固態(tài)發(fā)酵黑洋蔥多糖對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟和腎臟的保護(hù)

李躍華，周寧，王麗媛，云月英，寧月寶*

（1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.包頭市腫瘤醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

根據(jù)統(tǒng)計(jì)，在中國(guó)約有1.1億糖尿病患者，還有約600萬(wàn)處于糖尿病前期[1-3]。因?yàn)?型糖尿病患者發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，常伴隨著腎臟、肝臟、心臟和血管等多個(gè)器官功能的衰竭，糖尿病最主要的并發(fā)癥為糖尿病肝病和糖尿病腎病，主要癥狀為長(zhǎng)期的高血糖、高血壓和蛋白尿，嚴(yán)重時(shí)將惡化為肝硬化和腎衰竭，嚴(yán)重危害人類健康，尚無(wú)根治藥物。近年來(lái)科研人員發(fā)現(xiàn)，從天然藥用植物中提取出的植物多糖可以產(chǎn)生良好的降血糖效果[6-8]，且此類藥物對(duì)比當(dāng)前糖尿病臨床藥物來(lái)講無(wú)毒副作用，開發(fā)潛力大，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[9-10]。黑洋蔥是將新鮮的洋蔥在特殊條件下發(fā)酵30 d制得的食品[11]?？梢员Ａ粞笫[的營(yíng)養(yǎng)成分，減少刺激性氣味，提升洋蔥的口感，并且有效活性成分含量顯著提高[12]。本實(shí)驗(yàn)以黑洋蔥中提取的粗多糖為研究對(duì)象，探究黑洋蔥粗多糖對(duì)2型糖尿病SD大鼠的降血糖和降血脂效果。

將新鮮洋蔥放置在恒溫恒濕發(fā)酵箱中，讓其自然發(fā)酵4周，洋蔥發(fā)酵過程中的顏色逐漸變黑，是因?yàn)樯闪祟惡谒兀l(fā)生了美拉德反應(yīng)。黑洋蔥與洋蔥相比有效成分明顯提高，黑洋蔥粗多糖具有較強(qiáng)活性功能，如抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫力等，研究表明，黑洋蔥多酚具有清除機(jī)體自由基、增加抗氧化酶活性、減少衰老細(xì)胞堆積和增強(qiáng)細(xì)胞再生能力等重要作用[22]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮洋蔥：市售；SD大鼠（體重270 g～300 g，雄性）：斯貝福北京生物技術(shù)有限公司；四氧嘧啶：博美生物科技有限公司。

GA-3型血糖儀：三諾生物傳感股份有限公司；601超級(jí)恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；Laborota 4000 efficient旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)Heidolph公司；MDS-6G型多通量微波消解/萃取儀：上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；SHB循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；UV-7504紫外可見分光光度計(jì)、L-550大容量高速離心機(jī)、GZH-GF-101-3-5電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 黑洋蔥粗多糖的制備

（1）將發(fā)酵好的黑洋蔥放入50℃烘箱中干燥2周后取出。

（2）干燥的黑洋蔥在研磨缽中研磨成粉末，過60目篩，得到黑洋蔥粉。

（3）稱取20 g研磨后篩出的黑洋蔥粉末于500 mL燒瓶中，向燒瓶中注入20倍體積超純水，80℃水浴3h，3 000 r/min高速離心15 min去除其中的黑洋蔥粉末，留取上清，上述步驟進(jìn)行3次，獲得黑洋蔥的水提液，將3次獲得的水提液合并。

（4）將水提液移入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中使其濃縮至原體積的1/5。

（5）Sevage法除去黑洋蔥水提液中的蛋白質(zhì)，采用Sevage法[13-14]：三氯甲烷與正丁醇按體積比5∶1配制溶液，以濃縮提取液的1/5體積加入濃縮提取液中，將混合液120 r/min振蕩15 min使其混勻，充分混合后4 000 r/min離心10 min，取上清液體。

（6）用玻璃棒攪拌注入上清液3倍體積的95%乙醇溶液，4℃放置16 h，使黑洋蔥粗多糖沉淀。

（7）4 200 r/min離心 15 min，倒掉上清液，固體沉淀用無(wú)水乙醇與丙酮各清洗3次，置于50℃烘箱中干燥12 h。

（8）將干燥后的沉淀取出，研磨成粉末，即得黑洋蔥粗多糖粉末[15]，黑洋蔥粗多糖提取率采用下式計(jì)算。

1.2.2 蒽酮-硫酸法葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取80 mL濃硫酸，注入少量超純水將其定容到100 mL。避光環(huán)境下稱取分析純蒽酮0.1 g，加入配制好的80%硫酸溶液100 mL并不斷攪拌，使其溶于硫酸溶液中，完全溶解后放置于棕色瓶中待用，現(xiàn)用現(xiàn)配。

（1）取適量的分析純葡萄糖藥品于鼓風(fēng)干燥箱中105℃干燥2 h。精確稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖藥品100 mg，以少量超純水溶解后定容至100 mL得到濃度為1 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液。

（2）用移液器分別精確取上述配制好的1 mg/mL葡萄糖對(duì)照品溶液 0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL 于100 mL容量瓶中，7只瓶各注入超純水定容至100 mL。

用移液器精確吸取配制的濃度呈階梯狀葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0 mL于10 mL試管中，向7只試管中各加入蒽酮硫酸溶液6 mL，將各試管沸水浴加熱15 min，之后立即置于冰水浴中15 min。

（3）以加入0.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的溶液為空白，每組做3次平行試驗(yàn)取平均值。記錄各組溶液在625 nm波長(zhǎng)處的吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制蒽酮-硫酸法葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 多糖含量的測(cè)定

以黑洋蔥粗多糖作溶質(zhì)，超純水作溶劑配制溶液。使用分光光度計(jì)測(cè)得黑洋蔥粗多糖溶液在625 nm處的吸光度，根據(jù)蒽酮-硫酸法葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算所得黑洋蔥粗多糖中的多糖含量。

1.2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 SD大鼠高血糖模型的建立

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組，隨機(jī)分為對(duì)照組10只和實(shí)驗(yàn)組30只，并測(cè)得平均體重為270 g。在避光環(huán)境下，取四氧嘧啶1.3 g置于棕色瓶中，向棕色瓶?jī)?nèi)加入65 mL生理鹽水，反復(fù)吹打至溶解，即配制完成濃度為2%的四氧嘧啶溶液，將所有SD大鼠禁食不禁水12 h后，給建模組的SD大鼠腹腔注射四氧嘧啶溶液，劑量為180 mg/kg[16-17]，腹腔注射結(jié)束72 h后將SD大鼠禁食不禁水12 h，測(cè)定SD大鼠的空腹血糖值，空腹血糖濃度大于7.0 mmol/L的SD大鼠視為建模成功[19-20]。正常對(duì)照組SD大鼠的腹腔注射等量的生理鹽水[18]。

1.2.4.2 測(cè)定SD大鼠血糖值并分組

隨機(jī)選取10只建模成功的SD大鼠作為模型組。測(cè)定血糖后，按照血糖濃度的差異將剩余糖尿病大鼠分為中高血糖組與高血糖組，血糖值在7.0 mmol/L～15.0 mmol/L的10只為中高血糖組，15.0 mmol/L以上的10只記為高血糖組。

1.2.4.3 SD大鼠灌胃及生化指標(biāo)檢測(cè)

每天用發(fā)酵黑洋蔥粗多糖溶液給大鼠灌胃，持續(xù)4周，各組具體給藥情況見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠分組及給藥情況Table 1 Grouping and administration of experimental rats

灌胃實(shí)驗(yàn)開始后，分別在第7、14、21、28天測(cè)SD大鼠的晨起空腹血糖值，共計(jì)4次，記錄數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。測(cè)試后的大鼠進(jìn)行麻醉處死，動(dòng)脈取血進(jìn)行生化指標(biāo)的檢測(cè)。然后將大鼠解剖后取肝臟以及腎臟組織進(jìn)行病理檢測(cè)。用含有促凝劑的生化負(fù)壓管對(duì)大鼠進(jìn)行股動(dòng)脈取血，取血后待血液自然凝固，于4℃、4 000 r/min離心10 min得到血清，后置于4℃冰箱中冷藏備用。采用日立全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行肝功能、腎功能、血脂水平的檢測(cè)。

1.2.4.4 標(biāo)本制備

解剖取血后大鼠的肝臟以及腎臟。取出的肝臟以及腎臟用4℃生理鹽水進(jìn)行清洗處理，清洗后的組織置于多聚甲醛溶液中，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。包埋切片，將組織從多聚甲醛中取出，置于通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行修整處理。修整后的組織采用濃度75%、85%、90%、95%的乙醇溶液進(jìn)行脫水處理，脫水時(shí)間分別為4、3、2、1 h。之后按照如下脫水劑及脫水時(shí)間依次處理：無(wú)水乙醇（30 min、30 min）、醇苯（10 min）、二甲苯（10 min、10 min）、蠟（1 h、1 h、1 h）。將融化的蠟置于包埋框中，迅速將脫水處理后的組織置于包埋框中，待蠟?zāi)毯笾糜谇衅瑱C(jī)中切成4 μm厚的薄片。利用蘇木精-伊紅染色法，使組織切片伊紅染色與脫水：在切好的組織切片中加入伊紅染液并且充分染色3 min。染色完成后的組織切片經(jīng)80%乙醇溶液（5 s），95%乙醇溶液（2 min），無(wú)水乙醇（2 min）進(jìn)行脫水處理。脫水后的組織切片在二甲苯中浸泡4 min，持續(xù)2次，然后將組織切片進(jìn)行風(fēng)干處理，并使用中性樹脂封片。

1.2.4.5 SD大鼠生化指標(biāo)水平的檢測(cè)數(shù)據(jù)

對(duì)大鼠進(jìn)行采血，離心取得血液的上清液，測(cè)大鼠血清中的谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、甘油三酯（triglyceride，TG）、血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白膽固醇 (high-density lipoprotein，HDLC)、肌酐（creatinine，Cre），之后對(duì)血脂指標(biāo)進(jìn)行 t檢驗(yàn)用以檢查其是否具有顯著性差異。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析[21]。各組數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均值比較采用t檢驗(yàn)分析方法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒽酮-硫酸法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

蒽酮-硫酸法繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=8.431 4x-0.040 5。R2為 0.992 6。

2.2 黑洋蔥粗多糖提取率

用200 g黑洋蔥粉末提取粗多糖，得到黑洋蔥粗多糖23.35 g，即黑洋蔥粗多糖提取率為11.68%。

2.3 多糖含量的測(cè)定結(jié)果

取樣品黑洋蔥粗多糖稀釋處理后，于625 nm處測(cè)定吸光度，其吸光度為0.7，根據(jù)蒽酮-硫酸法測(cè)得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出多糖含量為8.7 mg/100 mL。

2.4 SD大鼠血糖水平的變化

大鼠灌胃持續(xù)4周，灌胃前后血糖值變化見表2。

表2 灌胃前后大鼠血糖水平Table 2 Blood glucose levels of rats before and after gavage

對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃黑洋蔥粗多糖4周后可觀察到，中高血糖組大鼠血糖值下降，有極顯著差異（P<0.01）。

2.5 SD大鼠灌胃前后生化指標(biāo)變化

大鼠灌胃持續(xù)4周，灌胃前后生化指標(biāo)變化如表3。

表3 灌胃前后生化指標(biāo)變化Table 3 Changes of biochemical indexes before and after gavage

對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃黑洋蔥粗多糖4周后可觀察到中高血糖組、高血糖組中AST、ALT與模型組相比明顯降低（P<0.01），說(shuō)明對(duì)肝臟功能有明顯效果。中高血糖組、高血糖組中CRE水平比模型組相比明顯降低（P<0.01），說(shuō)明對(duì)腎臟功能有效果。TG、TC、LDL水平升高，HDL-C水平降低是高脂血癥指標(biāo)，高脂血癥能夠引起糖尿病、脂肪肝、腦血栓等疾病，經(jīng)過對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃黑洋蔥粗多糖4周后可觀察到中高血糖組、高血糖組中 TG、TC、LDL-C 數(shù)值降低（P<0.01），HDL-C 數(shù)值升高（P<0.01），有極顯著差異，說(shuō)明高脂血癥和糖尿病得到一定恢復(fù)。

2.6 黑洋蔥粗多糖對(duì)2型糖尿病大鼠肝組織病理切片的影響

圖2為對(duì)照組、模型組、中高血糖組以及高血糖組大鼠肝臟的病理切片圖。

圖2 各組大鼠肝臟組織病理切片分析Fig.2 Histopathological analysis of liver tissues of rats in each group

由圖2可知，對(duì)照組肝細(xì)胞形態(tài)正常、排列規(guī)則、組織結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)清晰、無(wú)明顯病理變化。而模型組大鼠的肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯的水腫、組織結(jié)構(gòu)紊亂、排列不規(guī)則。中高血糖組大鼠的肝細(xì)胞形態(tài)正常、排列規(guī)則，與對(duì)照組相似。高血糖組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)有一定的恢復(fù)，但排列較亂，并且仍可見少量的細(xì)胞發(fā)生脂肪性病變。

模型組大鼠的肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯的水腫、排列不規(guī)則，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，中央靜脈縮小結(jié)構(gòu)模糊。黑洋蔥粗多糖對(duì)中高血糖組和高血糖組大鼠的肝臟組織均呈現(xiàn)出不同程度的保護(hù)作用。根據(jù)對(duì)對(duì)照組、模型組、中高血糖組、高血糖組的肝臟病理切片觀察與對(duì)比，可明顯看出中高血糖組肝臟細(xì)胞恢復(fù)正常，高血糖組肝臟細(xì)胞有一定程度的改善，表明黑洋蔥粗多糖對(duì)肝臟可產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。

2.7 黑洋蔥粗多糖對(duì)2型糖尿病大鼠腎組織病理切片的影響

圖3為對(duì)照組、模型組、中高血糖組以及高血糖組大鼠腎臟組織病理。

圖3 各組大鼠腎臟組織病理切片分析Fig.3 Pathological section analysis of renal tissue of rats in each group

對(duì)照組腎小球大小正常、各細(xì)胞核清晰、結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞大小均勻。模型組大鼠的腎小球形態(tài)不完整，腎小球上皮細(xì)胞空泡樣變性。中高血糖組大鼠腎小球基本正常，與對(duì)照組相似。高血糖組大鼠腎小球形態(tài)較完整，但腎小囊與對(duì)照組相比較腫大。

但從黑洋蔥粗多糖灌胃的中高糖組以及高糖組大鼠的生化指標(biāo)來(lái)看，相比于模型組大鼠，肌酐已經(jīng)顯著降低。病理學(xué)分析也顯示，中高血糖組大鼠腎小球基本正常，與對(duì)照組相似。高血糖組大鼠腎小球形態(tài)較完整，這說(shuō)明黑洋蔥粗多糖對(duì)糖尿病大鼠的腎臟組織具有一定的保護(hù)和修復(fù)作用。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了黑洋蔥粗多糖對(duì)2型糖尿病大鼠降血糖和降血脂的研究，連續(xù)4周對(duì)高血糖大鼠灌胃黑洋蔥粗多糖，發(fā)現(xiàn)其有良好的降血糖及降血脂效果，其中，中高血糖組大鼠血糖值恢復(fù)至正常水平；高血糖組大鼠血糖下降明顯。中高血糖組、高血糖組中AST、ALT與模型組相比差異極顯著（P<0.01），說(shuō)明肝臟功能得以恢復(fù)。中高血糖組、高血糖組中CRE數(shù)值比模型組相比差異極顯著（P<0.01），中高血糖組、高血糖組中TG、TC、LDL-C數(shù)值與模型組相比差異極顯著（P<0.01），HDL-C數(shù)值與模型組相比差異極顯著（P<0.01），說(shuō)明高脂血癥和2型糖尿病得到一定的恢復(fù)。黑洋蔥粗多糖能顯著降低由四氧嘧啶誘導(dǎo)的高血糖大鼠的血糖及血脂。

綜上所述，洋蔥粗多糖灌胃高糖高脂2型糖尿病大鼠，可顯著改善大鼠肝臟和腎臟的結(jié)構(gòu)和功能。黑洋蔥粗多糖可治療高脂高糖引起的2型糖尿病。但目前機(jī)理尚不明確，今后需要進(jìn)一步的機(jī)理研究。