非洲菊菌核病病原菌的分離鑒定及抑菌藥劑篩選

曹奕鴦，夏朝水，陳昌銘，陳瑋婷，甘瑋欣，林輝鋒，林發(fā)壯，莫智龍

（三明市農(nóng)業(yè)科學研究院花卉研究所，福建 三明 365051）

0 引言

【研究意義】非洲菊Gerbera jamesoniiBolus是菊科大丁草屬多年生宿根草本花卉，原產(chǎn)于南非，是世界五大切花之一。因其具有花色豐富、花枝挺拔、花朵碩大、切花率高、在保護地栽培下可周年產(chǎn)花的優(yōu)點，故被廣泛種植[1]。近年來，隨著種植面積的擴大以及設施栽培帶來良好的病害繁殖環(huán)境，非洲菊病害日趨嚴重，其中菌核病是易誘發(fā)的病害之一[2]。國外的美國、阿根廷、匈牙利、以色列[3-6]，國內(nèi)的上海市、浙江溫嶺、江蘇淮安及河南淮陽等非洲菊產(chǎn)區(qū)均有非洲菊菌核病的報道[7-10]。福建省是非洲菊的主要產(chǎn)區(qū)之一，近年來種植規(guī)模已超過一萬畝[11]，其中清流縣是福建省最早規(guī)?；N植非洲菊的地區(qū)，也是種植面積最大的地區(qū)。經(jīng)筆者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，當?shù)胤侵蘧站瞬“l(fā)病率較高，連作地塊發(fā)病嚴重，發(fā)病率最高可達30%，菌核病已成為該地區(qū)非洲菊生產(chǎn)上亟需解決的問題，但是迄今為止，當?shù)刂饕姆乐畏椒ㄟ€是用石灰、敵克松等土壤消毒的方式進行預防，采用多菌靈等常規(guī)藥劑進行治療，均未能有效控制。同時國內(nèi)在非洲菊菌核病病原菌形態(tài)學、分子鑒定、藥劑篩選方面的研究較少，影響了非洲菊菌核病的識別及有效防治。現(xiàn)階段在生產(chǎn)上迫切需要分離病害病原，并進行防治藥劑篩選，才能有針對性地進行防控，進一步提高防控效果?！厩叭搜芯窟M展】目前國內(nèi)外關于非洲菊菌核病的報道較少，主要介紹發(fā)病癥狀[3-4,7,9-10]、發(fā)生情況[7,10]及防治措施[9]，僅有周韋成[7]通過形態(tài)學鑒定方式，鑒定出非洲菊的菌核病病原為核盤菌Sclerotinia sclerotiorum?！颈狙芯壳腥朦c】菌核病已成為福建省清流縣非洲菊生產(chǎn)上亟需解決的問題，有關非洲菊菌核病分子鑒定及防治藥劑篩選有待深入研究?！緮M解決的關鍵問題】采用組織分離法分離菌核病病原菌，利用形態(tài)學和ITS分子鑒定方式鑒定病害病原，并利用室內(nèi)毒力測定法進行防治藥劑的篩選研究，以明確病原菌種類，篩選出有效殺菌劑，以期為防治非洲菊菌核病提供科學依據(jù)，為進一步進行非洲菊抗病性育種等提供重要材料。

1 材料與方法

1.1 病原菌菌株的分離與致病力測定

1.1.1 病原菌菌株的分離 非洲菊菌核病病株樣品采集于福建省清流縣美豐花卉苗木農(nóng)民專業(yè)合作社非洲菊種植基地，采用組織分離法[12]分離純化病原菌：病葉或病枝用自來水洗凈，在無菌操作臺上取病部的組織，浸入75%酒精3 s后，用無菌水沖洗3次并用無菌吸水紙吸干水分；接著置于0.1%升汞中消毒1 min，再用無菌水沖洗3次并吸干水分；最后取0.5 cm大小的病健交接處組織轉移至PDA培養(yǎng)基中央，置于25 ℃恒溫、黑暗條件下培養(yǎng)。采用菌絲尖端純化法逐步純化分離菌株，純化后的菌株置于4 ℃條件下保存。

1.1.2 病原菌菌株的致病力測定 將保存的菌株接種到PDA培養(yǎng)基上并繼代1次，完成菌株的活化。接種時，用直徑6 mm的打孔器取新鮮菌絲邊緣菌碟，將菌碟中菌絲面貼于100 d苗齡非洲菊杯苗的葉柄基部，在相同位置放置無菌PDA培養(yǎng)基作為對照。接種完成后，裝入透明自封袋中置于光照培養(yǎng)箱中22 ℃，12 h光暗交替條件下保濕培養(yǎng)。接種后觀察記載發(fā)病過程，顯癥后再次分離鑒定病原菌，驗證是否與接種菌株一致。

1.2 病原菌菌株的形態(tài)學觀察

用黃色移液槍槍頭取邊緣菌絲菌碟，將菌碟移至PDA培養(yǎng)基中央，置于22 ℃恒溫黑暗條件下培養(yǎng)，觀察菌絲生長和菌核形成情況。菌核的萌發(fā)誘導參考孫敬賢等[13]的方法：收集培養(yǎng)基中的菌核，先在4 ℃的低溫黑暗條件下處理5周，后將菌核移入盛有濕潤滅菌沙子的罐頭瓶中，置于室內(nèi)自然溫度及弱光下培養(yǎng)，同時觀察記載菌核萌發(fā)過程。菌核萌發(fā)形成成熟子囊盤后，對子囊盤進行切片處理，并在顯微鏡下觀察子囊孢子形態(tài)和大小。

1.3 菌株分子鑒定

采用基于ITS序列的分子鑒定方式對非洲菊菌核病病原進行分子鑒定：利用omega D3195-02真菌DNA提取試劑盒提取菌核病病原菌DNA，以病原菌DNA為模板，以ITS1F（5′-TCCGTAGGTGAACCT GCGG-3′）和ITS4R（5′-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3′）為引物擴增病原菌rDNA-ITS序列。PCR反應體系為50 μL：包括正反向引物各1 μL、2×PCR Mix 25 μL、50 ng·μL-1的DNA模板1 μL，ddH2O 23 μL；PCR反應程序：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共40個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至鉑尚生物技術（上海）有限公司福州測序部進行測序，測序得到的序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，同時，將測序結果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對，比對后下載同源序列，利用MEGA6.06軟件，選擇鄰接法（Neighbor-Joining，NJ），通過自舉分析（bootstrap）進行置信度檢測（自展值為1000），并基于Kimura 2-parameter模型計算進化距離，構建系統(tǒng)進化樹。

1.4 殺菌劑對病原菌的室內(nèi)毒力的測定

將表l中供試藥劑均用無菌水稀釋成1000 μg·mL-1質(zhì)量濃度的母液，各藥劑分別用無菌水配制成使用濃度的10倍。同時，在無菌操作條件下，用移液槍取1 mL不同濃度藥劑分別注入直徑為9 cm的無菌培養(yǎng)皿，倒入冷卻至50 ℃左右的無菌PDA培養(yǎng)基9 mL，輕輕搖勻，制成系列濃度的含藥培養(yǎng)基，以注入無菌水的不含藥平板作為對照，每處理重復3次。采用菌絲生長速率法測定5種殺菌劑對供試菌核病菌株C4-1菌絲生長的抑制作用：用直徑6 mm的打孔器取新鮮病原菌菌絲邊緣菌碟，接種于含系列質(zhì)量濃度殺菌劑的PDA培養(yǎng)基上，置于22 ℃黑暗條件下培養(yǎng)2 d；采用十字交叉法測量菌絲直徑，取平均值，計算菌絲生長抑制率，計算公式為：抑制率/%=[（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌碟直徑）]×100；以藥劑質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標x，以抑制率轉換成的幾率值為縱坐標y，求出各藥劑對非洲菊菌核病菌株C4-1的毒力回歸方程和相關系數(shù)，并計算出各藥劑的有效抑制中濃度EC50。

表1 供試殺菌劑母液及使用濃度Table 1 Original and applied concentrations of fungicides under study

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離與致病力測定

采用組織分離法獲得了純化后的菌株C4-1。在光照培養(yǎng)箱中，對100 d苗齡非洲菊苗接種，結果表明菌株C4-1可以侵染非洲菊苗，接種第2 天開始發(fā)病（圖1-A），病部首先出現(xiàn)水漬狀軟腐并逐漸向葉片和莖基部處蔓延；接種第3天可見病部表面密生白色絮狀物（圖1-B）；接種10 d后在病部可見由白色菌絲團集聚形成的黑色鼠糞狀菌核（圖1-C），而對照處理的非洲菊苗生長正常，未出現(xiàn)病害（圖1-D）。此外，從植株發(fā)病部位重新分離到的病原菌與原始菌株一致，接種后病害發(fā)病癥狀與田間發(fā)病癥狀（圖1-E）一致，說明菌株C4-1即是導致非洲菊菌核病的病原。

圖1 非洲菊苗期菌核病感病過程及田間發(fā)病癥狀Fig. 1 Development of sclerotinia stem rot in gerbera seedlings and disease symptoms in the field

2.2 病原菌的形態(tài)觀察

22 ℃恒溫培養(yǎng)條件下，菌株C4-1在PDA培養(yǎng)基中可迅速生長，2 d可長滿9 cm直徑的培養(yǎng)皿（圖2-A），此時菌絲為白色，氣生菌絲較少；培養(yǎng)3 d后，菌絲開始出現(xiàn)白色棉絮狀菌絲，并在培養(yǎng)皿邊緣部位集聚形成白色的菌絲團（圖2-B）；5 d后菌絲團慢慢變硬，黑色素逐漸累積，菌核形成部位表面布滿小水珠（圖2-C）；最后，水珠慢慢消失，并在培養(yǎng)皿邊緣形成直徑2～5 mm、堅硬、橢圓形或近球形的黑色菌核（圖2-D）。

圖2 菌株C4-1在PDA培養(yǎng)基中的生長過程Fig. 2 Growth of C4-1 in PDA medium

菌核經(jīng)低溫處理后，在自然條件下弱光培養(yǎng)，可觀察菌核萌發(fā)及子囊的形成過程：菌核萌發(fā)后首先長出淺褐色的子囊柄（圖3-A）；接著子囊柄頂端膨大開始形成子實體（圖3-B）；隨著子實體繼續(xù)生長，子囊柄頂端逐漸形成直徑為0.5～0.8 cm的淡黃色盤狀子囊盤（圖3-C），一個菌核可長出2～10個子囊盤（圖3-D）。將子囊盤切片處理，于顯微鏡下觀察，可見子囊棍形、無色、內(nèi)含8個單行排列的子囊孢子（圖3-E），子囊孢子橢圓形，平均大小為（9～12）μm×（4～7）μm（圖3-F）。

圖3 菌核的萌發(fā)過程及子囊和子囊孢子的形態(tài)Fig. 3 Germination process of sclerotia and the morphology of asci and ascospores

2.3 病原菌的分子鑒定

對病原菌C4-1 rDNA的ITS序列進行擴增和測序，得到540 bp長度的核苷酸序列，序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫獲得菌核病菌株C4-1的序列登錄號為MW535875.1。與GenBank中下載的菌株ITS序列進行系統(tǒng)進化分析，結果表明（圖4），分離菌株C4-1與核盤菌Sclerotinia sclerotiorum菌株CBS 499.50、ATCC MYA-4521、ATCC46762聚為一支，與核盤菌屬其他種不在同一個分支，結合菌株的形態(tài)特征，確定分離到的病原菌為核盤菌Sclerotinia sclerotiorum。

圖4 基于ITS核苷酸序列構建的核盤菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of Sclerotinia based on ITS nucleotide sequence

2.4 不同藥劑對核盤菌菌絲的室內(nèi)毒力測定

由表2可見，5種殺菌劑對非洲菊核盤菌菌絲生長的抑制效果不同。在供試的5種殺菌劑中，25%咪鮮胺對菌株C4-1的抑菌作用最強，EC50值為0.0324 μg·mL-1；其次為50%啶酰菌胺、40%菌核凈、15%三唑醇，EC50值分別為1.0337、1.8362、6.9408 μg·mL-1；50%多菌靈的抑菌作用最弱，EC50值僅為22.4349 μg·mL-1。

表2 5種殺菌劑對非洲菊核盤菌菌株C4-1的毒力Table 2 Toxicities of 5 fungicides on S. sclerotiorum C4-1

3 討論與結論

傳統(tǒng)植物病原菌的鑒定采用柯赫氏法則結合形態(tài)學觀察的方法，但這種方法需要豐富的植物病理學基礎[14]。近年來隨著分子生物學的發(fā)展，分子生物學技術在病害鑒定的研究中也得到了廣泛的應用，特別是真菌rDNA的ITS區(qū)段既具保守性，又在科、屬、種水平上均有特異性序列，通過對ITS區(qū)進行測序，來診斷和檢測植物病原菌已越來越被廣泛應用[15]。李克寧[16]、周韋成等[7]在非洲菊菌核病病害鑒定中采用了形態(tài)學鑒定的方法，明確非洲菊菌核病病原為核盤菌。盧燦華等[17-20]將形態(tài)學鑒定結合分子鑒定應用于香料煙、桑葚、扁豆、大白菜等植物菌核病病原菌鑒定中。本研究通過形態(tài)學和分子鑒定方法鑒定出非洲菊菌核病的病原為核盤菌Sclerotinia sclerotiorum，與前人通過形態(tài)學鑒定得出的結果一致[7,16]，故非洲菊菌核病病原鑒定可以采用形態(tài)學鑒定或者分子鑒定的方式。此外，核盤菌引起的菌核病的菌核在誘導子囊和子囊孢子時，需要較長時間的低溫誘導和適溫培養(yǎng)過程[13]，因此，非洲菊菌核病鑒定可優(yōu)先采用分子鑒定的方法，以提高鑒定效率。

菌核病是一種世界性分布的土傳真菌性病害，其中核盤菌引起的菌核病就可危害約75科，278屬，408種植物[20]。本研究表明，在適宜條件下非洲菊苗可在接種第2天發(fā)病，接種第3天在病部明顯可見白色菌絲，在接種第10天形成菌核，菌核病病菌侵染速度快，病害發(fā)病嚴重。由于菌核是菌核病主要初侵染源，它萌發(fā)產(chǎn)生子囊孢子，通過風、水等途徑傳播[21]。因此，避免與十字花科、葫蘆科、豆科、茄科等[22]易受菌核病影響的作物輪作，病害嚴重地塊避免連作，發(fā)現(xiàn)病株及時清除病殘體，是預防非洲菊菌核病的有效措施。同時，菌核萌發(fā)與低溫處理條件及低溫處理后培養(yǎng)溫度有關[13]，在福建清流，非洲菊菌核病菌核在秋冬季節(jié)經(jīng)過低溫誘導，打破休眠后，在冬季至次年春季可見菌核病大范圍發(fā)生，因此，清流縣在防治該病害時，需因地制宜在冬季至次年春季期間加強預防。

本研究通過室內(nèi)毒力測定結果表明，多菌靈對非洲菊菌核病病原菌菌絲生長抑制作用最弱，EC50值為22.4349μg·mL-1，依10 μg·mL-1＜EC50＜100 μg·mL-1的多菌靈中抗標準[23]，菌核病菌C4-1菌株對多菌靈表現(xiàn)出中抗水平。同時，已在葫蘆科、茄科、豆科、傘形科、十字花科、菊科等多種蔬菜上發(fā)現(xiàn)了對多菌靈產(chǎn)生抗藥性的菌核病菌株[24]，因此，利用多菌靈防治非洲菊菌核病防效較差。本研究結果還表明咪鮮胺、啶酰菌胺、菌核凈對非洲菊菌核病病原菌菌絲生長抑制作用較強，EC50值分別為0.0324、1.0337、1.8362μg·mL-1，其中，咪鮮胺為咪唑類殺菌劑，啶酰菌胺為酰胺類殺菌劑，菌核凈為新亞胺類殺菌劑，因此，在防治菌核病過程中，可輪換使用咪鮮胺、啶酰菌胺、菌核凈這幾種不同類型藥劑，以提高田間防效并延緩病菌產(chǎn)生抗藥性。