復(fù)合乳酸菌發(fā)酵改性姜渣膳食纖維

杜京京，楊松，朱倩，伍玉菡，郭家剛，江艦

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，安徽 合肥 230001）

膳食纖維（dietary fiber，DF）主要是植物的細(xì)胞壁多糖，不能被人體消化道的內(nèi)源酶消化[1]。膳食纖維通常分為可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF），主要包括纖維素、木質(zhì)素和非淀粉多糖[2]（如半纖維素、果膠和阿拉伯木聚糖低聚糖）。膳食纖維在人體小腸內(nèi)不能被消化吸收，故其能夠以基本完整的形式進(jìn)入結(jié)腸，從而增加糞便的黏度和體積[3]。飲食干預(yù)研究表明，補(bǔ)充膳食纖維可以有益地改變腸道的微生物群，保護(hù)腸道屏障功能，對維持機(jī)體正常生理功能具有重要作用[4-5]。

生姜（Zingiber officinale Roscoe）是姜科植物，在世界各地被用作香料[6]、調(diào)味品[7]和傳統(tǒng)草藥[8]。生姜中主要含有淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)、纖維素、維生素等多種成分[9]。生姜加工過程中剩余的姜渣中含大量的膳食纖維，但由于主要成分是不溶性膳食纖維，姜渣與蛋白、淀粉等結(jié)合程度較差，不利于作為食品原料進(jìn)行加工，從而導(dǎo)致其利用率較低。通過利用酸堿化學(xué)法[10]、酶法[11]、生物發(fā)酵法[12]等方法對果蔬殘?jiān)M(jìn)行改性處理，可以有效提高果蔬殘?jiān)锌扇苄陨攀忱w維含量，增加了果蔬殘?jiān)鳛槭称吩系目刹僮餍訹13]。微生物發(fā)酵法改性果蔬殘?jiān)猩攀忱w維是一種相對高效且低成本的手段[14]。因此，本文采用保加利亞乳酸桿菌和嗜熱鏈球菌復(fù)合菌種發(fā)酵改性姜渣膳食纖維，以提高姜渣中可溶性膳食纖維的含量，制備高品質(zhì)的姜渣膳食纖維，提高姜渣的利用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)材料與試劑

山東泥姜：市售；脫脂奶粉：雀巢（中國）有限公司；果葡糖漿：邢臺平安糖業(yè)有限公司；保加利亞乳酸桿菌、嗜熱鏈球菌（商業(yè)凍干粉100億cfu/g，食品級）：鄭州百益寶生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)備

破壁機(jī)（L12-Y3）：九陽股份有限公司；紗布：常州富羽萊貿(mào)易有限公司；智能恒溫培養(yǎng)箱（HW-80）：遼寧賽亞斯科技有限公司；電熱恒溫干燥箱（DHG-9203A）：甘易儀器設(shè)備（上海）有限公司；高壓滅菌鍋（BKQ-B50II）：鑫貝西科學(xué)儀器（山東）有限公司；高速離心機(jī)（TGL-16）：浙江納德科學(xué)儀器有限公司；X射線衍射（X’Pert MP）：荷蘭Nalytical公司；掃描電鏡（SU8220）：日本日立公司；固體核磁共振（Bruker AVANCE III 400 WB）：瑞士布魯克公司。

1.2 姜渣發(fā)酵過程

取一定量的山東泥姜，切碎。稱取500 g姜碎和2 000 mL 蒸餾水，用破壁機(jī)攪碎（20 min），煮沸 5 h，用紗布（4層）過濾。過濾后得到的姜渣在60℃下干燥48 h。稱取干燥姜渣5.0 g和蒸餾水按照一定的料液比調(diào)配均勻，將脫脂奶粉1.0 g和果葡糖漿1.0 g加入到液料中，攪拌溶解，裝于發(fā)酵罐中，置于高壓滅菌鍋中，120℃滅菌20 min。冷卻后，接種2%保加利亞乳酸桿菌和嗜熱鏈球菌（1∶1，質(zhì)量比），在一定條件下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，加入樣本3倍體積的95%乙醇，靜置12 h，過濾并收集濾渣。將濾渣在60℃下干燥24 h，即得到改性后的姜渣。

1.3 單因素試驗(yàn)

根據(jù)GB 5009.88—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中膳食纖維的測定》[15]，以姜渣中可溶性膳食纖維（SDF）得率為考察指標(biāo)，分別對發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、料液比3個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。初步確定復(fù)合菌種發(fā)酵姜渣的最佳工藝條件。

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵工藝提高姜渣SDF得率

采用Design-Expert 12.0軟件中Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，根據(jù)前期試驗(yàn)研究結(jié)果，選取發(fā)酵時(shí)間（A）、發(fā)酵溫度（B）和料液比（C）3個(gè)條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，試驗(yàn)安排見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平Table 1 The factors and levels of response surface for ginger dregs

1.5 發(fā)酵對姜渣加工性能及結(jié)構(gòu)的影響

1.5.1 姜渣持水力的測定

取發(fā)酵前后的姜渣各1.00 g分別置于100 mL燒杯中，分別加入50 mL蒸餾水，在室溫（27℃）下用磁力攪拌器攪拌30 min，4 000 r/min離心20 min，除去上層水分，稱取殘留物的質(zhì)量（g），按照式（1）計(jì)算持水力，并比較兩者之間持水力的變化。

1.5.2 姜渣溶脹力測定

取發(fā)酵前后的姜渣各1.00 g，加入20 mL量筒中，搖動樣品，使其在量筒中平鋪均勻，記錄下此時(shí)干樣品的體積（mL），分別加入10 mL蒸餾水，均勻振蕩后，在室溫（25℃）下靜置24 h后，分別記錄此時(shí)樣品的體積（mL），比較兩者溶脹力的變化并按式（2）計(jì)算。

1.6 發(fā)酵對姜渣的形貌及結(jié)構(gòu)的影響

1.6.1 光學(xué)顯微鏡（optical microscope，OPM）觀察

取少量發(fā)酵前后的姜渣置于凹槽載玻片上，用乙醇∶甘油（2∶1，體積比）分散，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察。

1.6.2 掃描電鏡（scanningelectronmicroscope，SEM）觀察

取發(fā)酵前后的姜渣，用棉棒沾取少量，分別放于導(dǎo)電膠上，噴鍍，采用SEM觀察。

1.6.3 X-射線衍射（X-ray diffraction，XRD）測定

XRD的主要掃描參數(shù)如下：Cu靶，測試電壓40kV，電流 40 mA；掃描速度 2°/min，掃描范圍 3°～40°。

1.6.413C固體核磁共振波譜（solid-state nuclear magnetic resonance spectrometer，CP MAS NMR）測試

13C CP MAS NMR測試的操作頻率為75.5 MHz。樣品放入4 mm的ZrO2回轉(zhuǎn)管中，轉(zhuǎn)速是5 kHz，補(bǔ)償時(shí)間20 ms，接觸時(shí)間1 ms，2個(gè)脈沖之間延遲3 ms。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均平行測定3次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示最終的結(jié)果。數(shù)據(jù)采用origin 9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert 12.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵溫度對姜渣中SDF得率的影響

準(zhǔn)確稱取5.0 g未發(fā)酵的姜渣置于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)液中，在發(fā)酵液料中加入2%的發(fā)酵劑，然后分別在38、40、42、44、46 ℃的培養(yǎng)溫度下培養(yǎng) 48 h，測定 SDF得率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 發(fā)酵溫度對姜渣中SDF得率的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on the yield of SDF in ginger dregs

由圖1可知，隨著發(fā)酵溫度的逐漸升高，SDF得率不斷增加，當(dāng)發(fā)酵溫度為42℃時(shí)，姜渣中SDF得率達(dá)到最大。發(fā)酵溫度繼續(xù)增加，SDF得率顯著下降，這可能是因?yàn)檫^高的發(fā)酵溫度抑制了復(fù)合菌種的反應(yīng)活性。因此，選擇42℃為最佳發(fā)酵溫度。

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對姜渣中SDF得率的影響

準(zhǔn)確稱取5.0 g未發(fā)酵的姜渣置于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)液中，在發(fā)酵液料中加入2%的發(fā)酵劑，在42℃下分別培養(yǎng) 24、36、48、60、72、84 h，測定 SDF 得率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對姜渣中SDF得率的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the yield of SDF in ginger dregs

由圖2可知，姜渣中SDF得率隨發(fā)酵時(shí)間的增加先增加后減少，在48 h達(dá)到最大值。處于較短的發(fā)酵時(shí)間時(shí)，菌種處于生長期，菌種的數(shù)量和活力均較低。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，菌種生長到達(dá)穩(wěn)定期，姜渣中SDF得率逐漸達(dá)到最大值。持續(xù)發(fā)酵后，菌種的活力下降，發(fā)酵產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物不斷增加，部分SDF被分解，造成得率下降。因此，選擇48h為最佳的發(fā)酵時(shí)間。

2.1.3 料液比對姜渣中SDF得率的影響

按照料液比 1∶3、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）將未發(fā)酵的姜渣與發(fā)酵液混合，分別在液料中加入2%的發(fā)酵劑，在42℃下培養(yǎng)48 h，測定SDF得率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對姜渣中SDF得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of SDF in ginger dregs

由圖3可知，隨著溶劑添加量增加，菌種與姜渣的接觸更加充分，姜渣中SDF得率增加，在料液比為1∶15（g/mL）時(shí)達(dá)到最大值。但當(dāng)溶劑添加量大于1∶10（g/mL）后，姜渣中SDF的含量變化趨勢平緩后下降，可能是由于隨著水體積的繼續(xù)增大，反應(yīng)底物被稀釋。因此，選擇1∶10（g/mL）為最佳發(fā)酵液料比。

2.1.4 響應(yīng)面結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、料液比3個(gè)因素的最優(yōu)試驗(yàn)條件，采用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對姜渣發(fā)酵條件進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，包括17個(gè)析因試驗(yàn)和5個(gè)中心試驗(yàn)。運(yùn)用Design-Expert 12.0軟件中Box-Behnken程序?qū)Ω鱾€(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，試驗(yàn)結(jié)果見表2。利用ANOVA分析表2數(shù)據(jù)，結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及相應(yīng)結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and the experimental results

表3 回歸方程中回歸系數(shù)的估計(jì)值及方差分析Table 3 Results of the Box-Behnken design regression analysis

該試驗(yàn)回歸方程為：R1=9.412+0.05125A+0.03375B+0.032 5C-0.017 5AB+0.005AC+0.035BC-0.099 75A2-0.247 5B2-0.176 725C2。

該模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=99.63%，說明回歸方程的擬合程度良好，失擬較小，可以用該方程進(jìn)行模擬分析。失擬項(xiàng)的P=0.127 5，沒有顯著性影響，信噪比為15.838遠(yuǎn)大于4，說明數(shù)據(jù)中沒有異常點(diǎn)，回歸方程擬合度和可信度較高，模型適當(dāng)。

通過表3中P值可知：方程中A2、B2、C2對SDF得率的影響達(dá)到極顯著水平，BC、AB為影響顯著，表明試驗(yàn)因子的二次項(xiàng)對響應(yīng)值影響較大，這和模型回歸中的線性和平方項(xiàng)影響顯著相對應(yīng)。當(dāng)姜渣SDF得率最大時(shí)，A=0.021；B=0.01；C=0.01；從而分析得到姜渣發(fā)酵的最佳工藝條件為發(fā)酵溫度42.02℃，發(fā)酵時(shí)間48.01 h，料液比 1∶10.01（g/mL），得到姜渣 SDF 得率為9.416%。根據(jù)實(shí)際操作性，發(fā)酵工藝采用發(fā)酵溫度42 ℃、發(fā)酵時(shí)間 48 h、料液比 1∶10（g/mL），實(shí)際測得SDF得率為9.42%，兩者相對誤差很小。因此，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得的最佳工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

各個(gè)因子交互作用的響應(yīng)面的3D和等值線分析如圖4～圖6所示。

圖4 發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對SDF得率響應(yīng)面分析Fig.4 The analysis on response surface of fermentation time and fermentation temperature

圖5 發(fā)酵時(shí)間和料液比對SDF得率響應(yīng)面分析Fig.5 The analysis on response surface of fermentation time and solid-liquid ratio

圖6 發(fā)酵溫度和料液比對SDF得率響應(yīng)面分析Fig.6 The analysis on response surface of fermentation temperature and solid-liquid ratio

由圖4可知，圖形略呈橢圓形，說明發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度的具有一定的交互作用。發(fā)酵溫度的軸向等高線變化比發(fā)酵時(shí)間軸向等高線的變化相對密集。因此，發(fā)酵溫度對響SDF得率的影響較發(fā)酵時(shí)間影響大。

由圖5可知，當(dāng)發(fā)酵溫度位于中心水平時(shí)，圖形呈圓形，發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度的交互作用不強(qiáng)。

由圖6可知，圖形呈現(xiàn)橢圓形，說明發(fā)酵時(shí)間和料液比的交互作用顯著。發(fā)酵溫度的軸向等高線的密集程度顯著高于料液比軸向等高線的變化。因此，發(fā)酵溫度對SDF得率的影響較料液比影響大。

2.2 發(fā)酵對姜渣加工性能及結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 發(fā)酵對姜渣持水力和溶脹力的影響

發(fā)酵對姜渣持水力和溶脹力的影響如表4所示。

表4 發(fā)酵對姜渣的膨脹力和持水力的影響Table 4 Effect of fermentation on swelling power and water holding capacity of ginger dregs

由表4可知，發(fā)酵后姜渣的膨脹力和持水力分別增加了35.96%和9.97%。姜渣中含有大量的膳食纖維素。這些膳食纖維素存在著無定形區(qū)，當(dāng)吸水后，無定區(qū)變大，膳食纖維表現(xiàn)出膨脹。膳食纖維的大分子中含有許多—OH，可以與H2O分子形成配位鍵，形成持水力。發(fā)酵后姜渣的膨脹力和持水力均提高，說明發(fā)酵促使姜渣中形成了更多聚合度低、具有無定型結(jié)構(gòu)的可溶性膳食纖維，同時(shí)，姜渣膳食纖維的結(jié)構(gòu)更加疏松，更多親水基團(tuán)（如—OH）暴露出來。姜渣的持水力增加，加工性能提升，可用于食品工業(yè)中食品品質(zhì)改性，如改善食品黏度與質(zhì)構(gòu)特性等。

2.2.2 發(fā)酵對姜渣結(jié)構(gòu)的影響

在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)酵對姜渣結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果如圖7所示。

圖7 姜渣發(fā)酵前和發(fā)酵后的顯微鏡圖片（20×20倍）Fig.7 The microscope images of ginger dregs before fermentation and after fermentation

從圖7可以看出，發(fā)酵前姜渣中的纖維素等交錯(cuò)重疊，呈現(xiàn)面積較大的團(tuán)聚物。發(fā)酵后，團(tuán)聚物體積減小，纖維結(jié)構(gòu)的交錯(cuò)減少，碎片結(jié)構(gòu)增加。發(fā)酵促使姜渣的團(tuán)聚減小、比表面積增大，增加了纖維中的親水基團(tuán)暴露率，提高姜渣的持水力和膨脹力。

2.2.3 發(fā)酵對姜渣微觀結(jié)構(gòu)的影響

在掃描電鏡下觀察發(fā)酵對姜渣微觀結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果如圖8所示。

圖8 姜渣發(fā)酵前后的SEM圖片F(xiàn)ig.8 SEM images of ginger dregs before and after fermentation

圖8A1～A2顯示了未發(fā)酵的姜渣有完整清晰的纖維結(jié)構(gòu)，纖維聚集在一起，形成網(wǎng)絡(luò)空腔結(jié)構(gòu)，團(tuán)聚的顆粒表面也具有大量褶皺。圖8B1～B2顯示，發(fā)酵在一定程度上分解了姜渣纖維的微結(jié)構(gòu)、切斷其大分子結(jié)構(gòu)，形成了分子量較小、鏈長較短的結(jié)構(gòu)。圖8B2顯示發(fā)酵后姜渣中的物質(zhì)干燥后粘結(jié)成片層狀，說明水溶性物質(zhì)增多，樣品干燥后更易粘結(jié)。

2.2.4 發(fā)酵對姜渣晶體結(jié)構(gòu)的影響

在XRD下觀察發(fā)酵對姜渣晶體結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果如圖9所示。

圖9 姜渣發(fā)酵前后的XRD圖片F(xiàn)ig.9 XRD pictures of ginger dregs before and after fermentation

圖9顯示，姜渣發(fā)酵后，14°和16°左右的峰消失，說明姜渣中體積較大的晶體結(jié)構(gòu)減少。20°和22°的峰的分辨率下降，說明發(fā)酵后姜渣中無定型物質(zhì)（如SDF等）增加。

2.2.5 發(fā)酵對姜渣13C CP MAS NMR圖譜的影響

在13C CP MAS NMR下觀察發(fā)酵對姜渣晶體結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果如圖10所示。

圖10 姜渣發(fā)酵前后的13C CP MAS NMR圖片F(xiàn)ig.10 13C CP MAS NMR images of ginger dregs before and after fermentation

由圖10可知，發(fā)酵前姜渣的結(jié)構(gòu)中C1的信號峰位于 92×10-6～108×10-6；C2、C3 和 C5 的信號峰出現(xiàn)在65×10-6～75×10-6之間；C4 和 C6 的信號峰則分別位于75×10-6～85×10-6和 55×10-6～62×10-6處。發(fā)酵對姜渣的核磁共振圖譜的分辨率的差異主要在C1位置。姜渣經(jīng)過發(fā)酵處理后，C1位置出現(xiàn)了兩個(gè)顯著的峰形，說明發(fā)酵后纖維的聚集程度降低，結(jié)構(gòu)更加松散，原本重疊的信號峰被區(qū)分出來。

3 結(jié)論

采用接種2%復(fù)合菌種，發(fā)酵制備姜渣SDF的最佳工藝參數(shù)如下：發(fā)酵溫度42℃、發(fā)酵時(shí)間48 h、料液比1∶10（g/mL），該條件下發(fā)酵姜渣中SDF的得率為9.42%。發(fā)酵后的姜渣的SDF含量顯著提升，膨脹力和持水力增加。通過顯微觀察和結(jié)構(gòu)測定發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后姜渣的表面結(jié)構(gòu)改變，無定型物質(zhì)增多，膳食纖維結(jié)構(gòu)更加規(guī)整。乳酸菌復(fù)合發(fā)酵法可以提高姜渣中SDF的含量，但是對于發(fā)酵后姜渣膳食纖維的物質(zhì)組成及結(jié)構(gòu)變化有待進(jìn)一步研究。