不同品種柑橘果實(shí)的類黃酮分離純化及其抗氧化活性研究

朱泰霖，王慧心，陳杰標(biāo)，王岳，曹錦萍，李鮮，孫崇德

（浙江大學(xué)果實(shí)品質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝植物生長發(fā)育與品質(zhì)調(diào)控重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/園藝產(chǎn)品冷鏈物流工藝與裝備國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室/園藝植物整合生物學(xué)研究與應(yīng)用浙江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058）

柑橘（Citrusspp.）是蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（Citrus）植物，在我國擁有悠久的種植歷史和豐富的種質(zhì)資源。如今，我國柑橘種植逐漸趨于規(guī)?；?，柑橘加工業(yè)也在不斷發(fā)展。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界柑橘總產(chǎn)量的33%被用于果汁生產(chǎn)，而商業(yè)衍生產(chǎn)品（如鮮榨果汁、脫水產(chǎn)品、果醬和調(diào)味劑）需消耗大量果實(shí)并產(chǎn)生大量廢棄物。由加工業(yè)產(chǎn)生的柑橘廢料估計(jì)超過6 000 萬t/a，其中柑橘果皮占比為40%～50%[1-3]。而柑橘果皮中富含的胡蘿卜素、精油、果膠、類黃酮、檸檬苦素等生物活性物質(zhì)，具有抗氧化[4]、抗過敏[5]、抗炎[6]、抗癌[7-8]、降血壓[9]、降血脂[9-10]等生物活性。對柑橘果皮等加工廢棄物進(jìn)行合理利用，既可減少產(chǎn)品浪費(fèi)，避免對環(huán)境污染，又可用于天然活性成分的研究開發(fā)。

柑橘類黃酮是柑橘中一種多酚類次生代謝產(chǎn)物，種類多樣，具有品種特異性和組織特異性；通常，柑橘果皮中的類黃酮含量高于果肉[11]。迄今已從柑橘中鑒定出250多種類黃酮[12]。根據(jù)類黃酮的基本結(jié)構(gòu)、官能團(tuán)種類及位置，柑橘中的類黃酮主要有以下7 類：黃烷酮、黃酮、黃酮醇、黃烷醇、多甲氧基黃酮、異黃酮和花色苷[13]。雖然類黃酮在不同柑橘品種中存在種類及含量上的差異，但黃烷酮和多甲氧基黃酮是柑橘中最重要的類黃酮[14]。在不同柑橘品種中，黃烷酮的種類和含量差異較大：在柚類果皮中，含量最為豐富的是柚皮苷，而在葡萄柚果皮中，除柚皮苷外，還有較多的橙皮苷、新橙皮苷、圣草次苷、新圣草次苷等；在寬皮柑橘中，橘類中的主要黃烷酮為柚皮蕓香苷和橙皮苷，其中橙皮苷含量遠(yuǎn)高于柚皮蕓香苷；在橙類中，酸橙中主要的黃烷酮是柚皮苷與新橙皮苷，而在甜橙中占主導(dǎo)地位的則是柚皮蕓香苷和橙皮苷，且2 種物質(zhì)含量相近；柑類中的‘甌柑’則比較特殊，與其他柑橘品種相比，其主要的黃烷酮是新橙皮苷[15]。多甲氧基黃酮是一類特殊的類黃酮，主要分布在柑橘油胞中，而在果肉等其他果實(shí)組織中幾乎沒有[16]。柑橘中主要存在的多甲氧基黃酮為川陳皮素和橘皮素。有研究表明，與其他類黃酮相比，多甲氧基黃酮在溫州蜜柑等普通栽培品種中含量較少，但在‘甌柑’等特色果實(shí)中含量較高[17]。柑橘果實(shí)中的黃酮類化合物有抗氧化、抗癌、抗炎等功能，不同柑橘種類或品種果實(shí)中的黃酮類化合物因結(jié)構(gòu)不同，其抗氧化活性具有較大差異。黃烷酮組分和單體具有較強(qiáng)的自由基清除能力和金屬離子還原作用，而多甲氧基黃酮組分和單體僅在細(xì)胞評價(jià)體系中表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力，其化學(xué)抗氧化能力較弱[17]。本研究以柚類、葡萄柚類、甜橙類、酸橙類、橘類和柑類的代表性品種為材料，通過建立分段分離和半制備色譜純化方法，對不同品種柑橘果實(shí)的類黃酮提取物進(jìn)行純化，并對柑橘分段產(chǎn)物和單體進(jìn)行抗氧化評價(jià)，旨在為柑橘類黃酮的分離純化和開發(fā)利用提供技術(shù)儲(chǔ)備和支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所采用的6 個(gè)試驗(yàn)材料于2019 年采自浙江衢州、臺(tái)州、金華、溫州及湖北宜昌（表1）。果實(shí)采摘時(shí)均處于商品成熟期，于采收后24 h內(nèi)運(yùn)至浙江大學(xué)果樹科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室，挑選出大小相對一致、色澤均勻、無機(jī)械傷及病蟲害的果實(shí)，用清水進(jìn)行清洗，將果皮分離后立即在液氮中冷凍，然后于真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)冷凍干燥72 h，儲(chǔ)存于－40 ℃冰箱中，備用。

表1 果實(shí)材料、采收地點(diǎn)和采收日期Table 1 Fruit materials,harvest places and harvest dates

1.2 主要儀器與試劑

真空冷凍干燥機(jī)（FM 25EL-85，美國VirTis 公司），超聲波藥品處理機(jī)（JBT/C-YCL500T/3P，山東省濟(jì)寧市金百特電子有限責(zé)任公司），高速冷凍離心機(jī)（5810R，德國Eppendorf 公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Laborota 4000-efficient，德國Heidolph 公司），低溫冷卻循環(huán)泵（DLSB-2005，杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司），真空濃縮儀（Concentrator plus，德國Eppendorf公司），固相萃取柱（Sep-pak?C18，美國Waters 公司），固相萃取系統(tǒng)（SBAB-57265，美國Supelco 公司），超高效液相色譜系統(tǒng)（2695 泵-2996 二極管陣列檢測器，美國Waters 公司），超高效液相色譜（1290 Infinity，美國Agilent公司），三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)[Agilent 6460，電噴霧（electrospray ionization,ESI）離子源，美國安捷倫公司]，半制備型高效液相色譜儀（2535四元泵-2998二極管陣列檢測器-2707自動(dòng)進(jìn)樣器，美國Waters 公司），酶標(biāo)儀（Synergy H1，美國Biotek公司）。

試驗(yàn)中所用色譜級甲醇、乙腈購自美國Sigma-Aldrich公司，所用水均為雙蒸水，用于超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography,UPLC）及半制備型高效液相色譜（high performance liquid chromatography,HPLC）的樣品在進(jìn)樣前均經(jīng)過0.22 μm 過濾器過濾，其他分析級試劑均購自中國醫(yī)藥集團(tuán)（上海）股份有限公司，甜橙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品購自云南西力生物技術(shù)股份有限公司，新西蘭牡荊苷、野漆樹苷、圣草次苷、新圣草次苷、柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、異甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素、5-去甲基川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)品均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同品種柑橘果實(shí)類黃酮粗提液的制備

分別稱取6 個(gè)柑橘品種各50 g 冷凍干燥果皮粉末，按照料液質(zhì)量體積比1∶20 加入80%乙醇1 000 mL，超聲波輔助提取30 min，8 000 r/min 離心10 min，重復(fù)3 次后合并上清液。取1 mL 上清液置于真空濃縮儀上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無有機(jī)相溶液，溶于1 mL色譜級甲醇中，經(jīng)過濾膜過濾后用UPLC檢測鑒定類黃酮，重復(fù)3次。將剩余上清液于37 ℃條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以去除乙醇相，然后加水定容至600 mL。

1.3.2 柑橘類黃酮的UPLC 分析

利用Waters 2695-2996 型UPLC 系統(tǒng)進(jìn)行類黃酮分析，以Waters Acquity UPLC HSS T3（1.8 μm，2.1 mm×150 mm）液相色譜柱為固定相，流動(dòng)相為水（流動(dòng)相A）和乙腈（流動(dòng)相B）。梯度洗脫程序：0～0.5 min，2%～20%B；0.5～2.5 min，20%B；2.5～8.5 min，20%～28% B；8.5～10.5 min，28%～50% B；10.5～15.0 min，50%～98% B；15.0～15.5 min，98%～2% B；15.5～16.0 min，2% B。掃描波長為200～600 nm，流速為0.4 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣體積為2 μL。

將標(biāo)準(zhǔn)品用色譜級甲醇配成1 mg/mL 的母液，然后按20，2－1，2－2，…，2－78 個(gè)濃度梯度稀釋，各取2 μL 進(jìn)行UPLC 檢測。以峰面積為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 不同品種柑橘果實(shí)類黃酮分段產(chǎn)物的富集

首先進(jìn)行固相萃取柱的動(dòng)態(tài)試驗(yàn)，以確定不同品種柑橘果實(shí)的最佳上樣量、洗脫濃度和洗脫體積。用2 倍柱體積（bed volume, BV）甲醇將Seppak?C18 固相萃取柱活化，然后用5 BV 水將其平衡。上樣后用20 BV 的蒸餾水沖洗去雜，隨后用不同濃度的甲醇洗脫液對不同粗提液進(jìn)行洗脫，每個(gè)柑橘品種均可得到3 個(gè)不同組分的洗脫液。在37 ℃條件下，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將洗脫液蒸至無有機(jī)相，分別得到各分段產(chǎn)物粉末。

1.3.4 類黃酮的進(jìn)一步純化及鑒定

通過固相萃取柱對供試柑橘果實(shí)類黃酮進(jìn)行初步分離后，進(jìn)一步通過半制備型HPLC（2535四元泵-2998二極管陣列檢測器-2707自動(dòng)進(jìn)樣器）純化各分段產(chǎn)物粉末。

分段產(chǎn)物Ⅰ及分段產(chǎn)物Ⅱ的色譜條件。以SunFireTMprep C18 OBDTM 制備柱（5 μm，19 mm×250 mm）為固定相；流動(dòng)相為水（流動(dòng)相A）和甲醇（流動(dòng)相B）。梯度洗脫程序：0～10 min，10%～40%B；10～40 min，40%～60% B；40～60 min，60%～80% B；60～80 min，80%～100% B；80～90 min，100% B；90～95 min，100%～10% B。掃描波長為200～600 nm，流速為3 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣體積為300 μL，進(jìn)樣質(zhì)量濃度為100 mg/mL。分段產(chǎn)物Ⅲ的色譜條件：以SunFireTMprep C18 OBDTM制備柱（5 μm，19 mm×250 mm）為固定相；流動(dòng)相為水（流動(dòng)相A）和乙腈（流動(dòng)相B）。梯度洗脫程序：

0～5 min，10%～60% B；5～20 min，60%～80% B；20～34 min，80%～86%B；34～44 min，86%B；44～48 min，86%～100% B；48～50 min，100% B；50～53 min，100%～10%B。掃描波長為200～600 nm，流速為5 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣體積為200 μL，進(jìn)樣質(zhì)量濃度為100 mg/mL。分管收集單體后，利用UPLC-ESI-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-ESI-tandem mass spectrometry,UPLC-ESI-MS/MS）對分離物質(zhì)進(jìn)行鑒定，使用UPLC-二極管陣列檢測器（UPLCdiode array detector, UPLC-DAD）系統(tǒng)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法對單體純度進(jìn)行測定。

采用UPLC-串聯(lián)三重四極桿飛行時(shí)間（UPLCtriple quadrupole-time of flight, UPLC-Triple-TOF）5600＋液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行質(zhì)譜分析：正負(fù)離子掃描模式；掃描范圍100～1 500m/z；霧化氣1 和霧化氣2均為379.2 kPa；氣簾氣241.3 kPa；離子源溫度600 ℃（正），550 ℃（負(fù)）；離子源電壓5 500 V（正），4 500 V（負(fù)）；一級掃描中，去簇電壓100 V，聚焦電壓10 V；二級掃描中，使用飛行時(shí)間質(zhì)譜-一級預(yù)掃描和觸發(fā)的二級掃描-信息依賴掃描離子積累模式（time of flight mass spectrometer-product ioninformation dependent acquisition, TOF MS-Product Ion-IDA）采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，誘導(dǎo)碰撞解離（collisioninduced dissociation, CID）能量為（40±20）eV，進(jìn)樣前，用校正液傳輸系統(tǒng)（calibration delivery system,CDS）泵做質(zhì)量軸校正，使質(zhì)量軸誤差小于2×10－6。

1.3.5 體外化學(xué)抗氧化能力評價(jià)

對從不同柑橘品種中分離純化得到的分段產(chǎn)物和15 種單體進(jìn)行化學(xué)抗氧化活性檢測。根據(jù)本課題組前期報(bào)道的方法[18]進(jìn)行并稍作修改。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical, DPPH）法：取2 μL 適當(dāng)稀釋（稀釋后濃度如附表1 和附表2 所示，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2021.06.152）的分段產(chǎn)物及純化單體溶液加到96孔板中，隨后加入198 μL現(xiàn)配的60 μmol/L的DPPH溶液，在室溫條件下避光反應(yīng)2 h，用酶標(biāo)儀測定其在517 nm波長下的吸光度，以6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸（6-hydroxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid,Trolox）為對照作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各品種分段產(chǎn)物及純化單體對DPPH自由基的清除能力，抗氧化活性以水溶性維生素E當(dāng)量來表示，試驗(yàn)重復(fù)3次。

鐵離子還原抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power,FRAP）法。FRAP工作液的配比：以適量雙蒸水溶解無水乙酸鈉（NaAc），再加入用乙酸調(diào)節(jié)pH 為3.6 的300 mmol/L 的NaAc 緩沖溶液、10 mmol/L 三吡啶基三嗪（tripyridyltriazine, TPTZ）溶液、20 mmol/L 的氯化鐵（FeCl3）溶液，三者以10∶1∶1的體積比混合。取適當(dāng)稀釋（稀釋后濃度如附表2 所示）的10 μL 分段產(chǎn)物及純化單體溶液與90 μL FRAP工作液混合，加到96孔板中，在室溫條件下避光反應(yīng)5 min，用酶標(biāo)儀測定其在593 nm 波長下的吸光度，以Trolox為對照作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各品種分段產(chǎn)物及純化單體對FRAP鐵離子的還原能力，抗氧化活性以水溶性維生素E當(dāng)量來表示，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2,2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]法。ABTS 工作液的配比：將7 mmol/L 的ABTS 溶液和2.6 mmol/L 的過硫酸鉀（K2S2O8）溶液按照1∶1 的體積比混合，在室溫條件下避光反應(yīng)12 h 后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution,PBS）稀釋至D（734 nm）≈0.63 的ABTS 工作液。取適當(dāng)稀釋（稀釋后濃度如附表1和附表2所示）的10 μL 分段產(chǎn)物及純化單體溶液與200 μL ABTS 工作液混合，加到96 孔板中，在室溫條件下避光反應(yīng)5 min 后測定其在734 nm 波長下的吸光度，以Trolox 為對照作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算ABTS 自由基清除能力，抗氧化活性以水溶性維生素E當(dāng)量來表示，試驗(yàn)重復(fù)3次。

氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity,ORAC）法：在96 孔板中加入25 μL 適當(dāng)稀釋（稀釋后濃度如附表1和附表2所示）的分段產(chǎn)物及純化單體溶液，再加入以PBS 溶解的150 μL 40 nmol/L 熒光素鈉溶液，于37 ℃條件下避光反應(yīng)10 min 后，加入25 μL 150 mmol/L 2，2′-偶氮（2-甲基丙基脒）二鹽酸鹽[2, 2′-azobis (2-methylpropionamidine)dihydrochloride,AAPH]溶液，測定熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長535 nm，讀數(shù)間隔2 min，總時(shí)長2 h）。使用25 μL PBS 為陰性對照，以不含AAPH 的孔作為初始熒光值讀數(shù)孔。以空白樣品與樣品之間熒光素鈉衰減曲線下面積（area under the curve,AUC）的差異作為計(jì)算結(jié)果。其中第n次讀數(shù)的相對熒光值（fn）=第n次熒光值（Fn）/初始熒光值（F0），AUC=2×（f0＋f1＋…＋fn）－fn－f0，凈面積（net AUC）=AUC樣品－AUCAAPH＋。以Trolox 為對照作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算ORAC 當(dāng)量，抗氧化活性以水溶性維生素E當(dāng)量來表示，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，使用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 固相萃取柱的動(dòng)態(tài)試驗(yàn)結(jié)果

在固相萃取過程中，樣品的上樣體積主要由樣品的濃度和萃取柱本身的吸附能力決定。根據(jù)各柑橘品種的類黃酮組分特征，最終確定‘胡柚’‘玉環(huán)文旦’‘倫晚臍橙’‘代代’‘甌柑’‘椪柑’的最佳上樣體積分別為10、12、14、6、12、14 BV。各品種分段產(chǎn)物用甲醇洗脫液洗脫的結(jié)果表明：分段產(chǎn)物Ⅰ的最佳洗脫濃度和洗脫體積分別為25%、4 BV，24%、6 BV，35%、4 BV，30%、5 BV，26%、5 BV，40%、6 BV；分段產(chǎn)物Ⅱ的最佳洗脫濃度分別為40%、40%、50%、40%、50%、45%，洗脫體積均為6 BV；分段產(chǎn)物Ⅲ的最佳洗脫濃度和洗脫體積均為80%、4 BV。

2.2 固相萃取柱的初步富集及半制備型HPLC的純化結(jié)果

通過固相萃取柱的初步富集將各柑橘品種中的類黃酮均分為3 個(gè)分段產(chǎn)物，每一分段產(chǎn)物中的物質(zhì)相對于粗提物的液相圖而言較為集中，且3 個(gè)分段產(chǎn)物的回收率均在46.55%以上（圖1～3）。

圖1 ‘胡柚’‘玉環(huán)文旦’果皮的類黃酮提取物及其各分段產(chǎn)物液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatograms of the flavonoid extracts of ‘Huyou’ (HY) and ‘Yuhuan Wendan’ (YHWD) peels and their fraction products

利用半制備型HPLC對6個(gè)柑橘品種的各分段產(chǎn)物進(jìn)一步純化，按照出峰順序收集流出液，于37 ℃條件下真空離心濃縮后得到粉末，進(jìn)行UPLC檢測。

2.3 不同品種柑橘果實(shí)的純化物質(zhì)鑒定及其純度檢測結(jié)果

圖2 ‘倫晚臍橙’‘代代’果皮的類黃酮提取物及其各分段產(chǎn)物液相色譜圖Fig.2 Liquid chromatograms of the flavonoid extracts of ‘Luwan navel orange’ (LW) and ‘Daidai’ (DD) peels and their fraction products

通過UPLC圖譜分析，由半制備型HPLC純化后的單體可以通過出峰時(shí)間和紫外線（ultra violet,UV）吸收圖譜進(jìn)行初步判斷，進(jìn)一步通過UPLC-ESIMS/MS分析進(jìn)行物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果如圖4所示。

圖4 利用半制備型HPLC純化得到的15個(gè)單體的UPLC色譜圖和UPLC-ESI-MS/MS質(zhì)譜圖Fig.4 UPLC chromatograms and UPLC-ESI-MS/MS spectra of 15 monomers purified by semi-preparative HPLC

峰1 的質(zhì)荷比為593.15[M-H]－，在二級質(zhì)譜片段中，503.12[M-H-C3H6O3]－、473.11[M-HC4H8O4]－、383.08[M-H-C3H6O3-C4H8O4]－為典型的離子碎片，這與新西蘭牡荊苷的報(bào)道[19]相符。

峰2的質(zhì)荷比為741.23[M-H]－，在二級質(zhì)譜片段中，579.18[M-H-Glc]－、459.12[M-H-Glc-C8H8O]－離子碎片與柚皮蕓香苷-4′-O-葡萄糖苷的報(bào)道[20]相符。

圖3 ‘甌柑’‘椪柑’果皮的類黃酮提取物及其各分段產(chǎn)物液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatograms of the flavonoid extracts of‘Ougan’(OG)and‘Ponkan’(PG)peels and their fraction products

峰3 的質(zhì)荷比為595.00[M-H]－，具有典型的286.90[M-H-Rha-Glc]－離子碎片，與圣草次苷的報(bào)道[21]相符。

峰4 的質(zhì)荷比為595.00[M-H]－，具有典型的150.80[M-H-Glc-Rha-C8H8O2]－、286.80[M-HRha-Glc]－、458.90[M-H-C8H8O2]－離子碎片，與新圣草次苷的特征碎片[20]相符。

峰5的質(zhì)荷比為578.90[M-H]－，有458.70[MH-C8H8O]－、270.90[M-H-Rha-Glc]－、150.90[MH-Glc-Rha-C8H8O]－特征碎片，與柚皮蕓香苷的報(bào)道[20]一致。

峰6 的質(zhì)荷比為577.16[M-H]－，具有典型的268.04[M-H-Rha-Glc]－離子碎片，符合對野漆樹苷的描述[20]。

峰7 的質(zhì)荷比為579.00[M-H]－，具有458.90[M-H-C8H8O]－、150.80[M-H-Glc-Rha-C8H8O]－特征碎片，可確定為柚皮苷[22]。

峰8 的質(zhì)荷比為609.19[M-H]－，具有301.07[M-H-Rha-Glc]－特征碎片，與橙皮苷的報(bào)道[21]相符。

峰9 的質(zhì)荷比為609.00[M-H]－，具有300.80、146.90 特征峰的離子碎片，與新橙皮苷的報(bào)道[23]相符。

峰10 的質(zhì)荷比為593.10[M-H]－，其具有的284.80[M-H-Rha-Glc]－、481.00特征峰的離子碎片與枸橘苷的報(bào)道[24]一致。

峰11 的質(zhì)荷比為373.20[M＋H]＋，其具有的343.20 特征峰的離子碎片與異甜橙黃酮的報(bào)道[23]一致。

峰12 的質(zhì)荷比為373.20[M＋H]＋，其具有的343.10、313.10 特征峰的離子碎片與甜橙黃酮的報(bào)道[23]一致。

峰13 的質(zhì)荷比為403.10[M＋H]＋，具有373.10[M＋H-2CH3]＋特征碎片，可確定為川陳皮素[25]。

峰14 的質(zhì)荷比為373.20[M＋H]＋，具有343.10[M＋H-2CH3]＋特征碎片，與橘皮素的報(bào)道[26]相符。

峰15 的質(zhì)荷比為389.10[M＋H]＋，其具有的373.10[M＋H-CH3]＋特征碎片與5-去甲基川陳皮素的報(bào)道[25]相符。

使用UPLC 峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線法對15 種化合物進(jìn)行純度分析，從各品種中純化出的單體純度均可達(dá)到95%以上。其中：‘玉環(huán)文旦’中的特色物質(zhì)為柚皮苷，最終純度為99.56%，從該品種中純化得到的新西蘭牡荊苷、野漆樹苷的最終純度可達(dá)到98.72%、95.78%；從‘胡柚’中純化得到的柚皮蕓香苷-4′-O-葡萄糖苷、圣草次苷、新圣草次苷的純度分別為98.42%、98.74%、99.17%；從‘倫晚臍橙’中得到的柚皮蕓香苷的純度為98.12%；從‘椪柑’中純化得到的橙皮苷的純度為98.00%。此外，研究發(fā)現(xiàn)，新橙皮苷在‘胡柚’和‘甌柑’中均大量存在，但是在‘甌柑’中由于其他物質(zhì)的干擾較少，并且‘甌柑’中存在大量的多甲氧基黃酮，所以選擇從‘甌柑’中純化新橙皮苷、枸橘苷、異甜橙黃酮、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素、5-去甲基川陳皮素，其純度分別為98.56%、98.03%、98.76%、98.77%、99.15%、99.20%、97.63%。

2.4 不同品種柑橘果實(shí)的分段產(chǎn)物體外化學(xué)抗氧化能力測定結(jié)果

如圖5所示，經(jīng)過4種評價(jià)方法的測定，不同品種的類黃酮分段產(chǎn)物的抗氧化活性存在一定的差異性。

圖5 不同柑橘品種分段產(chǎn)物的抗氧化活性評價(jià)Fig.5 Evaluation of antioxidant activities of fraction products of different citrus varieties

在對DPPH自由基清除能力方面，‘椪柑’和‘胡柚’分段產(chǎn)物Ⅰ和Ⅱ的自由基清除能力高于‘代代’‘甌柑’‘玉環(huán)文旦’和‘倫晚臍橙’。其中‘椪柑’和‘胡柚’的分段產(chǎn)物Ⅰ自由基清除能力最強(qiáng)，分別為0.078 和0.077 g/g。同時(shí)，‘椪柑’和‘胡柚’分段產(chǎn)物Ⅱ的自由基清除能力顯著強(qiáng)于除‘代代’分段產(chǎn)物Ⅰ外的其他各分段產(chǎn)物。在6 個(gè)品種中，各品種的分段產(chǎn)物Ⅰ的自由基清除能力均顯著高于分段產(chǎn)物Ⅱ和分段產(chǎn)物Ⅲ?！帧畟愅砟毘取T柑’和‘椪柑’的分段產(chǎn)物Ⅱ則強(qiáng)于分段產(chǎn)物Ⅲ。僅有‘玉環(huán)文旦’的分段產(chǎn)物Ⅲ的自由基清除能力強(qiáng)于分段產(chǎn)物Ⅱ，但仍然弱于分段產(chǎn)物Ⅰ。

對于FRAP，‘椪柑’分段產(chǎn)物Ⅰ（0.053 g/g）及‘胡柚’分段產(chǎn)物Ⅱ（0.053 g/g）表現(xiàn)出較強(qiáng)的鐵離子還原能力；除此之外，‘胡柚’和‘代代’的分段產(chǎn)物Ⅰ的鐵離子還原能力顯著強(qiáng)于其他各分段產(chǎn)物。在‘倫晚臍橙’‘代代’和‘椪柑’3 個(gè)品種中，分段產(chǎn)物Ⅰ與分段產(chǎn)物Ⅱ的還原能力顯著強(qiáng)于分段產(chǎn)物Ⅲ。在‘玉環(huán)文旦’和‘甌柑’中，分段產(chǎn)物Ⅲ的鐵離子還原能力強(qiáng)于分段產(chǎn)物Ⅱ，但均不如分段產(chǎn)物Ⅰ。

在對ABTS 自由基清除能力方面，‘甌柑’分段產(chǎn)物Ⅱ（0.087 g/g）、‘椪柑’分段產(chǎn)物Ⅰ（0.085 g/g）與分段產(chǎn)物Ⅱ（0.084 g/g）表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。在‘椪柑’和‘倫晚臍橙’2 個(gè)品種中，分段產(chǎn)物Ⅰ與分段產(chǎn)物Ⅱ間無明顯差異，但均顯著強(qiáng)于相應(yīng)的分段產(chǎn)物Ⅲ。‘玉環(huán)文旦’的分段產(chǎn)物Ⅰ顯著強(qiáng)于分段產(chǎn)物Ⅱ和分段產(chǎn)物Ⅲ。在‘胡柚’‘代代’和‘甌柑’中，分段產(chǎn)物Ⅱ的自由基清除能力顯著高于其分段產(chǎn)物Ⅰ和分段產(chǎn)物Ⅲ。其次，‘代代’的分段產(chǎn)物Ⅰ抗氧化活性較強(qiáng)，‘甌柑’中則是分段產(chǎn)物Ⅲ較強(qiáng)，‘胡柚’的分段產(chǎn)物Ⅰ和分段產(chǎn)物Ⅲ間無明顯差異。

對于ORAC，各柑橘品種表現(xiàn)的抗氧化活性與上述3 種方法差別較大?？寡趸芰^強(qiáng)的為‘甌柑’分段產(chǎn)物Ⅲ（5.816 g/g）、‘胡柚’分段產(chǎn)物Ⅲ（5.642 g/g）、‘胡柚’分段產(chǎn)物Ⅱ（5.632 g/g）、‘代代’分段產(chǎn)物Ⅲ（5.363 g/g）及‘甌柑’分段產(chǎn)物Ⅱ（5.251 g/g）；除‘椪柑’外，各品種的抗氧化活性最強(qiáng)的為分段產(chǎn)物Ⅲ，其次為分段產(chǎn)物Ⅱ，最弱的為分段產(chǎn)物Ⅰ。在‘椪柑’中，分段產(chǎn)物Ⅱ的抗氧化活性最強(qiáng)，分段產(chǎn)物Ⅲ最弱。

為了綜合評價(jià)各柑橘品種不同分段產(chǎn)物的抗氧化能力，本試驗(yàn)采用綜合抗氧化能力（antioxidant potency composite,APC）指數(shù)來進(jìn)行評定。APC 指數(shù)=（該方法測定值/該方法測定最大值）×100%，最終使用的APC 指數(shù)為4 種抗氧化方法APC 指數(shù)得分的平均值。6個(gè)柑橘品種的分段產(chǎn)物的APC指數(shù)如表2所示，18個(gè)分段產(chǎn)物的抗氧化APC指數(shù)整體變化范圍在22.47%～93.47%之間。其中，抗氧化能力較強(qiáng)的為‘胡柚’分段產(chǎn)物Ⅱ（APC 綜合指數(shù)為93.47%）、‘椪柑’分段產(chǎn)物Ⅰ（APC 綜合指數(shù)為92.12%）、‘椪柑’分段產(chǎn)物Ⅱ（APC 綜合指數(shù)為90.00%）、‘胡柚’分段產(chǎn)物Ⅰ（APC 綜合指數(shù)為86.71%）。除‘玉環(huán)文旦’和‘胡柚’外，其余柑橘品種的分段產(chǎn)物Ⅰ和分段產(chǎn)物Ⅱ的APC指數(shù)相近，均高于分段產(chǎn)物Ⅲ?！癍h(huán)文旦’中分段產(chǎn)物Ⅰ的抗氧化能力最強(qiáng)，分段產(chǎn)物Ⅱ的抗氧化能力最弱，而‘胡柚’中抗氧化能力表現(xiàn)為分段產(chǎn)物Ⅱ＞分段產(chǎn)物Ⅰ＞分段產(chǎn)物Ⅲ。

表2 不同柑橘品種分段產(chǎn)物抗氧化活性的APC指數(shù)Table 2 APC indexes of antioxidant activities of fraction products of different citrus varieties%

2.5 不同品種柑橘果實(shí)的純化單體體外化學(xué)抗氧化能力測定結(jié)果

對不同柑橘品種的分段產(chǎn)物進(jìn)行抗氧化活性測定后發(fā)現(xiàn)，各品種的分段產(chǎn)物Ⅰ和分段產(chǎn)物Ⅱ抗氧化活性較強(qiáng)，分段產(chǎn)物Ⅲ的主要活性物質(zhì)成分為多甲氧基黃酮，其自由基清除能力和鐵離子還原能力相對較弱。為了進(jìn)一步探究各分段產(chǎn)物中所含成分的抗氧化能力，本試驗(yàn)對從各個(gè)品種中分離純化得到的單體進(jìn)行抗氧化活性檢測，結(jié)果如圖6 所示。在DPPH 和FRAP 方法中，抗氧化能力最強(qiáng)的均為圣草次苷和新圣草次苷，其次為橙皮苷和新橙皮苷；在ABTS方法中，新圣草次苷（2.04 g/g）、圣草次苷（0.38 g/g）及新橙皮苷（0.24 g/g）的抗氧化能力顯著強(qiáng)于其他物質(zhì)；在ORAC 方法中，抗氧化能力排序?yàn)槌绕ぼ眨?.82 g/g）＞圣草次苷（4.58 g/g）＞新圣草次苷（4.50 g/g）＞新西蘭牡荊苷（4.02 g/g）＞野漆樹苷（4.00 g/g）。對4種方法進(jìn)行綜合比較發(fā)現(xiàn)：抗氧化能力較強(qiáng)的多為黃烷酮類化合物，而多甲氧基黃酮的抗氧化能力較弱；但是在FRAP 及ABTS的測定方法中，5-去甲基川陳皮素的值高于其他的多甲氧基黃酮及大多數(shù)黃烷酮的值。

圖6 不同柑橘品種純化單體的抗氧化活性評價(jià)Fig.6 Evaluation of antioxidant activities of purified monomers of different citrus varieties

同樣，本試驗(yàn)通過計(jì)算抗氧化活性APC指數(shù)來綜合評價(jià)純化單體的抗氧化能力，結(jié)果如表3所示。在15 種純化單體中，新圣草次苷（APC 綜合指數(shù)為93.52%）、圣草次苷（APC綜合指數(shù)為78.43%）、橙皮苷（APC綜合指數(shù)為29.47%）3種黃烷酮類物質(zhì)抗氧化能力較強(qiáng)。在其余的純化單體中，APC綜合指數(shù)范圍在5%～25%之間的有8種物質(zhì)，包括2種黃酮、5種黃烷酮及1種多甲氧基黃酮，剩余4種多甲氧基黃酮的抗氧化活性則較弱。

表3 不同柑橘品種純化單體的抗氧化活性APC指數(shù)Table 3 APC indexes of antioxidant activities of purified monomers of different citrus varieties%

3 討論

3.1 不同品種柑橘果實(shí)中類黃酮的分離純化

根據(jù)類黃酮在不同柑橘品種中的分布特征，本研究采取“分段富集和逐一純化”的策略，建立了具有針對性的分離純化體系。分段富集是對單體分離純化的預(yù)處理，有利于后續(xù)純化實(shí)驗(yàn)的參數(shù)選擇，并有利于縮短總體分離和純化的時(shí)間。在前人的分離純化研究中，研究者利用HPD100 型樹脂與制備型高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)，從‘大紅袍’紅橘中純化出5 種純度均在95%以上的多甲氧基黃酮單體，總純化時(shí)間超過10 h，并消耗大量有機(jī)試劑[27]。而本研究采用固相萃取代替樹脂進(jìn)行前處理，整體分離純化時(shí)間僅需要5～6 h，不僅縮短了富集時(shí)間，也便于進(jìn)行多種類黃酮的純化。針對類黃酮分段富集產(chǎn)物，本研究建立的基于半制備型高效液相色譜技術(shù)的柑橘果實(shí)的類黃酮單體分離純化體系，從6個(gè)柑橘品種的分段富集產(chǎn)物中共分離純化得到15種單體，其中有4 種單體首次從柑橘果實(shí)中分離純化得到，分別是從柚類果實(shí)中純化得到的新西蘭牡荊苷，從葡萄柚品種中純化得到的柚皮蕓香苷-4′-O-葡萄糖苷和圣草次苷，以及從柑類品種中純化得到的異甜橙黃酮。

3.2 不同品種柑橘果實(shí)的分段產(chǎn)物及純化單體的化學(xué)抗氧化能力評價(jià)

本研究發(fā)現(xiàn)，富含黃酮和黃烷酮的分段產(chǎn)物的化學(xué)抗氧化能力強(qiáng)于富含多甲氧基黃酮的分段產(chǎn)物。在15種單體中，抗氧化能力較強(qiáng)的依次為新圣草次苷、圣草次苷、橙皮苷及新橙皮苷，而川陳皮素、橘皮素等抗氧化能力較弱?；瘜W(xué)抗氧化能力與類黃酮的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)：首先，當(dāng)其具有大量的酚羥基時(shí)，與自由基結(jié)合可提供活潑的氫，形成更加穩(wěn)定的酚類自由基，繼而打斷鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；其次，在一定條件下，類黃酮的鄰位酚羥基與金屬離子螯合，進(jìn)而抑制脂質(zhì)過氧化發(fā)生。前人研究表明，類黃酮的抗氧化活性不僅與酚羥基的數(shù)量和取代位置有關(guān)，也與C環(huán)上2、3位雙鍵的有無有關(guān)[28]，這也證實(shí)了本研究純化單體中的新西蘭牡荊苷和野漆樹苷2種黃酮也具有一定的抗氧化能力的結(jié)論。川陳皮素等多甲氧基黃酮的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是苯環(huán)上的羥基高度甲氧基化，酚羥基較少，從而導(dǎo)致其體外化學(xué)抗氧化活性較差，這可能與其分子平面結(jié)構(gòu)與親脂性被改變有關(guān)。然而，5-去甲基川陳皮素的抗氧化活性強(qiáng)于大多數(shù)的多甲氧基黃酮，與其他多甲氧基黃酮相比，其5位的酚羥基可能發(fā)揮了主要作用。

柑橘果實(shí)的類黃酮分段產(chǎn)物及單體在不同的評價(jià)體系下發(fā)揮著不同的抗氧化效果。柑橘類黃酮對DPPH 和ABTS 自由基的清除能力相似，而對ORAC抗氧化能力具有一定的差異。前2種方法中抗氧化能力較強(qiáng)的分段產(chǎn)物Ⅰ在ORAC 的抗氧化評價(jià)體系中表現(xiàn)出了較低水平，這可能是由于ORAC 的評價(jià)方法更偏重于水溶性物質(zhì)，樣品的溶解度對試驗(yàn)結(jié)果存在一定的影響。前人研究中也發(fā)現(xiàn)了相似結(jié)果[15]，說明不同評價(jià)方法對抗氧化能力指標(biāo)會(huì)產(chǎn)生不同的影響。

4 結(jié)論

本研究利用超聲波輔助提取、固相萃取與半制備型HPLC 相結(jié)合的方式，建立了從不同柑橘品種中分離純化其主要類黃酮的體系。利用固相萃取完成了柑橘類黃酮粗提物中黃酮組分（分段產(chǎn)物Ⅰ）、黃烷酮組分（分段產(chǎn)物Ⅱ）和多甲氧基黃酮組分（分段產(chǎn)物Ⅲ）的富集。利用半制備型HPLC從各分段產(chǎn)物中純化得到了純度高于95%的2種黃酮（新西蘭牡荊苷、野漆樹苷）、8 種黃烷酮（柚皮蕓香苷-4′-O-葡萄糖苷、圣草次苷、新圣草次苷、柚皮苷、柚皮蕓香苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷）及5 種多甲氧基黃酮（異甜橙黃酮、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素、5-去甲基川陳皮素）。但此分離體系仍然存在回收率較低的問題，如何在保證純度的同時(shí)提高單體的回收率尚待進(jìn)一步研究。

柑橘類黃酮的化學(xué)抗氧化能力與其結(jié)構(gòu)有關(guān)。各柑橘品種的不同分段產(chǎn)物及單體間的抗氧化活性差異較大，黃酮及黃烷酮分段產(chǎn)物的化學(xué)抗氧化能力強(qiáng)于富含多甲氧基黃酮的分段產(chǎn)物。純化單體中，新圣草次苷、圣草次苷、橙皮苷及新橙皮苷的化學(xué)抗氧化能力較強(qiáng)，川陳皮素和橘皮素的化學(xué)抗氧化能力較弱。關(guān)于柑橘類黃酮的抗氧化構(gòu)效關(guān)系及作用機(jī)制有待通過細(xì)胞或動(dòng)物模型深入探索，同時(shí)，類黃酮單體之間是否存在協(xié)同或拮抗關(guān)系及其在體內(nèi)的效應(yīng)是否相同也有待進(jìn)一步研究。