人工合成六倍體小麥耐鹽種質(zhì)資源的篩選及評(píng)價(jià)

李小康，吳崇寧，王 維，李文淑，KISHII MASAHIRO，田紀(jì)春，鄧志英

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，小麥品質(zhì)育種研究室，山東泰安 271000；2.邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河北邯鄲，056000；3.CIMMYT,Apdo. Postal 6-641,06600,Mexico,D.F.,Mexico.)

人口的逐漸增長以及耕地的減少不僅對(duì)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展造成了影響，而且對(duì)全世界的糧食安全也構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅[1]。全球約有800萬 hm2(6%)的耕地受到鹽分的影響[2]，土壤鹽漬化逐漸成為了影響小麥產(chǎn)量的主要因素之一[3]。小麥?zhǔn)俏覈饕Z食作物之一，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有舉足輕重的地位[4]。近年來，我國鹽漬化土壤面積不斷擴(kuò)大，對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展造成了巨大影響[5]。通過培育和篩選耐鹽性強(qiáng)的小麥品種(系)，可實(shí)現(xiàn)鹽堿地的有效利用，并成為促進(jìn)糧食增產(chǎn)的重要途徑[6]。

芽期和苗期是小麥生長發(fā)育初期階段，小麥萌發(fā)和幼苗質(zhì)量對(duì)生育期壯苗的形成影響較大。在該階段小麥對(duì)逆境脅迫比較敏感[7]，因而也是進(jìn)行小麥耐鹽性鑒定的最好時(shí)期。韓冉等[8]對(duì)多個(gè)小麥品種進(jìn)行不同鹽濃度梯度脅迫，對(duì)苗期的根長、苗高及最終產(chǎn)量進(jìn)行比較分析，最終篩選出濟(jì)麥262等三個(gè)耐鹽性較好的小麥品種；陳春舟等[9]對(duì)16份小麥種質(zhì)材料進(jìn)行0.2 mol·L-1NaCl脅迫，通過綜合評(píng)價(jià)篩選出3份苗期耐鹽性均較高材料；彭澤等[10]對(duì)121份小麥及遠(yuǎn)緣雜交后代進(jìn)行耐鹽性鑒定，通過綜合評(píng)價(jià)苗期生理以及SOD、POD活性等指標(biāo)，篩選出耐鹽性較好的5份小麥材料及8份小麥遠(yuǎn)緣雜交后代。目前小麥耐鹽性鑒定基本以普通小麥為對(duì)象，缺乏對(duì)人工合成六倍體小麥的耐鹽性了解。人工合成六倍體小麥?zhǔn)撬谋扼w硬粒小麥和粗山羊草雜交，經(jīng)染色體加倍而形成的小麥類型，含有豐富的抗病、抗蟲、優(yōu)質(zhì)亞基、耐旱、耐寒及耐鹽等優(yōu)異基因[11-13]，具有較強(qiáng)的抗逆性，適合作為現(xiàn)代分子育種的優(yōu)良抗性基因的提供者，其耐鹽性值得深入研究。本研究以墨西哥國際玉米小麥改良中心提供的141份人工合成六倍體小麥為材料，利用水培法來培育小麥幼苗，以清水為對(duì)照，在小麥芽期和苗期分別進(jìn)行不同濃度鹽脅迫處理(NaCl:100 mmol·L-1、150 mmol·L-1、200 mmol·L-1)，測定小麥芽期苗高、最大根長、胚芽鞘長以及發(fā)芽率等形態(tài)指標(biāo)及苗期葉片丙二醛、脯氨酸、可溶性糖含量等生理生化指標(biāo)，進(jìn)而用主成分分析和聚類分析對(duì)試驗(yàn)材料的耐鹽性進(jìn)行綜合性評(píng)價(jià)，以篩選出耐鹽性較強(qiáng)的小麥材料，以期為耐鹽小麥新品種的培育提供新的種質(zhì)材料。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為從墨西哥國際玉米小麥改良中心引進(jìn)的141份人工合成六倍體小麥材料(編號(hào)Syn1～Syn141)。試驗(yàn)于2019年春季在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)培養(yǎng)箱中進(jìn)行，以山東省德州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供的抗鹽小麥品種德抗961為對(duì)照。

1.2 種子萌發(fā)試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)置0、100、150和200 mmol·L-14個(gè)NaCl濃度處理，每個(gè)濃度設(shè)置3次重復(fù)。在發(fā)芽盒中放入大小適當(dāng)?shù)奈垼尤氩煌瑵舛萅aCl溶液至吸水紙飽和，每個(gè)材料選取長勢均勻飽滿且無病蟲害的健康種子80粒，腹溝向下，種胚朝向一致，擺放在吸水紙上，間隔距離均勻一致，置于溫度24 ℃、光照12 h、黑暗12 h、濕度70%、光照強(qiáng)度20 000 lx的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。萌發(fā)過程中每天補(bǔ)水稱重兩次，測其溶液電導(dǎo)率，使其濃度保持穩(wěn)定。其中100、150和200 mmol·L-1NaCl溶液電導(dǎo)率分別維持在7 366、12 188和17 071 us。培養(yǎng)7 d后計(jì)算其發(fā)芽率，測量苗高、根長、胚芽鞘長。

1.3 幼苗試驗(yàn)

每個(gè)材料選取種子100粒，在發(fā)芽盒中放入大小適當(dāng)?shù)奈?，先清水培養(yǎng)至1葉1心期，再換至不同濃度NaCl溶液培養(yǎng)。NaCl濃度設(shè)置同萌發(fā)試驗(yàn)，用去離子水做對(duì)照。幼苗置于溫度24 ℃、光照12 h、黑暗12 h、濕度70%、光照強(qiáng)度20 000 lx的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每天補(bǔ)充鹽溶液稱重兩次，測其溶液電導(dǎo)率，使其濃度保持穩(wěn)定，培養(yǎng)5 d后取樣測定葉片丙二醛、脯氨酸、可溶性糖含量及地上部鮮重和干重、根鮮重和根干重，其中丙二醛、脯氨酸、可溶性糖含量的測定分別采用硫代巴比妥酸法、茚三酮法和蒽酮法[15-18]。并計(jì)算根冠比等指標(biāo)。

鮮重根冠比=(根鮮重/地上部鮮重)×100%；干重根冠比=(根干重/地上部干重)×100%；苗含水量=(地上部鮮重-地上部干重)/苗鮮重；根含水量=(根鮮重-根干重)/根鮮重；采用霍鵬[14]的方法計(jì)算小麥各性狀相對(duì)耐鹽系數(shù)：相對(duì)耐鹽系數(shù)=(鹽堿脅迫值/對(duì)照值)×100%。

1.4 綜合評(píng)價(jià)

參考龔明的方法[19]計(jì)算各指標(biāo)隸屬函數(shù)值U(Xi)：U(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)。Xi表示小麥材料第i個(gè)指標(biāo)的觀測值，Xmin和Xmax分別表示第i個(gè)指標(biāo)所有觀測值中的最小和最大值。由于MDA含量與作物耐鹽性呈負(fù)相關(guān)，因此其隸屬函數(shù)值U(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)。基于隸屬函數(shù)值利用主成分分析對(duì)小麥材料進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2019、SPSS 22及SPSS AU對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽濃度對(duì)小麥芽期和苗期形態(tài)和生理指標(biāo)的影響

2.1.1 鹽濃度對(duì)芽期形態(tài)指標(biāo)的影響

當(dāng)在清水中培養(yǎng)時(shí)，所有小麥材料均能夠發(fā)芽；鹽濃度為100 mmol·L-1時(shí)能夠發(fā)芽的小麥材料數(shù)占總材料數(shù)的90.78%；但當(dāng)鹽濃度達(dá)到150 mmol·L-1時(shí)則發(fā)芽受到很明顯的抑制，能夠發(fā)芽的小麥材料數(shù)占總材料數(shù)的63.83%；當(dāng)鹽濃度達(dá)到200 mmol·L-1時(shí)能夠發(fā)芽的小麥材料數(shù)大大降低，僅占總材料數(shù)的25.53%。其中，對(duì)照德抗961在150和200 mmol·L-1濃度下均不能發(fā)芽。因此，后續(xù)試驗(yàn)只對(duì)各濃度中能發(fā)芽的小麥材料進(jìn)行分析。

小麥的發(fā)芽率、苗高、最大根長、胚芽鞘長均隨著鹽濃度的增加而降低(圖1)。當(dāng)鹽濃度由0 mmol·L-1升高到100 mmol·L-1時(shí)，四個(gè)性狀受影響的程度均較大；當(dāng)鹽濃度升高到200 mmol·L-1，小麥的發(fā)芽率由71.08%降到 21.78%，苗高由16.09 cm降到2.7 cm，最大根長由10.3 cm降到1.00 cm，胚芽鞘長度由3.45 cm降到2.34 cm。由此可見，較高濃度的鹽脅迫會(huì)抑制小麥種子萌發(fā)和幼苗生長。

圖柱上字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖2和圖3同。

2.1.2 鹽濃度對(duì)苗期生理指標(biāo)和生物量的影響

人工合成六倍體小麥的葉片可溶性糖和脯氨酸含量均隨著鹽濃度的升高而上升，而德抗961葉片的可溶性糖和脯氨酸含量分別呈先降后升和上升的趨勢；所有材料的葉片丙二醛含量隨著鹽濃度的升高均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，均在100 mmol·L-1鹽濃度下達(dá)到最大值；與德抗961相比，在相同鹽濃度下，人工合成六倍體小麥的可溶性糖和脯氨酸含量均較低，而丙二醛含量均較高(圖2)。這說明鹽脅迫對(duì)人工合成六倍體小麥的滲透調(diào)節(jié)和膜脂過氧化均產(chǎn)生影響。

圖2 鹽濃度對(duì)小麥苗期生理指標(biāo)的影響

由圖3可知，人工合成六倍體小麥和德抗961的地上部鮮重和干重、根鮮重以及人工合成六倍體小麥的根干重均隨著鹽濃度的升高而降低，而德抗961的根干重隨著鹽濃度的升高呈先升后降趨勢，且在100 mmol·L-1鹽濃度下達(dá)到最大值。這進(jìn)一步表明鹽脅迫對(duì)小麥幼苗生長產(chǎn)生明顯的抑制作用。

圖3 鹽濃度對(duì)小麥生長的影響

2.2 人工合成六倍體小麥耐鹽相關(guān)性狀的表型分析

與0 mmol·L-1處理相比，100 mmol·L-1鹽脅迫條件下，幼苗的葉片可溶性糖含量和脯氨酸含量的平均值均較高，發(fā)芽率、苗高、最大根長、胚芽鞘長、根干重、根鮮重、地上干重、地上部鮮重、干重根冠比、鮮重根冠比、根含水量的平均值均較低(表1)。此外，當(dāng)人工合成六倍體小麥?zhǔn)艿禁}脅迫時(shí)，各性狀的變異程度都較明顯，其中鹽脅迫條件下根干重、根鮮重及干重根冠比的變異系數(shù)都較大，均超過80%，說明100 mmol·L-1鹽脅迫處理已對(duì)小麥材料地上部和根系的生長 發(fā)育均產(chǎn)生不同程度的抑制，可以用于耐鹽性 鑒定。

表1 人工合成六倍體小麥芽期和苗期形態(tài)和生理指標(biāo)的表型分析

2.3 鹽脅迫條件下各性狀之間的相關(guān)性

經(jīng)對(duì)性狀耐鹽系數(shù)之間的相關(guān)性分析(表2)，鹽脅迫下發(fā)芽率與苗高、最大根長、胚芽鞘長呈極顯著正相關(guān)，與鮮重根冠比呈極顯著負(fù)相關(guān)；苗高與最大根長、胚芽鞘長、地上部干重呈極顯著正相關(guān)，與鮮重根冠比呈極顯著負(fù)相關(guān)，與可溶性糖含量、地上部鮮重呈顯著正相關(guān)，與根含水量呈顯著負(fù)相關(guān)；最大根長與胚芽鞘長、可溶性糖含量呈極顯著正相關(guān)；胚芽鞘長與地上部干重呈顯著正相關(guān)，與干重根冠比呈顯著負(fù)相關(guān)，與鮮重根冠比呈極顯著負(fù)相關(guān)；地上部干重與根干重、地上部鮮重、根鮮重呈極顯著正相關(guān)，與苗含水量、干重根冠比呈極顯著負(fù)相關(guān)；根干重與地上部鮮重、根鮮重、干重根冠比、鮮重根冠比呈極顯著正相關(guān)，與根含水量呈極顯著負(fù)相關(guān)；地上部鮮重與根鮮重、苗含水量和根含水量呈極顯著和顯著正相關(guān)；根鮮重與根含水量、干重根冠比、鮮重根冠比呈極顯著正相關(guān)。由此可見，鹽脅迫下小麥的不同指標(biāo)之間存在密切聯(lián)系，在反映耐鹽性的信息方面存在不同程度的重疊，因此需要綜合來評(píng)價(jià)。

表2 鹽脅迫條件下所測耐鹽系數(shù)之間的相關(guān)性

2.4 小麥耐鹽性的綜合評(píng)價(jià)

通過對(duì)各個(gè)指標(biāo)的耐鹽系數(shù)進(jìn)行主成分分析，最后將15個(gè)指標(biāo)劃分成了5個(gè)綜合性指標(biāo)(A1、A2、A3、A4、A5)，這5個(gè)綜合指標(biāo)的特征值、貢獻(xiàn)率和權(quán)重見表3。這5個(gè)綜合性指標(biāo)的貢獻(xiàn)率分別為30.504%、24.946%、10.539%、 8.993%、7.16%，累積貢獻(xiàn)率達(dá)到了82.142%，包含了絕大部分指標(biāo)的主要信息。

表3 各綜合指標(biāo)特征值、貢獻(xiàn)率及權(quán)重

分析得到了各因子的載荷系數(shù)(表4)，可知A1的特征值為2.941，在發(fā)芽率、苗高上有較大的載荷量，可歸類為苗高主成分。A2的特征值為2.583，在根鮮重、干重根冠比、鮮重根冠比上有較高載荷量，可歸為根冠比主成分。A3的特征值為2.252，在地上部干重和鮮重上有較大的載荷量，地上部干重的影響最大，可歸為地上物質(zhì)主成分。A4特征值為1.503，可溶性糖上有較大的載荷量，載荷系數(shù)為0.676，歸為相容性物質(zhì)主成分。A5的特征值為1.337，在丙二醛含量、根干重上有較大載荷量，根干重影響最大，可歸為根物質(zhì)主成分。

表4 前5個(gè)主成分對(duì)應(yīng)的載荷系數(shù)

綜上分析發(fā)現(xiàn)，這5個(gè)綜合性指標(biāo)與小麥耐鹽性密切相關(guān)。其中發(fā)芽率、苗高、胚芽鞘長、根長、根鮮重、干重根冠比、鮮重根冠比、地上部干重、地上部鮮重、苗含水量、可溶性糖含量、根干重、丙二醛含量等在各自的綜合性指標(biāo)中比重都較大，因此，可以將其作為小麥生長早期耐鹽性篩選的指標(biāo)。

利用各指標(biāo)耐鹽系數(shù)值、主成分載荷和權(quán)重求出各個(gè)材料的綜合評(píng)價(jià)值(D值)，并進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析(圖4)。按照耐鹽能力由強(qiáng)到弱將141份材料劃分為了四類：第一類為高耐鹽材料，共17份，主要包括Syn122、Syn124、Syn99、Syn35、Syn114、Syn127、Syn128、Syn131等，占供試材料的12.06%；第二類為耐鹽材料，共61份，主要包括Syn23、Syn117、Syn61、Syn79、Syn109、Syn140、Syn74、Syn9、Syn103等，占供試材料的43.26%；第三類為中度耐鹽材料，共48份，主要包括Syn7、Syn39、Syn96、Syn33、Syn95、Syn58、Syn91、Syn97、Syn8等，占供試材料的34.04%；第四類為鹽敏感材料，共15份，主要包括Syn14、Syn22、Syn5、Syn20、Syn10、Syn92、Syn12、Syn68、Syn11等，占供試材料的10.64%。

圖4 人工合成六倍體小麥D值系統(tǒng)聚類分析結(jié)果

3 討 論

鹽堿化土地造成的鹽害是由過量鹽分引起的，且通常是由高濃度的 Na+、Cl-造成的[21-22]，因而目前作物耐鹽性鑒定大多采用NaCl溶液模擬鹽脅迫[23-24]。作物生長起始階段抗逆境脅迫能力差，對(duì)逆境脅迫反應(yīng)敏感且易受害，最終的產(chǎn)量受影響較大。小麥芽期和苗期是小麥整個(gè)生育期中最易受到鹽脅迫危害的時(shí)期，因此芽期和苗期是對(duì)小麥進(jìn)行耐鹽鑒定性的重要時(shí)期[25-27]。本研究分別對(duì)人工合成六倍體小麥材料的芽期和苗期進(jìn)行不同濃度的鹽脅迫，并對(duì)形態(tài)指標(biāo)和生理指標(biāo)進(jìn)行測定分析及耐鹽性綜合評(píng)價(jià)，可以較為準(zhǔn)確地比較不同材料之間耐鹽性的差異。彭智等[28]對(duì)321份小麥材料進(jìn)行芽期和苗期耐鹽性鑒定，通過主成分分析把芽期和苗期的14個(gè)指標(biāo)分別劃分成了4類綜合指標(biāo)。李鳳勤等[29]對(duì)205份小麥材料進(jìn)行芽期耐鹽性鑒定，通過主成分分析法將多個(gè)耐鹽指標(biāo)劃分成了5類綜合指標(biāo)。本研究通過主成分分析也將人工合成六倍體小麥芽期和苗期多個(gè)形態(tài)和生理指標(biāo)劃分為5類綜合性指標(biāo)，其結(jié)果也與前人基本一致。利用綜合評(píng)價(jià)值進(jìn)一步進(jìn)行聚類分析，將141份人工合成六倍體小麥材料的耐鹽性劃分成了4大類，分別為高耐型(12.06%)、耐鹽型(43.26%)、中耐型 (34.04%)和敏感型 (10.64%)。因此將主成分分析與聚類分析結(jié)合，可有效對(duì)小麥材料進(jìn)行耐鹽性評(píng)價(jià)，而且直觀可靠。但不同的研究對(duì)耐鹽性的劃分不一樣。如吐爾汗等[30]通過該方法將76份新疆冬小麥品種劃分成了5大類；張巧鳳等[23]對(duì)24份小麥品種進(jìn)行苗期耐鹽性鑒定，通過該方法將24份小麥品種劃分成了3大類；李鳳勤[29]對(duì)205份小麥品種進(jìn)行芽期耐鹽性鑒定，通過該方法將205份小麥品種劃分成了4大類。這可能與所有材料間耐鹽性差異程度及聚類分析的具體分類距離有關(guān)。