基于核酸適配體檢測動(dòng)物性食品中卡那霉素殘留研究進(jìn)展

馬婧怡 田 冰 王 鑫 陶曉奇

(1. 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715;2. 國家級(jí)食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(西南大學(xué))，重慶 400715)

卡那霉素(kanamycin)是從鏈霉菌或小單胞菌培養(yǎng)液中提取，或以天然品為原料半合成提取而獲得的一種堿性氨基糖苷類抗生素[1]，主要通過抑制細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成而起到殺滅細(xì)菌的作用。其能夠抑制葡萄球菌、巴氏桿菌、沙門氏菌等細(xì)菌的生長繁殖，常被用于治療畜禽細(xì)菌感染[2-4]。由于廉價(jià)且抗菌性好的特點(diǎn)，卡那霉素被作為獸藥在畜禽養(yǎng)殖中廣泛使用，但濫用會(huì)導(dǎo)致其在動(dòng)物性食品中殘留超標(biāo)，長期攝入將對人體產(chǎn)生腎毒性、造血系統(tǒng)毒性等毒副作用[5-6]，如2012年的“速成雞”事件[7]。中國、歐盟、日本以及美國均制定了動(dòng)物性食品中卡那霉素的最高殘留限量(MRLs)，歐盟規(guī)定MRLs為：肉類100 μg/kg、肝臟600 μg/kg、腎臟2 500 μg/kg、牛奶150 μg/kg[8]；中國的GB 31650—2019中規(guī)定MRLs為：肌肉100 μg/kg、皮脂100 μg/kg、肝臟600 μg/kg、腎臟2 500 μg/kg、奶150 μg/kg。因此，為規(guī)范養(yǎng)殖業(yè)中卡那霉素的使用及維護(hù)食品安全，建立快速且準(zhǔn)確的檢測方法具有重要意義。

目前，卡那霉素殘留的檢測方法有儀器分析法和免疫分析法。儀器分析法主要有高效液相色譜法(HPLC)[9]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[10]、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)[11]等，這類方法靈敏度高，但設(shè)備昂貴、檢測程序復(fù)雜且對試驗(yàn)人員要求較高[12]?；谔禺愋陨镒R(shí)別元件的免疫分析方法，因具有快速靈敏、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品檢測中，其常用的特異性生物探針有抗體和適配體?？贵w作為一種傳統(tǒng)的免疫分析方法識(shí)別元件，其生產(chǎn)成本高、周期長、免疫活性不穩(wěn)定且修飾標(biāo)記復(fù)雜[13-14]。核酸適配體作為一種新型識(shí)別元件，是經(jīng)體外篩選技術(shù)(SELEX)篩選出的具有目標(biāo)物特異性識(shí)別功能的單鏈DNA或RNA，由于其生產(chǎn)成本低、合成快、親和力強(qiáng)、穩(wěn)定且易于修飾標(biāo)記，近年來在食品檢測領(lǐng)域中迅速發(fā)展[15]。文章擬對動(dòng)物性食品中卡那霉素殘留的核酸適配體檢測方法進(jìn)行綜述，總結(jié)其發(fā)展現(xiàn)狀，并展望其未來發(fā)展方向，以期為保障食品安全，建立簡便快速的檢測方法提供依據(jù)。

1 核酸適配體

核酸適配體是一段能與靶標(biāo)分子特異性結(jié)合的單鏈DNA或RNA序列，一般由10～100個(gè)核苷酸堿基組成，可以特異性結(jié)合酶、抗體、金屬離子、生物毒素等的靶標(biāo)分子。由于性能優(yōu)越，其常被用于快速高效地檢測動(dòng)物性食品中抗生素殘留[16-17]。近年來，基于適配體檢測動(dòng)物性食品中卡那霉素殘留所使用的適配體序列如表1所示。由表1可知，可用于檢測的適配體種類較少，而且在大多數(shù)檢測方法中都使用了5'-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3'這一適配體序列，其親和性被普遍認(rèn)同，且此適配體用于卡那霉素檢測中，大約有82%的文獻(xiàn)使用了該序列。但有研究[35]表明，5'-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3'這一最常用的適配體序列似乎不能與卡那霉素發(fā)生特異性結(jié)合；同時(shí)，有關(guān)聯(lián)合使用納米金(AuNPs)與適配體用于卡那霉素的檢測方法中，忽略了AuNPs與靶標(biāo)分子間(卡那霉素)的相互作用，卡那霉素可強(qiáng)烈吸附在AuNPs上?；诤怂徇m配體檢測卡那霉素殘留時(shí)，常用標(biāo)記適配體、核酸擴(kuò)增、與納米材料聯(lián)合應(yīng)用等方法提高其靈敏度，而對適配體的探索與改進(jìn)卻較少。而改良的SELEX可篩選出性能更好的適配體，并且更加經(jīng)濟(jì)高效[36]，為適配體的商業(yè)化應(yīng)用提供了可能；Zhang等[37]設(shè)計(jì)出提供多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的多價(jià)適配體，增強(qiáng)了對目標(biāo)分子的親和力，為適配體檢測方法的改進(jìn)提供了新策略。

2 檢測方法

目前，基于核酸適配體檢測動(dòng)物性食品中卡那霉素殘留的檢測方法主要包括比色法、熒光法、電化學(xué)法、表面增強(qiáng)拉曼散射法等。

2.1 比色法

比色法是通過比較或測量有色物質(zhì)溶液顏色來分析待測物質(zhì)含量的一種方法，該方法無需復(fù)雜昂貴的檢測設(shè)備，只需利用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，具有操作簡便、檢測快速且檢測結(jié)果肉眼可見等優(yōu)點(diǎn)。常見的比色法有兩類：利用AuNPs聚集顯色和利用過氧化物酶活性催化顯色。

2.1.1 基于納米金聚集顯色 核酸適配體易于修飾標(biāo)記，這使得檢測方法靈活多樣，尤其是與AuNPs的聯(lián)用最為廣泛，適配體可通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合在AuNPs表面，當(dāng)AuNPs被某種條件誘發(fā)時(shí)會(huì)產(chǎn)生聚集，此時(shí)由于表面等離子體共振吸收(SPR)的變化會(huì)呈現(xiàn)出與分散狀態(tài)下不同的光學(xué)性質(zhì)[38]，通過檢測加入目標(biāo)物質(zhì)前后溶液顏色的變化，即可分析目標(biāo)物質(zhì)含量。

AuNPs的聚集可以由多種因素誘發(fā)，如利用AuNPs表面的修飾探針與適配體雜交，形成AuNPs/探針/適配體聚合物，導(dǎo)致AuNPs聚集?；谶@一原理，Zhou等[18]利用與適配體3'端和5'端分別互補(bǔ)的兩種單鏈DNA(ssDNA1/ssDNA2)修飾AuNPs，適配體與這兩種功能化AuNPs一起孵化時(shí)會(huì)形成聚合物(AuNPs/ssDNAs/適配體)，當(dāng)卡那霉素存在時(shí)，適配體會(huì)與卡那霉素結(jié)合從而競爭性解離AuNPs聚合物，并使溶液的紫外可見光譜發(fā)生改變。該方法具有良好的特異性與準(zhǔn)確性，檢測范圍為1～500 nmol/L，檢測限為1 nmol/L，可用于牛奶樣品中卡那霉素殘留物的檢測,但該方法功能化AuNPs的表面修飾和分離過程復(fù)雜繁瑣，檢測效率低。

表1 卡那霉素的適配體序列Table 1 The aptamer sequence of kanamycin

利用高濃度的鹽誘導(dǎo)AuNPs聚集的檢測方法則無需復(fù)雜的修飾分離過程，能有效提高檢測效率。張彩艷等[19]利用這一原理對牛奶中的卡那霉素殘留進(jìn)行了檢測，試驗(yàn)原理如圖1(a)所示。當(dāng)樣品中無卡那霉素時(shí)，核酸適配體與其互補(bǔ)單鏈DNA形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，加入卡那霉素后，核酸適配體與卡那霉素結(jié)合，釋放出互補(bǔ)單鏈DNA吸附于AuNPs表面，導(dǎo)致AuNPs在高鹽條件下仍能保持穩(wěn)定，顏色不會(huì)發(fā)生改變。該方法具有良好的選擇性與靈敏度，線性范圍為0.02～0.30 μmol/L，檢出限為8 nmol/L，同樣無需對AuNPs表面進(jìn)行修飾，Li等[20]基于魚精蛋白與AuNPs間存在很強(qiáng)的靜電相互作用，設(shè)計(jì)了一款基于外切酶I(Exo I)輔助信號(hào)放大和魚精蛋白誘導(dǎo)AuNPs聚集的傳感器，利用外切酶輔助有效放大了傳感器產(chǎn)生的信號(hào)以實(shí)現(xiàn)超靈敏檢測，該方法選擇性極佳，線性范圍為0.000 1～10.000 0 nmol/L，檢測限為0.028 pmol/L，并且檢測時(shí)只需將適配體/互補(bǔ)DNA雙鏈探針、目標(biāo)物、魚精蛋白和AuNPs簡單均勻混合到溶液中，操作步驟簡單。

雖然依據(jù)AuNPs聚集與否的比色法具有很多優(yōu)勢，但當(dāng)適配體不存在時(shí)，卡那霉素可直接吸附到未經(jīng)修飾的AuNPs上，干擾其表面的電荷分布，產(chǎn)生假陽性比色信號(hào)[39]，且AuNPs易受復(fù)雜反應(yīng)體系影響產(chǎn)生非特異性聚集變色[40]，這些干擾因素在設(shè)計(jì)檢測方法時(shí)不可忽視。

2.1.2 基于過氧化物酶活性催化顯色 此類顯色反應(yīng)常以酶催化氧化3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色反應(yīng)為基礎(chǔ)[41]。天然酶如辣根過氧化物酶(HRP)常被用于催化H2O2-TMB體系顯色，其催化效率高、專一性強(qiáng)，但易受物理和化學(xué)因素影響而失活。鑒于此，利用納米酶或脫氧核酶(DNAzyme)模擬過氧化物酶活性催化H2O2-TMB體系顯色的方法，在食品檢測領(lǐng)域快速發(fā)展[42]。

相比于天然酶，納米酶具有高效、穩(wěn)定、易獲得等優(yōu)勢，是最具前景的天然酶替代材料之一。基于納米酶的比色法具有穩(wěn)定、方便的優(yōu)點(diǎn)。Tang等[21]利用碳基納米材料模擬過氧化物酶活性，設(shè)計(jì)了比色傳感器用于檢測卡那霉素殘留，其試驗(yàn)原理如圖1(b)所示。該方法中游離卡那霉素適配體(Ky2適配體)通過范德華力吸附在二硫化鎢(WS2)納米片表面，提高納米酶與TMB的親和力，導(dǎo)致分層WS2納米片的過氧化物酶模擬活性顯著提升，催化H2O2-TMB體系轉(zhuǎn)化為藍(lán)色。加入卡那霉素后，Ky2適配體與卡那霉素優(yōu)先結(jié)合，進(jìn)而從WS2上脫離下來，不再增強(qiáng)WS2納米片的過氧化物酶模擬活性，溶液呈淺藍(lán)色甚至無色。這種傳感器平均回收率為93.0%～110.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)差為3.5%～8.7%，線性范圍為0.1～0.5 μmol/L，檢測限達(dá)0.06 μmol/L，且WS2納米片具有良好穩(wěn)定性(貯藏1～2年催化活性幾乎不受影響)及可重復(fù)使用性(6個(gè)循環(huán)后保持約85%的催化活性)。Liu等[22]利用貴金屬納米酶模擬過氧化物酶活性，設(shè)計(jì)了基于適配體的切口酶輔助信號(hào)放大的超靈敏比色傳感器。該試驗(yàn)制備了一種含有DNA適配體的發(fā)夾探針，當(dāng)卡那霉素存在時(shí)，探針中的靶DNA會(huì)游離出來與信號(hào)探針雜交，此時(shí)切口酶切割信號(hào)探針釋放出鉑納米顆粒(PtNPs)，靶DNA則進(jìn)入下次循環(huán)，磁分離后積累的大量PtNPs將催化H2O2-TMB體系顯示藍(lán)色。此方法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差約為3.63%，靈敏度與選擇性良好，檢測極限為0.000 2 μg/kg遠(yuǎn)低于需檢測水平150 μg/kg。雖然納米酶具有諸多優(yōu)勢，但是與天然酶相比其選擇性方面仍有欠缺，且大多數(shù)納米酶活性較低[43]，因此發(fā)展種類更為廣泛且性能較好的納米酶對檢測技術(shù)的進(jìn)步具有重要意義。

圖1 基于卡那霉素適配體的比色法檢測卡那霉素Figure 1 Determination of the aptasensor for detection of kanamycin based on colorimetric methods

利用具有催化功能的DNAzyme模擬過氧化物酶活性同樣可以催化H2O2-TMB體系顯色，Chen等[23]將具催化功能的DNAzyme(S1)與卡那霉素適配體(S2)雜交來抑制S1過氧化物酶催化活性，當(dāng)加入卡那霉素時(shí)，適配體與卡那霉素特異性結(jié)合，釋放出S1催化H2O2-TMB體系變色，同時(shí)由于S2與卡那霉素結(jié)合形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其發(fā)夾尾部可以與單鏈核苷酸(S3)進(jìn)行互補(bǔ)配對，觸發(fā)外切酶III(Exo III)切割S2，釋放卡那霉素進(jìn)行目標(biāo)物回收使S1數(shù)量增多，從而起到放大信號(hào)的作用。最佳條件下，該方法回收率為91.1%～109.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)差低于9.3%，吸光度和卡那霉素質(zhì)量濃度對數(shù)值在0.000 1～10.000 0 μg/L內(nèi)有良好的線性關(guān)系，檢測極限約為0.045 pg/mL，具有很好的可重復(fù)性，并且該方法中所有反應(yīng)都在均勻系統(tǒng)中一步進(jìn)行，無需費(fèi)時(shí)費(fèi)力的表面修飾、孵化及復(fù)雜納米材料的合成等過程，具有成本較低且無需復(fù)雜標(biāo)記的突出優(yōu)勢。

比色法簡便快速、成本較低，且具有檢測結(jié)果可直接用肉眼進(jìn)行觀察的優(yōu)勢，但是存在檢測中干擾嚴(yán)重、靈敏度低、需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理過程等缺點(diǎn)。其常常利用AuNPs聚集與過氧化物酶活性催化顯色，但AuNPs的聚集易受干擾[39-40]，且納米酶與DNAzyme存在活性與特異性欠佳等問題[43]，因此局限了比色法在卡那霉素檢測中的應(yīng)用。

2.2 熒光法

熒光法是基于一些熒光物質(zhì)能夠在一定激發(fā)波長下發(fā)出熒光的原理，通過檢測熒光強(qiáng)度的變化來對物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析的方法[15]，對試驗(yàn)儀器要求低、靈敏度高且受外界影響小[44]。核酸適配體具有易被修飾標(biāo)記的優(yōu)良特性，常對核酸適配體或其互補(bǔ)鏈進(jìn)行熒光標(biāo)記，因此往往可以根據(jù)是否進(jìn)行熒光標(biāo)記將熒光法分為熒光標(biāo)記型和熒光非標(biāo)記型。

2.2.1 熒光法標(biāo)記型 熒光標(biāo)記型檢測方法需要對探針進(jìn)行熒光標(biāo)記。常用的核酸適配體熒光標(biāo)記材料有熒光染料、量子點(diǎn)和貴金屬納米簇等[15]。Deng等[24]利用熒光染料Cy3、Cy5標(biāo)記的核酸鏈對卡那霉素進(jìn)行檢測，其中聚合酶催化擴(kuò)增(PCA)和催化發(fā)夾自組裝(CHA)兩個(gè)循環(huán)信號(hào)放大過程大大提高了靈敏度及選擇性，檢測原理如圖2(a)所示。第1個(gè)過程中適配體與其部分互補(bǔ)DNA鏈(cDNA)雜交，當(dāng)加入卡那霉素后釋放出cDNA與模板DNA鏈(pDNA)雜交，并在聚合酶作用下從cDNA的3'端以pDNA為模板進(jìn)行聚合，新生成的序列可通過內(nèi)切酶切割而釋放出復(fù)制DNA鏈(H0)。第2個(gè)過程由H0觸發(fā)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA鏈H1的3'端被Cy3標(biāo)記而發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA鏈H2的5'端被Cy5標(biāo)記，H0存在時(shí)可打開H1、H2鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成H1/H2雙鏈，并釋放H0繼續(xù)進(jìn)行信號(hào)循環(huán)放大，H1/H2的雙鏈結(jié)構(gòu)使Cy3、Cy5互相接近，產(chǎn)生基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理的熒光信號(hào)。該傳感器回收率為88.1%～100.2%，在1.0～80.0 nmol/L內(nèi)具有良好的線性相關(guān)關(guān)系(R2=0.990 1)，檢測限低至0.29 nmol/L，在牛奶樣品中取得了良好的檢測結(jié)果。同樣基于FRET檢測原理，Ha等[25]將熒光基團(tuán)6-羧基熒光素(FAM)作為供體，還原氧化石墨烯(rGO)作為受體，設(shè)計(jì)了一種熒光傳感器。將適配體的5'端用FAM標(biāo)記，其可以通過π—π鍵吸附于rGO表面而導(dǎo)致FMA熒光淬滅，當(dāng)卡那霉素存在時(shí)則會(huì)誘導(dǎo)FAM標(biāo)記的適配體從rGO表面脫落，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)。這種檢測方法快速、靈敏，線性范圍為1.0～20.0 pmol/L，檢測極限為1 pmol/L，并且所有試驗(yàn)過程不超過1 h，可用于快速檢測卡那霉素殘留。標(biāo)記型的熒光法需要對探針進(jìn)行熒光標(biāo)記，雖然這種檢測方法更為靈敏，卻存在標(biāo)記過程復(fù)雜費(fèi)時(shí)、不同批次的探針間可能存在差異等弊端。

2.2.2 熒光法非標(biāo)記型 非標(biāo)記型的熒光法無需進(jìn)行熒光標(biāo)記，不僅簡化了試驗(yàn)還避免了探針間可能存在的差異。Yang等[26]基于N-甲基卟啉二丙酸 IX(NMM)與G-四鏈體結(jié)構(gòu)結(jié)合后其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)這一現(xiàn)象，設(shè)計(jì)了一種簡單的無標(biāo)記熒光檢測法用于檢測卡那霉素，試驗(yàn)原理如圖2(b)所示。其設(shè)計(jì)了P1與P2兩條單鏈DNA，P1末端包含一個(gè)G-四鏈體DNA序列，P1中段與P2互補(bǔ)，P2為卡那霉素的DNA適配體。當(dāng)卡那霉素不存在時(shí)，P1與P2相互雜交，P1無法形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，添加NMM后，熒光強(qiáng)度不會(huì)增強(qiáng)。當(dāng)卡那霉素存在時(shí)，其與P2結(jié)合，導(dǎo)致P1釋放，加入NMM后，P1與NMM結(jié)合自折疊形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，此時(shí)熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。該方法選擇性與靈敏度較好，線型范圍為0.5～100.0 nmol/L，檢測限為0.5 nmol/L，并且無需熒光基團(tuán)的修飾，操作簡便。Zhou等[27]將適配體與發(fā)夾模版部分雜交，當(dāng)卡那霉素存在時(shí)，適配體脫離發(fā)夾模版并啟動(dòng)Mg2+依賴性DNA酶的自主合成，合成的DNA酶切割信號(hào)發(fā)夾底物，釋放出可以與熒光染料硫黃素T(ThT)結(jié)合的G-四鏈體使熒光顯著增強(qiáng)，利用熒光強(qiáng)度的變化可對卡那霉素含量進(jìn)行測定?；谝锝粨Q反應(yīng)(PER)，該熒光非標(biāo)記方法具有無標(biāo)簽、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，在1～500 nmol/L內(nèi)線性關(guān)系良好(R2=0.994 1)，檢測限達(dá)0.36 nmol/L。

熒光法靈敏穩(wěn)定、檢測設(shè)備簡單，可以定量檢測動(dòng)物性食品中卡那霉素殘留，但其使用需依賴物質(zhì)特定的熒光結(jié)構(gòu)。熒光法中標(biāo)記型探針標(biāo)記復(fù)雜且不同批次探針間可能有差異；非標(biāo)記型熒光法雖然無需標(biāo)記，但靈敏度不如前者，因而在檢測中常利用PER等信號(hào)放大手段有效提高檢測效率[27]，但同時(shí)也對試驗(yàn)條件有更嚴(yán)格的要求。

圖2 基于卡那霉素適配體的熒光法檢測卡那霉素Figure 2 Determination of the aptasensor for detection of kanamycin based on fluorescent methods

2.3 電化學(xué)分析法

電化學(xué)分析法是根據(jù)待測物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)，將化學(xué)量轉(zhuǎn)化為電學(xué)量而進(jìn)行定量分析的一種檢測方法，具有簡單快速、檢測靈敏等特點(diǎn)[45]。電化學(xué)傳感器主要由敏感分子識(shí)別元件和轉(zhuǎn)換器組成，敏感分子識(shí)別元件可與目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生作用，轉(zhuǎn)換器則負(fù)責(zé)輸出檢測信號(hào)。轉(zhuǎn)換器包含修飾層與電學(xué)系統(tǒng)兩部分，其中修飾層起到了將適配體與電極基底連接的作用，電學(xué)系統(tǒng)則將化學(xué)量放大轉(zhuǎn)換為電學(xué)量并顯示出來[46]。由傳感器設(shè)備輸出參數(shù)的不同，可將電化學(xué)分析法分為電化學(xué)阻抗譜和伏安法[41]。

2.3.1 電化學(xué)阻抗譜 電化學(xué)阻抗譜(EIS)是通過測量阻抗隨正弦波頻率的變化來對卡那霉素進(jìn)行測定的方法，其特異性與靈敏度良好、檢測速度快且無需標(biāo)記。如何高效率地將適配體結(jié)合在電極上是EIS面臨的關(guān)鍵問題之一，Kulikova等[28]在適配體傳感器表面層引入炭黑(CB)，利用CB、殼聚糖、硫雜杯芳烴復(fù)合物作為載體來固定適配體，這種表面層結(jié)構(gòu)使適配體傳感器對被測樣品的基質(zhì)化合物敏感性降低，該方法的線型范圍為0.7～50.0 nmol/L，檢測限為0.3 nmol/L，檢測牛奶和酸奶時(shí)，回收率為95%～115%。Sharma等[29]利用被修飾過的印刷碳電極(4-CP/SPCE)固定卡那霉素單鏈DNA適配體，再通過EIS進(jìn)行定量分析。這種固定形式極大提高了反應(yīng)平臺(tái)的穩(wěn)定性和靈敏度，該方法的線性范圍為1.20～600.00 ng/mL，檢測限為0.11 ng/mL，并且在結(jié)構(gòu)類似物鏈霉素(SRT)和慶大霉素(GENTA)存在時(shí)仍具有良好的選擇性，其無需標(biāo)記與可直接檢測的優(yōu)勢為現(xiàn)場檢測動(dòng)物性食品中卡那霉素的殘留提出了一種新方案。

2.3.2 伏安法 伏安法是以電流變化作為輸出信號(hào)來對卡那霉素進(jìn)行測定。由于這類方法可以有效消除背景電流、獲得良好的靈敏度與較低的檢測限，因而被廣泛使用。Yao等[30]合成了包含胺基功能化的金屬有機(jī)框架(UiO-66-NH2)、多壁碳納米管@還原氧化石墨烯納米帶(MWCNT@rGONR)，利用三聚氰胺和三聚氰胺單體縮聚(MCA表示)合成的共價(jià)有機(jī)框架。并將UiO-66-NH2/MCA/MWCNT@rGONR納米復(fù)合材料作為電極，使用方波伏安法(SWV)檢測了牛奶和魚肉中的卡那霉素殘留。首先將適配體互補(bǔ)DNA(cDNA)固定于納米復(fù)合材料電極表面，當(dāng)卡那霉素不存在時(shí)，適配體與電極表面的cDNA互補(bǔ)配對，亞甲藍(lán)(MB)被插入到適配體與其互補(bǔ)鏈形成的雙鏈結(jié)構(gòu)中以產(chǎn)生電流信號(hào)；添加卡那霉素后，適配體與卡那霉素特異性結(jié)合，這時(shí)雙鏈DNA中的MB被釋放導(dǎo)致電流減少，根據(jù)電流變化即可對卡那霉素進(jìn)行定量分析。該方法穩(wěn)定、靈敏、選擇性較高，線性范圍為25～900 nmol/L，檢測限為13 nmol/L。為實(shí)現(xiàn)卡那霉素的超靈敏檢測，許多信號(hào)放大策略應(yīng)運(yùn)而生，常用的信號(hào)放大策略有雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)、催化發(fā)夾結(jié)構(gòu)自組裝(CHA)以及各種工具酶等。Tian等[31]將二硫化釩/納米金(VS2/AuNPs)納米復(fù)合材料作為電極表面支撐材料，利用差動(dòng)伏安法(DPV)進(jìn)行檢測，并通過合理設(shè)計(jì)信號(hào)放大策略使檢測限大大降低，其中亞甲藍(lán)標(biāo)記的與適配體互補(bǔ)雜交的發(fā)夾DNA(MB-hDNA)和鈷鐵氧體(CoFe2O4)納米酶具有很好的信號(hào)放大作用。該傳感器檢測限低至0.5 pmol/L，線性范圍為0.001～1 000.000 nmol/L，用于牛奶樣品的回收率為91.24%～112.59%，相對標(biāo)準(zhǔn)差低于5.26%。此外這兩種檢測方法都具有可以通過改變適配體而對不同抗生素進(jìn)行檢測的優(yōu)點(diǎn)。

2.3.3 電化學(xué)發(fā)光法 將電化學(xué)分析法與化學(xué)發(fā)光法的優(yōu)勢相結(jié)合的電化學(xué)發(fā)光法(ECL)，由于具有發(fā)光反應(yīng)易控制、選擇性與靈敏性好的優(yōu)點(diǎn)而被用于食品檢測中[47]。Cheng等[32]設(shè)計(jì)了利用納米銀粒子(AgNPs)催化魯米諾—過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系以提高檢測靈敏度的適配體傳感器，AgNPs與魯米諾和適配體以銀—氨鍵結(jié)合，使得ECL的穩(wěn)定性和敏感性增強(qiáng)，再根據(jù)ECL的強(qiáng)度即可確定卡那霉素濃度。該傳感器準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性好，線性范圍為0.5～100.0 ng/mL，檢測限為0.06 ng/mL，并且同樣可以通過改變適配體而用于不同目標(biāo)物質(zhì)的檢測。這種將多種方法結(jié)合應(yīng)用以提高效率的檢測方法，為食品檢測提供了新方向。

與其他檢測方法相比，電化學(xué)分析法檢測成本低、反應(yīng)速度快，并且具有易微型化、易實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測的突出優(yōu)勢，因此在現(xiàn)場快速檢測中具有其他方法難以實(shí)現(xiàn)的應(yīng)用潛力[46]。但是基于電化學(xué)分析法的檢測方法仍面臨許多問題，如何固定適配體以提高檢測效率、如何避免非特異性吸附、如何設(shè)計(jì)制造簡便且成本低廉的電極材料以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，這些問題都使電化學(xué)分析方法在基質(zhì)復(fù)雜的食品檢測中的使用受限[48]。

2.4 表面增強(qiáng)拉曼散射法

表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)的檢測原理為將待測物分子吸附于粗糙納米金屬材料表面，使待測物的拉曼信號(hào)增強(qiáng)104～107倍，因其靈敏、簡便、響應(yīng)快、無需進(jìn)行復(fù)雜的樣品預(yù)處理等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品檢測領(lǐng)域。其同樣可以有效檢測動(dòng)物性食品中卡那霉素殘留。隨著激光及納米技術(shù)的快速發(fā)展，SERS的靈敏度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性都獲得了很大提升。

SERS檢測法獲得信號(hào)的質(zhì)量與活性基底的選擇關(guān)系密切，Jiang等[33]以結(jié)合了AgNPs與AuNPs各自的性能優(yōu)點(diǎn)的復(fù)合金@銀核殼(Au@Ag)結(jié)構(gòu)作為活性基底，利用SERS原理實(shí)現(xiàn)了卡那霉素的超靈敏檢測，其試驗(yàn)原理如圖3所示。將探針DNA結(jié)合到AuNPs表面，包裹銀殼后添加被熒光染料Cy3標(biāo)記的適配體，此時(shí)被標(biāo)記的適配體與探針DNA堿基互補(bǔ)配對。當(dāng)加入卡那霉素后，這種互補(bǔ)配對發(fā)生解離，此時(shí)Cy3遠(yuǎn)離銀殼導(dǎo)致SERS信號(hào)減弱。這種方法線性范圍為10-7～10-11g/mL，檢測限低至0.90 pg/mL，在牛奶樣品中回收率達(dá)90.4%～112.0%，并且總試驗(yàn)時(shí)間低于1 h。田潤[49]將DNA滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)技術(shù)與SERS聯(lián)用，開發(fā)了一種簡便、靈敏檢測卡那霉素的適配體傳感器。核酸適配體被組裝到磁珠上，并與其互補(bǔ)鏈雜交形成生物探針。當(dāng)卡那霉素存在時(shí)，互補(bǔ)鏈被釋放并利用RCA技術(shù)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)捕獲封閉磁珠和無標(biāo)記封閉Au@Au核殼，經(jīng)磁分離得到磁珠—核殼—擴(kuò)增產(chǎn)物復(fù)合物用于檢測SERS信號(hào)。隨著卡那霉素濃度的增加，傳感器信號(hào)隨之增長，線型相關(guān)系數(shù)R2為0.994 8，檢出限達(dá)0.867 pg/mL，樣品回收率為96%～118%。該適配體傳感器中無需對金@金核殼(Au@Au)進(jìn)行標(biāo)記，且制備出的Au@Au核殼穩(wěn)定性好，信號(hào)持久，可用于即時(shí)檢測。

圖3 基于復(fù)合金@銀核殼的SERS法檢測卡那霉素原理示意圖[33]Figure 3 Schematic diagram of the SERS-based method for kanamycin detection by using double strand DNA aptamer-bonding Au@Ag NP

SERS檢測法靈敏快速且無需樣品預(yù)處理，但在基于SERS檢測法快速發(fā)展的同時(shí)，也逐漸發(fā)現(xiàn)性能好的活性基底較難獲得、復(fù)雜的食品基質(zhì)對分析結(jié)果影響較大等問題，且目前基于SERS分析方法的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)尚未明確[50]，仍需不斷探索以發(fā)現(xiàn)最優(yōu)檢測方案。

2.5 側(cè)流層析試紙條法

開發(fā)可用于現(xiàn)場檢測的方法對食品市場監(jiān)管具有重要意義，層析試紙條法可直接利用肉眼觀察、成本低、操作簡便、無需專業(yè)培養(yǎng)即可進(jìn)行測定。Liu等[34]設(shè)計(jì)了一種可用于現(xiàn)場快速檢測的側(cè)流層析試紙條，其以適配體修飾的AuNPs作為探針。當(dāng)未加入卡那霉素時(shí)，T區(qū)與C區(qū)都顯示明顯紅色，隨著卡那霉素濃度變大，C區(qū)顏色基本不變而T區(qū)紅色逐漸變淺，濃度為35 nmol/L時(shí)顏色完全消失。這種側(cè)流層析試紙條法檢出限為0.077 8 nmol/L，可以在10 min內(nèi)完成檢測，通過肉眼觀察顏色變化可進(jìn)行定性分析，利用掃描器可在1～30 nmol/L 內(nèi)進(jìn)行定量分析。雖然該側(cè)流層析試紙條具有低成本、快速簡便等優(yōu)點(diǎn)，但是其檢測限較高，且復(fù)雜的食品基質(zhì)和樣品前處理都會(huì)對檢測結(jié)果造成干擾。

3 總結(jié)與展望

隨著人們生活水平的提高，食品安全問題逐漸走入公眾視野并受到了極大的重視?？股卦趧?dòng)物性食品中的殘留給食品安全造成了極大的威脅，因此對其進(jìn)行檢測具有十分重要的意義。卡那霉素被廣泛用于治療動(dòng)物疾病，在畜禽養(yǎng)殖中濫用會(huì)導(dǎo)致其在動(dòng)物性食品中殘留超標(biāo)。檢測中常將核酸適配體與納米材料如AuNPs、PtNPs、層狀WS2納米片等結(jié)合使用，使得檢測方法靈活多樣、檢測能力不斷提高，總而言之檢測動(dòng)物性食品中卡那霉素殘留的方法將不斷向著方便、快速、靈敏的方向發(fā)展。核酸適配體作為一種性能優(yōu)良的抗體替代識(shí)別探針，其前景廣闊，但仍面臨許多挑戰(zhàn)，如復(fù)雜食品基質(zhì)中的有些物質(zhì)會(huì)干擾適配體的特異性識(shí)別，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確[51]。因此發(fā)展特異性強(qiáng)、方便快速的檢測方法，并將適配體檢測方法與各種信號(hào)放大手段相結(jié)合，通過合理構(gòu)建信號(hào)放大策略可以極大提高檢測靈敏度，以實(shí)現(xiàn)卡那霉素殘留的超靈敏檢測。目前可用于檢測卡那霉素的核酸適配體種類較少，使其在食品檢測中的使用受限，后續(xù)研究可篩選出更多高質(zhì)量的適配體。同時(shí)，在構(gòu)建核酸適配體檢測卡那霉素時(shí)，需要驗(yàn)證核酸適配體是否能與卡那霉素特異性結(jié)合，這是建立檢測方法的基礎(chǔ)[35]。