色譜技術(shù)在黃酮類化合物分離純化中的應(yīng)用研究進(jìn)展

楊發(fā)容 景聯(lián)鵬 顧麗莉 尚關(guān)蘭 李瑞東

(1. 昆明理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，云南 昆明 650500；2. 云南煙葉復(fù)烤有限責(zé)任公司，云南 昆明 650021)

黃酮類化合物是一種廣泛存在于天然植物中的多酚類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化性、清除自由基和抗輻射等生理活性，常被用作食品添加劑用于功能食品的生產(chǎn)[1-3]。目前對黃酮類化合物的研究多為提取、分離純化、含量測定和制劑研究等方面，而如何高效快速得到高純黃酮物質(zhì)是當(dāng)前亟待解決的問題。針對黃酮類化合物的分離與純化，主要有色譜分離法、金屬離子絡(luò)合法[4]、膜分離法、梯度pH萃取法、重結(jié)晶法[5]、高速離心分離法[6]、分子印跡技術(shù)[7]以及多種技術(shù)的耦合[8]等。相較于其他分離技術(shù)，色譜分離技術(shù)分離效率高，處理量大，能分離各種性質(zhì)極其類似的物質(zhì)，在用于化學(xué)物質(zhì)分析鑒定的同時(shí)，在天然產(chǎn)物活性成分的分離和純化中起著重要作用。文章擬對色譜技術(shù)在黃酮類化合物的分離純化中的研究及應(yīng)用情況進(jìn)行綜述，主要包括柱色譜法、制備型高效液相色譜法、薄層色譜法、超臨界流體色譜法和高速逆流色譜法等，以期為黃酮類化合物的色譜分離研究提供參考。

1 黃酮類化合物的色譜分離

1.1 柱色譜法

經(jīng)典的柱色譜技術(shù)分離通量大且效率高、適用范圍廣、操作簡單，是從植物粗提液中分離大量黃酮類化合物的有效方法之一，常用的吸附劑或載體主要有硅膠、聚酰胺、葡聚糖凝膠、環(huán)糊精鍵合凝膠、氧化鋁、大孔樹脂、纖維素粉和離子交換樹脂等。

硅膠柱色譜主要用于分離極性較小的黃酮類化合物(如異黃酮、黃烷酮、二氫黃酮醇和高度甲基化或乙?；狞S酮及黃酮醇)，當(dāng)硅膠降活后也可分離極性較大的黃酮類化合物(如苷類、多羥基黃酮)；聚酰胺應(yīng)用范圍較廣，適用于分離苷類、苷元、查耳酮和二氫黃酮等多種類型的黃酮類化合物；葡聚糖凝膠既可分離苷元也可分離苷類物質(zhì)，分離黃酮苷元時(shí)，主要靠吸附作用，苷元中游離酚羥基數(shù)目越多，吸附力就越強(qiáng)，也就越難洗脫，在分離黃酮苷類時(shí)，分子篩的屬性起主導(dǎo)作用，苷類物質(zhì)按相對分子質(zhì)量由大到小依次流出柱體；β-環(huán)糊精是一種具有“內(nèi)疏水，外親水”功能的環(huán)狀空腔化合物，主體分子通過“內(nèi)識別”和“外識別”作用對客體分子進(jìn)行識別，基于此特性，多種β-環(huán)糊精鍵合不同類型的固定相用于黃酮類化合物的分離[9]；氧化鋁柱色譜僅適用于分離分子中無3-羥基、5-羥基或者鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物，具有較多局限性；大孔樹脂集吸附性與分子篩分離于一體，待分離目標(biāo)分子的體積及其與樹脂形成氫鍵或范德華力的作用大小直接影響分離效果；纖維素柱吸附能力有限且結(jié)果不穩(wěn)定，已很少使用；離子交換樹脂通常只用作黃酮粗提液的預(yù)處理，洗脫水溶性雜質(zhì)，降低后續(xù)分離難度。在眾多載體中，以硅膠、聚酰胺、葡聚糖凝膠和大孔樹脂最為常用，其優(yōu)缺點(diǎn)如表1所示。

Zhang等[10]比較了D101、D201、AB-8、HPD400、D301和D311 6種大孔樹脂對銀杏黃酮苷(槲皮素、山柰酚、異鼠李素)的富集效果。結(jié)果顯示，AB-8樹脂吸附效果最佳，3種黃酮苷的純度從提取物中的8.93%，9.88%，6.11%分別增加到30.12%，35.21%，14.14%，回收率分別為88.76%，93.78%，60.90%。Hou等[11]研究了D101、DM301、NKA-Ⅱ、NKA-9、X-5、AB-8、HPD-100、HPD-400、HPD-600和HPD-750 10種大孔樹脂對越南槐總黃酮的吸附和解吸特性，結(jié)果表明，AB-8型樹脂吸附性能最佳，吸附量高達(dá)18.30 mg/g，在此基礎(chǔ)上，以AB-8型樹脂為填料，通過柱層析對總黃酮進(jìn)一步純化，最終提取物中總黃酮含量從12.14%上升到57.82%，提高了約4.76倍。為使分離效果更佳，多種柱色譜串聯(lián)使用成為一種趨勢。劉曉艷等[12]采用硅膠、大孔樹脂和Sephadex LH-20凝膠等柱色譜從雞血藤水提物的乙酸乙酯和正丁醇萃取部位分離并鑒定了異豆素、柚皮素和毛蕊異黃酮等23個黃酮類化合物。鄭丹丹等[13]綜合應(yīng)用硅膠、大孔樹脂和Sephadex LH-20凝膠柱色譜對蛇床子乙醇提取物進(jìn)行分離，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定，共分離出13種黃酮物質(zhì)，其中D-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-β-D-半乳糖苷和山柰酚-3-O-葡萄糖基-(1→6)-O-葡萄糖苷等7種物質(zhì)均是首次從蛇床屬植物中得到。利用柱色譜法從天然植物中分離純化黃酮類化合物已經(jīng)十分普遍。單一柱色譜法通常用于從黃酮粗提液中獲得總黃酮物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)黃酮物質(zhì)與非黃酮物質(zhì)的初步分離，而多種柱色譜法的串聯(lián)分離度更高，分離效率也更高，在單一柱色譜法的基礎(chǔ)上使總黃酮物質(zhì)含量達(dá)到更高，或進(jìn)一步獲得黃酮單體。

1.2 制備型高效液相色譜法

制備型高效液相色譜 (Preparative high performance liquid chromatography，PHPLC)通過高負(fù)載、高分離度的制備柱來實(shí)現(xiàn)組分分離，其處理量大，效率高，重現(xiàn)性好，能根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)配備不同的檢測器[14]，其制備規(guī)模與適用范圍如表2所示。

Fan等[16]建立了制備型二維正相液相色譜(NPLC)和反相液相色譜(RPLC)結(jié)合固相萃取技術(shù)從甘草中分離純化黃酮類化合物的方法。黃酮粗提液經(jīng)固相萃取處理后可去除大多數(shù)非黃酮物質(zhì)，在此基礎(chǔ)上，一維中使用NPLC成功從甘草粗提物中獲得了16種黃酮組分，二維中使用RPLC分離在NPLC模式下洗脫的組分。經(jīng)NPLC和RPLC分離后，共純化出24種黃酮單體，純度均在90%以上，最高可達(dá)99.25%。Li等[17]建立的離線二維PHPLC從積雪草中分離黃酮類化合物，先后以苯基反相柱和C18反相柱作為固定相，成功獲得了純度超過98%的類黃酮苷。Zhuang等[18]依托在線型制備型液相色譜，以C18柱為固定相，乙腈—水為流動相，梯度洗脫，從朝鮮淫羊藿粗提液中成功分離出山柰酚-3,7-di-O-α-l-鼠李糖苷、二葉淫羊藿苷A和二葉淫羊藿苷等18種高純度黃酮類化合物，而該系統(tǒng)整個分離時(shí)間僅為20 h，周期較短，可為從其他天然產(chǎn)物中分離復(fù)雜組分提供有效借鑒。制備型高效液相色譜由分析型高效液相色譜發(fā)展而來，以目標(biāo)產(chǎn)物的純度、產(chǎn)量、生產(chǎn)周期和運(yùn)行成本等為主要考慮因素。近年來，制備型高效液相色譜已成為當(dāng)代高效分離純化的研究前沿。

表1 柱色譜技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 Advantages and disadvantages of column chromatography technology

表2 制備型高效液相色譜柱規(guī)格參數(shù)[15]Table 2 Specifications of preparative high performance liquid chromatography columns

1.3 薄層色譜法

薄層色譜法(Thin-layer chromatography，TLC)是將厚度約為0.10～0.25 mm的吸附劑(硅膠或化學(xué)鍵合硅膠、纖維素、氧化鋁和聚酰胺等)鋪在一定尺寸的表面平整的玻璃、鋁板或塑料板上作為固定相，用展開劑將樣品展開，從而實(shí)現(xiàn)色譜分離的一種技術(shù)。常用類型有高效薄層色譜[19]、制備薄層色譜[20]、反相薄層色譜[21]、微乳薄層色譜[22]和離心薄層色譜[23]等。高穎等[24]以微乳薄層色譜從舒筋定痛膠囊和蘇氏接骨膠囊中分離出柚皮苷和金絲桃苷，為研究含黃酮類成分的藥物提供了一種簡便、準(zhǔn)確、高效的分析方法。趙惠茹等[25]以聚酰胺為固定相，十二烷基硫酸鈉—正丁醇—正己烷—水組成的微乳體系為展開劑，對槐米中黃酮類成分進(jìn)行分離，最終得到的斑點(diǎn)數(shù)目多，且斑點(diǎn)圓整不拖尾、熒光強(qiáng)度強(qiáng)，表明該法適合槐米中黃酮類組分的分離。

1.4 超臨界流體色譜法

超臨界流體色譜(Supercritical fluid chromatography，SFC)是以超臨界流體為流動相，固體吸附劑或鍵合到載體上的高聚物為固定相的色譜。因CO2兼具化學(xué)惰性、無毒無害和容易制備等優(yōu)點(diǎn)，且臨界溫度和壓力容易達(dá)到，故在SFC中最為常用，但CO2極性較小，因此常添加甲醇等改性劑用于分離極性較大的物質(zhì)[26]。劉志敏等[27]采用SFC成功分離了3-羥基黃酮、6-羥基黃酮和7-羥基黃酮，試驗(yàn)表明流動相組成對分離影響最為顯著，單純的CO2不能將3種組分徹底洗脫，加入少量的磷酸則可顯著改變3種組分的色譜行為，從而成功將3種組分高效分離。吳曉聞等[28]在溫度40 ℃，壓力20～40 MPa下，以添加了10% H2O的CO2作為流動相，C18為色譜柱，成功分離了山柰素、楊梅素和槲皮素3種單體。楊杰等[29]通過優(yōu)化色譜柱、改性劑、添加劑和柱溫等色譜條件，確定了SFC分離黃酮的一般色譜條件，并探究了黃酮物質(zhì)在SFC上的色譜行為規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)相近的黃酮類化合物通過SFC能實(shí)現(xiàn)很好的分離。相比其他分離純化技術(shù)，超臨界分離技術(shù)克服了廢棄有機(jī)溶劑多，污染大，耗時(shí)長的缺點(diǎn)，具有快速、高效和環(huán)保的優(yōu)勢。

1.5 高速逆流色譜法

高速逆流色譜(High-speed counter-current chromatography，HSCCC)是一種利用混合物中各組分在兩液相間分配系數(shù)的差異，由移動相形成液滴通過作為固定相的液柱來實(shí)現(xiàn)混合物分離的技術(shù)[30]。該法不僅分離過程僅取決于目標(biāo)物的溶解性能，不存在樣品損失或變性，具有持續(xù)高效、回收率高和分離量大等優(yōu)點(diǎn)，而且不需要固體擔(dān)體，避免了柱色譜法分離時(shí)因酚羥基與固體擔(dān)體產(chǎn)生不可逆吸附而難以洗脫的缺點(diǎn)。對于HSCCC分離，其溶劑系統(tǒng)和洗脫方式的選擇是保證分離效果的前提，故對溶劑系統(tǒng)和洗脫方式的研究十分重要。

1.5.1 高速逆流色譜溶劑體系的選擇 當(dāng)前對于溶劑系統(tǒng)的優(yōu)化常用 Ito、Oka和Arizona等方法[31-32]，該法提供了16種或23種可選溶劑體系，但需要依次試驗(yàn)，耗時(shí)繁瑣。隨后Chen等[33]提出的NRTL-SAC(非隨機(jī)雙液段活度系數(shù))模型將溶劑與溶質(zhì)之間的相互作用描述為4個分段：疏水性分段、給電子分段、吸電子分段和親水性分段，該模型簡單實(shí)用，預(yù)測精度高，只需少量試驗(yàn)數(shù)據(jù)即可篩選出最佳溶劑體系。梁君玲等[34]又以HEMWat(正己烷—乙酸乙酯—甲醇—水)體系為基礎(chǔ)，借助9×9排列表得到的溶劑體系選擇方案(如圖1、圖2所示)。在該體系中，其分配系數(shù)的對數(shù)(lgK)與對應(yīng)溶劑比例呈線性關(guān)系，實(shí)際過程中在表中隨機(jī)選取兩個溶劑體系，只需分別獲得這兩個體系中化合物的分配系數(shù)，即可通過回歸方程y(體系數(shù))=algK+b(a，b為擬合系數(shù))，最終確定分配系數(shù)最佳的溶劑體系。

1.5.2 高速逆流色譜洗脫方式的選擇 通常情況，同一流動相僅能洗脫一定極性范圍內(nèi)的組分，而對于復(fù)雜組分，當(dāng)其極性和濃度差異大以及分配系數(shù)相近時(shí)，則需變換洗脫方式，常用洗脫方式主要有梯度洗脫、雙向洗脫、閉路循環(huán)洗脫和推擠洗脫等[35-37]，各洗脫方式優(yōu)缺點(diǎn)如表3所示。

圖1 溶劑體系9×9表Figure 1 Solvent system 9×9 table

圖2 K值估算模型Figure 2 Estimation model of K

高速逆流色譜多與其他分離技術(shù)聯(lián)合使用，常作為最終純化技術(shù)分離黃酮單體，相關(guān)實(shí)例如表4所示。

1.6 多種色譜技術(shù)耦合分離純化黃酮類化合物

熊朝棟等[46]以氯仿—甲醇—水(V氯仿∶V甲醇∶V水=13∶6∶2)為展開劑，初步從玳玳果黃酮提取物分離得到新橙皮苷和柚皮苷，其純度分別為69.24%和75.45%，再經(jīng)高壓液相色譜分離，其純度分別達(dá)到98.84%和98.81%。Wang等[47]依次使用大孔樹脂柱色譜，中壓液相色譜和高速逆流色譜純化大麥苗粗提液中6?-芥子酰皂草苷、異金雀花素7-O-(6?-阿魏酰基)葡萄糖苷、6?-阿魏酰基皂草苷和(芹菜素7-木塘基(1?→2″)葡萄糖苷)4種黃酮類化合物。結(jié)果顯示，總黃酮含量從粗提取物中的2.2%增加到中壓液相色譜中的95.3%，再經(jīng)高速逆流色譜純化后，4種黃酮物質(zhì)的純度均高于98%，而且其中6?-阿魏?；聿蒈蘸?芹菜素7-木塘基(1?→2″)葡萄糖苷)的保留時(shí)間幾乎相同，表明高速逆流色譜對極性相似物質(zhì)的分離有巨大潛力。Wu等[48]通過使用大孔樹脂柱色譜結(jié)合制備高效液相色譜純化鳶尾根乙醇提取物中的6種異黃酮，通過AB-8樹脂分離后，總黃酮含量從粗提物中的10.60%增加至54.20%，回收率為75.12%。再經(jīng)PREP-HPLC純化后，6種異黃酮(鳶尾苷、鳶尾甲苷B、鳶尾甲苷A、鳶尾黃素、鳶尾甲黃素A和鳶尾甲黃素B)的純度分別達(dá)到99.8%，98.2%，82.2%，99.6%，92.5%，95.8%。Panida等[49]使用Sephadex LH-20凝膠柱和半制備型反相高效液相色譜(RP-HPLC)對香蕉葉蘆丁提取液進(jìn)行純化，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱純化后，其純度最高可達(dá)74%～84%，再經(jīng)RP-HPLC進(jìn)一步純化，純度可達(dá)98.4%。多種色譜技術(shù)的有機(jī)結(jié)合將各種色譜技術(shù)的優(yōu)勢集于一體，在降低分離成本，提高分離效率和產(chǎn)品純度等方面具有顯著優(yōu)勢，現(xiàn)今將多種色譜技術(shù)耦合分離純化黃酮類化合物已成為研究者們關(guān)注的熱點(diǎn)。

表3 各洗脫方式優(yōu)缺點(diǎn)比較Table 3 Comparison of advantages and disadvantages of each elution method

表4 高速逆流色譜在黃酮單體分離中的應(yīng)用Table 4 Application of high-speed countercurrent chromatography technology in the separation of flavonoid monomers

2 總結(jié)與展望

天然植物中黃酮類化合物種類繁多，功效廣泛，但由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含量低，從天然植物中對其進(jìn)行分離純化是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)的工作。傳統(tǒng)柱色譜法、制備型高效液相色譜法存在分離周期長、溶劑耗費(fèi)大、操作步驟繁瑣以及難以工業(yè)化的缺點(diǎn)。薄層色譜溶劑用量少，分離速度快，結(jié)果準(zhǔn)確，兼具分離分析功能，但當(dāng)前在黃酮物質(zhì)的分離純化過程中應(yīng)用較少；超臨界流體色譜常以CO2作為流動相，不使用有機(jī)溶劑，成本低，對環(huán)境友好，而且分離效率高，是一種綠色的分離純化技術(shù)；高速逆流色譜作為一種新興的現(xiàn)代色譜分離技術(shù)，已被廣泛用于黃酮類化合物的分離純化研究中，未來應(yīng)用前景廣闊。

色譜分離在黃酮類化合物的分離純化中取得了卓越進(jìn)步，但仍然存在一些問題，需重點(diǎn)關(guān)注以下幾個方面：① 制備型液相色譜理論基礎(chǔ)較為成熟，但色譜柱作為其核心部件，仍舊存在價(jià)格高昂和填充技術(shù)不成熟等缺點(diǎn)。另外如何將分析型和制備型液相色譜有機(jī)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)一體化操作以提高其定性能力還需進(jìn)一步探究。② 高速逆流色譜在溶劑體系的優(yōu)化方面雖取得了長足的進(jìn)步，但當(dāng)前仍停留在經(jīng)驗(yàn)層面，在溶劑體系的理論指導(dǎo)和機(jī)理探究以及檢測限和靈敏度等方面也需進(jìn)一步研究。③ 在分離復(fù)雜樣品時(shí)，常規(guī)的單柱色譜技術(shù)可能難以滿足分離要求，將多根色譜柱串聯(lián)或并聯(lián)起來用于天然產(chǎn)物的分離純化將是未來的發(fā)展趨勢。④ 相較于一維色譜系統(tǒng)，二維色譜系統(tǒng)具有更好的峰容量和分離度，特別是針對較為復(fù)雜的體系。二維色譜系統(tǒng)分析策略包含在線分離和離線分離兩種，其中二維溶劑選擇范圍廣，峰容量大，成本低，不受流動相兼容性的限制，而在線二維在不同分離濃度間的流動相與流速的兼容性仍需進(jìn)一步優(yōu)化。⑤ 固相萃取、加速溶劑萃取和超臨界萃取等作為一種前處理技術(shù)，可用于黃酮與非黃酮物質(zhì)的分離，能有效降低后續(xù)黃酮物質(zhì)的分離難度。