最小,優(yōu)于其他算法?？梢钥闯鲈谙嗤亩ㄎ徽`差下,本文算法所需要的通信半徑最小,通信半徑越小,能耗越小,在同等條件下,本文算法可以節(jié)約能耗,延長網(wǎng)絡壽命,降低網(wǎng)絡維護成本。

表1 三組大鼠心功能及BNPNT-proBNP 指標對比（）

表1 三組大鼠心功能及BNPNT-proBNP 指標對比（）

2.2 大鼠心肌組織中NF-κB 的蛋白表達及NF-κB/MAPK 信號通絡相關(guān)蛋白的表達

雖然心力衰竭的機制研究尚不明了[6]，但炎性細胞因子在心衰的發(fā)展和進展中有致病作用[7-8]，但這些細胞因子同時具有有益的心臟保護作用。免疫激活和炎性細胞因子的釋放可能是心肌損傷適應性反應的一部分，某些情況下，對于保持心肌功能可能是必要的[9-10]。在針對心衰制定免疫調(diào)節(jié)治療措施時必須要考慮到過度的治療，即使是針對特異細胞因子的靶向治療，也可能會抑制心臟保護進程并造成損害。因此在心衰治療中，應支持和采取一種廣泛的免疫治療方法，其目的是調(diào)節(jié)細胞因子網(wǎng)絡失調(diào)狀態(tài)，而不是阻滯某種特定細胞因子的功能[11-12]。

圖1 丁基苯酞對炎癥介質(zhì)NF-κB（A）和NF-κB/MAPK 信號通路（B）的蛋白表達的影響

2.3 大鼠心肌組織中miR-548a-5p 的mRNA 的表達水平

其中：X仍為系統(tǒng)的狀態(tài)向量，Xd=xd為針對小球在導軌上的位置x而輸入的參考軌跡。則根據(jù)上文研究的球桿系統(tǒng)可知：A11=A，B1=B。且系統(tǒng)的參考軌跡輸入并不會影響系統(tǒng)內(nèi)部的運動規(guī)律，則有：

圖2 RT-PCR 檢測大鼠心肌組織中miR-548a-5p 的含量

2.4 丁基苯酞對心房纖維化的影響

心力衰竭是多種心臟疾病的最后階段，是心臟疾病進展到終末期的共同通路，采用各種措施來阻止心力衰竭的發(fā)生發(fā)展是臨床防治心肌病變，延緩心功能衰減的重要手段[13]。本研究從體內(nèi)研究丁基苯酞可通過抑制miR-548a-5p 調(diào)控NF-κB 減輕心力衰竭導致的心肌細胞損傷的作用和機制，實驗結(jié)果顯示，應用丁基苯酞治療4 周后，與模型組相比，丁基苯酞治療導致該組大鼠的LVEF 值顯著增加，BNP、NT-proBNP 表達水平顯著降低，表明丁基苯酞可減輕心力衰竭的發(fā)生，從而保護心臟功能。

圖3 丁基苯酞對心房纖維化的影響

3.討論

炎癥介質(zhì)NF 在模型組-κB 蛋白表達顯著增加，丁基苯酞顯著抑制該指數(shù)（P＜0.05），見圖1A；此外，與假手術(shù)組相比，模型組NF-κB 表達明顯高于假手術(shù)組，丁基苯酞組NF-κB 和MAPK 表達明顯下調(diào)（P＜0.05），見圖1B。

與模型組相比，丁基苯酞治療導致該組大鼠的LVEF 值顯著增加，BNP、NT-proBNP 表達水平顯著降低（P＜0.05），見表1。

Masson 三色染色顯示假手術(shù)組左心房輕度纖維化，而模型組顯示嚴重纖維化、廣泛的肌原纖維斷裂和顯著的心肌細胞肥大，見圖3A；丁基苯酞顯著減少纖維化和心肌細胞肥大（P＜0.05），見圖3B。

研究小組應用生物信息學分析miR-548a-5p 啟動子序列時發(fā)現(xiàn)，NF-κB 3’-UTR 區(qū)域含有miR-548a-5p 結(jié)合位點，在細胞和動物心臟纖維化模型中可發(fā)現(xiàn)NF-κB的表達上調(diào)。本研究將進一步克隆miR-548a-5p 3’-UTR，通過染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）、凝膠電泳遷移率實驗（EMSA）以及熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測miR-548a-5p與NF-κB 之間的相互作用，結(jié)果顯示，模型組的炎癥介質(zhì)NF-κB 蛋白表達量顯著增加，而該指標均被丁基苯酞顯著抑制（P＜0.05），表明NF-κB 在心臟HCM 細胞內(nèi)表達，且在給予藥物丁基苯酞后小鼠心臟中其表達量明顯上調(diào)，NF-κB 具有炎癥損傷的作用。

無論此刻的你是在大雪紛飛的冬夜里，還是星光閃耀的星空下，愿你身邊有愛人，手旁有酒，微微醺然，心暖而安。圣誕節(jié)快樂。

本文結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組中NF-κB和MAPK 均上調(diào)，而與模型組相比，丁基苯酞顯著下調(diào)NF-κB 及其下游抗氧化劑反應元件MAPK（P＜0.05），提示miR-548a-5p 的表達水平在模型組大鼠心肌組織樣本中上調(diào)，丁基苯酞顯著下調(diào)miR-548a-5p 的表達水平，提示給予NF-κB/MAPK 信號轉(zhuǎn)導通路抑制劑能夠干預丁基苯酞抑制miR-548a-5p 的表達，推測丁基苯酞抑制miR-548a-5p 的表達而調(diào)控NF-κB 參與心力衰竭患者房顫發(fā)生發(fā)展。

嚴重的心房纖維化可產(chǎn)生異常的電生理特征，包括心肌傳導速度減慢和傳導阻滯，最終導致心房顫動，尤其是在心力衰竭的過程中。因此，抗纖維化治療在心房顫動的上游治療中起著重要作用。結(jié)果顯示，假手術(shù)組左心房Masson 三色染色顯示輕度纖維化，模型組左心房纖維化嚴重，肌原纖維廣泛斷裂，心肌細胞明顯肥大，提示丁基苯酞可減輕心肌梗死心力衰竭大鼠心房重構(gòu)和纖維化。因此，丁基苯酞有望成為上游治療心房顫動的有效藥物。

綜上所述，丁基苯酞可通過抑制miR-548a-5p 的表達，直接調(diào)控NF-κB，進而減少了心力衰竭發(fā)生的風險。