酒花內(nèi)生菌Pseudomonas oryzihabitans F0-1轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-萜品醇的研究

廉長(zhǎng)盛，付冬梅，張俊鵬，張逸凡，薛兆茹，王 越

（大連工業(yè)大學(xué)生物催化技術(shù)國(guó)家與地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116034）

檸檬烯又名苧烯，是一種重要的功能性單萜，已被發(fā)現(xiàn)存在于300 多種植物中。檸檬烯是柑橘類水果加工的副產(chǎn)物，在橙皮精油中含量高達(dá)90%～95%。因其價(jià)廉易得，且化學(xué)性質(zhì)活潑，被用作合成萜烯衍生物的前體，這些衍生物在食品、醫(yī)藥和精細(xì)化工行業(yè)中應(yīng)用廣泛[1-2]。

檸檬烯可以轉(zhuǎn)化為含氧單萜化合物，相比于萜烯類化合物，含氧單萜具有更強(qiáng)的香氣，且自然資源中含量少。如α-萜品醇，它是一種單萜類化合物，其在香料行業(yè)中的商業(yè)價(jià)值較高，消耗量約為每年9.2 t。α-萜品醇具有紫丁香的花香氣味，在香水、化妝品和洗漱用品中通常用作香料[3-4]。由于其抗菌和抗氧化特性，在制藥工業(yè)中也被用作抗真菌劑和消毒劑產(chǎn)品[3,5-6]，并在食品工業(yè)中用作防腐劑，可用于調(diào)配檸檬、甜橙、桃子、柑橘等食用香精[7-9]。

研究發(fā)現(xiàn)，真菌和細(xì)菌能在有氧條件下對(duì)檸檬烯進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。Tai 等[10]利用Penicillium sp 轉(zhuǎn)化檸檬烯，產(chǎn)物主要是α-萜品醇和少量的香芹酮和香芹醇；Rottava 等[11]從400 種微生物中篩選出能轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-萜品醇的黑曲霉；Bicas 等[12]通過熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens 轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-萜品醇。相比化學(xué)合成，微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)因操作簡(jiǎn)單、條件溫和、高效率和高選擇性、無毒、對(duì)環(huán)境友好，顯示出廣闊的基礎(chǔ)理論研究和應(yīng)用前景[13]。目前天然來源的化合物比化學(xué)合成的化合物具有更高的市場(chǎng)價(jià)值，因此，通過生物轉(zhuǎn)化獲得天然香料具有很高的市場(chǎng)研發(fā)價(jià)值[14-15]。

啤酒花是大麻科葎草屬多年生攀援草本植物，是一種重要的香料和藥用植物[16-18]，其揮發(fā)成分酒花油中含有70%的萜烯化合物，包括單體萜烯如α-蒎烯和香葉烯，倍半萜烯如β-石竹烯和α-葎草烯等[19]。而酒花內(nèi)生菌長(zhǎng)期伴隨植物生長(zhǎng)，參與宿主的生長(zhǎng)代謝，很可能會(huì)具備與宿主植株相似次生代謝的潛能[20-21]。因此，開發(fā)植物內(nèi)生菌資源，將會(huì)為天然產(chǎn)物的合成提供新方案。本研究從酒花內(nèi)生菌入手，篩選具有檸檬烯轉(zhuǎn)化潛力的菌種，進(jìn)行生理生化和分子鑒定，并優(yōu)化生物轉(zhuǎn)化條件，以提高酒花內(nèi)生菌轉(zhuǎn)化檸檬烯的轉(zhuǎn)化率。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

野生新鮮酒花雌花果，摘自河北省秦皇島；α-萜品醇標(biāo)準(zhǔn)品（＞99%），內(nèi)標(biāo)物萜品烯-4-醇（＞99%），阿拉丁試劑有限公司；檸檬烯（＞95%），北京百靈威科技有限公司；次氯酸鈉，乙酸乙酯（≥95%），乙醇（≥95%），甲醇（≥95%）和甘油（≥95%），科密歐化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉、胰蛋白胨、大豆粉和植物蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；NaCl、K2HPO4等分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；甘露醇，沈陽(yáng)市試劑二廠。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 分離培養(yǎng)基

水瓊脂培養(yǎng)基（WA）：瓊脂粉18 g/L，pH 7.2±0.2。

酵母提取物瓊脂培養(yǎng)基（TWYE）：酵母提取物0.25 g/L，K2HPO40.5 g/L，瓊脂粉18 g/L，pH 7.2±0.2。

甘露醇大豆瓊脂培養(yǎng)基（MS）：甘露醇20 g/L，大豆粉20 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH 7.2±0.2。

大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）：胰蛋白胨15 g/L，植物蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂粉15 g/L，pH 7.3±0.2。

1.1.2.2 復(fù)篩培養(yǎng)基

甲醇0.1 g/L，(R)-(+)-檸檬烯4.5 g/L，NaNO33.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO40.5 g/L，KCl 0.5 g/L，F(xiàn)eSO40.01 g/L和瓊脂20 g/L。

1.1.2.3 LB 培養(yǎng)基

胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母提取物5 g/L。

1.1.2.4 細(xì)菌基本培養(yǎng)基

葡萄糖5 g/L，(NH4)2SO42 g/L，檸檬酸鈉1 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，K2HPO44 g/L，KH2PO46 g/L。

1.1.2.5 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（NA）

牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L。

1.1.3 儀器與設(shè)備

GC9790Plus 氣相色譜儀，浙江福立分析儀器股份有限公司；7890A/5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配EI 離子源，美國(guó)Agilent 公司；DB-FFAP 毛細(xì)管色譜柱，中科院大連化物所；SPME 專用磁力加熱攪拌器，SPME-GC PK 1 固相微萃取手柄，北京康林科技有限責(zé)任公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS（二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷）萃取頭，美國(guó)Supelco 公司；ZQZY78CNT 型振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種的篩選及鑒定

1.2.1.1 菌種的篩選

先將新鮮酒花用流水沖洗，晾干，分別剪成根、莖、葉、花等部分。用75%酒精浸泡3 min，無菌水沖洗3次；用10%次氯酸鈉浸泡5 min，無菌水沖洗3 次。在無菌條件下，分別將消毒處理的酒花花莖、花軸、苞葉和花朵（包含蛇麻腺）部位切成1 cm×1 cm 的小塊，均勻置于分離培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)。

將4 種分離培養(yǎng)基分離獲得的菌株轉(zhuǎn)接至LB瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，劃線純化菌株。采用感官評(píng)定法對(duì)產(chǎn)香內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行聞香篩選。

將菌株經(jīng)過液體LB 培養(yǎng)基活化，按照5%接種量接入到復(fù)篩培養(yǎng)基中（250 mL 具塞磨口瓶），30 ℃，200 r/min 條件下恒溫振蕩培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化72 h，利用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜連用（SPME-GC-MS）檢測(cè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

1.2.1.2 菌種的鑒定

形態(tài)學(xué)特征初步鑒定：對(duì)菌落形態(tài)特征、顏色、大小、革蘭氏染色等進(jìn)行觀察。生理生化試驗(yàn)鑒定參照文獻(xiàn)[22]。

分子生物學(xué)鑒定：提取篩選菌株的DNA 進(jìn)行16S rDNA PCR 擴(kuò)增。利用16S rDNA 的1492R 和27F通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。測(cè)序由吉林省庫(kù)美生物技術(shù)有限公司完成。測(cè)序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)中進(jìn)行基本局部比對(duì)，采用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 萜烯物質(zhì)SPME-GC-MS 分析方法

固相萃取條件：將發(fā)酵液在4 ℃，8 000 r/min 條件下離心10 min，吸取5 mL 上清液移入固相萃取樣品瓶中。加入2 g NaCl 促進(jìn)樣品揮發(fā)，將樣品瓶放在固相萃取儀上，溫度60 ℃，轉(zhuǎn)速160 r/min。推出SPME 萃取頭的纖維，吸附30 min 后，插入GC 進(jìn)樣口解析5 min。

氣相色譜條件：色譜柱為DB-FFAP 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.5 μm），載氣為氮?dú)猓簧郎爻绦驗(yàn)椋褐鯗?5 ℃，保持1 min，以5 ℃/min 升溫至120 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min 升溫至250 ℃，保持10 min。分流比為5∶1。

質(zhì)譜條件：離子源溫度220 ℃，電離方式EI，電子能量70 eV，掃描范圍（m/z）100～420。

定量分析：采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，α-萜品醇標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：

y=0.635 6x+0.201 2，R2=0.997 4

式中：x 為α-萜品醇與內(nèi)標(biāo)濃度比；y 為α-萜品醇與內(nèi)標(biāo)面積比。

1.2.3 生長(zhǎng)時(shí)期及轉(zhuǎn)化時(shí)間的篩選

為了考察細(xì)菌培養(yǎng)基對(duì)Pseudomonasoryzihabitans F0-1 菌株在不同生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-萜品醇的影響，將菌株分別接種到NA 培養(yǎng)基和細(xì)菌基本培養(yǎng)基中，定時(shí)測(cè)定菌液在波長(zhǎng)為600 nm 下的光密度值，以O(shè)D 值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制菌株在NA 和細(xì)菌基本培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。

根據(jù)測(cè)得的生長(zhǎng)曲線，在30 ℃，200 r/min 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)內(nèi)生菌F0-1，分別在各生長(zhǎng)時(shí)期加入檸檬烯，定時(shí)取樣。按照“1.2.2”中的方法檢測(cè)α-萜品醇濃度，考察不同生長(zhǎng)時(shí)期及轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)內(nèi)生菌F0-1轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-萜品醇的影響。

1.2.4 共溶劑種類的篩選

為考察共溶劑對(duì)F0-1 菌生物轉(zhuǎn)化的影響，分別配制20%的(R)-(+)-檸檬烯/共溶劑混合溶液。將混合溶液添加到在NA 培養(yǎng)基中培養(yǎng)38 h 的F0-1 菌液內(nèi)，培養(yǎng)條件為30 ℃，200 r/min，共溶劑分別為乙酸乙酯、乙醇、甲醇、甘油。轉(zhuǎn)化12 h，檢測(cè)α-萜品醇濃度，對(duì)照為不加共溶劑。

1.2.5 底物濃度的篩選

為了考察F0-1 轉(zhuǎn)化檸檬烯的最適濃度，將F0-1菌培養(yǎng)24 h 后，分別加入440、880、1 760、3 520 mg/L R-(+)-檸檬烯，生物轉(zhuǎn)化12 h 后，測(cè)定α-萜品醇濃度，篩選適宜的底物濃度。

1.2.6 轉(zhuǎn)化條件的篩選

1.2.6.1 轉(zhuǎn)化溫度

為考察溫度對(duì)F0-1 轉(zhuǎn)化的影響，采用不同轉(zhuǎn)化溫度（10、20、30、40 ℃），菌種在200 r/min 預(yù)培養(yǎng)38 h后，加入20%的(R)-(+)-檸檬烯/乙醇混合溶液，轉(zhuǎn)化12 h 后，檢測(cè)α-萜品醇濃度，篩選適宜的轉(zhuǎn)化溫度。

1.2.6.2 pH

為考察轉(zhuǎn)化體系中pH 值對(duì)F0-1 轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-萜品醇的影響，用0.05 mol/L 的檸檬酸磷酸緩沖液調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基pH 為3.0～8.0。菌種在30 ℃，200 r/min 預(yù)培養(yǎng)38 h 后，加入20%的(R)-(+)-檸檬烯/乙醇混合溶液，轉(zhuǎn)化12 h 后，檢測(cè)α-萜品醇濃度，篩選適宜的pH。

1.2.6.3 轉(zhuǎn)速

為考察轉(zhuǎn)速對(duì)生物轉(zhuǎn)化的影響，將F0-1 菌種在30 ℃，200 r/min，pH 6.0 條件下預(yù)培養(yǎng)38 h 后，加入20%的(R)-(+)-檸檬烯/乙醇混合溶液。分別采用0、100、200、300 r/min 進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化12 h 后，檢測(cè)α-萜品醇濃度，確定最佳的轉(zhuǎn)速。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

使用Execl 軟件處理數(shù)據(jù)，使用MEGA 7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的篩選及鑒定

2.1.1 酒花內(nèi)生菌的篩選

將消毒處理過的酒花的花莖、花軸、苞葉和花朵（包含蛇麻腺）部位分別在4 種分離培養(yǎng)基（WA、TWYE、MS、TSA）中恒溫培養(yǎng)，共分離出22 株產(chǎn)香內(nèi)生細(xì)菌，其中通過WA 培養(yǎng)基分離出2 株細(xì)菌；通過TWYE 培養(yǎng)基分離出14 株細(xì)菌；通過MS 培養(yǎng)基分離出6 株細(xì)菌；通過TSA 培養(yǎng)基沒有分離出微生物。

經(jīng)過復(fù)篩培養(yǎng)基篩選和SPME-GC-MS 分析，F(xiàn)0-1和F0-2 兩株菌均可以轉(zhuǎn)化檸檬烯生成含氧單萜化合物。菌種F0-1 能轉(zhuǎn)化檸檬烯生成香芹酮、香芹醇和α-萜品醇，生成的α-萜品醇濃度為（9.24±1.67）mg/L。菌種F0-2 能轉(zhuǎn)化檸檬烯生成香芹酮和α-萜品醇，生成的α-萜品醇濃度為（2.04±1.11）mg/L。兩種菌都能轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-萜品醇，且F0-1 菌生成的α-萜品醇濃度是F0-2 菌的4.5 倍，因此選定F0-1 為轉(zhuǎn)化檸檬烯合成α-萜品醇的菌株，并對(duì)F0-1 進(jìn)行菌種鑒定。

2.1.2 內(nèi)生菌F0-1 菌種的鑒定

細(xì)菌在LB 培養(yǎng)基37 ℃下培養(yǎng)24 h 后觀察菌落的形態(tài)，可以看到菌落黃色，圓形，凸起，干燥皺起，邊緣整齊。顯微鏡下觀察革蘭氏染色結(jié)果為陰性，F(xiàn)0-1菌生理生化結(jié)果見表1，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。

表1 F0-1 菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of physiological and biochemical experiments of F0-1 strain

圖1 內(nèi)生菌F0-1 的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 16S rDNA system development tree of F0-1 bacteria strain

F0-1 與NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性菌的16S rRNA 基因序列比對(duì)，與Pseudomonas oryzihabitans 相似性達(dá)99.99%。結(jié)合菌株F0-1 的生理生化結(jié)果、菌落形態(tài)特征及16S rDNA 分析，鑒定菌株F0-1 為棲稻假單胞菌（Pseudomonas oryzihabitans）。

2.2 不同生長(zhǎng)時(shí)期及轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)α-萜品醇產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分和濃度對(duì)微生物生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化檸檬烯合成α-萜品醇有不同影響[23]。由圖2 可知，F(xiàn)0-1 在細(xì)菌基本培養(yǎng)基中進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰亡期的時(shí)間分別是6 h、22 h 和46 h；在NA 培養(yǎng)基中F0-1 的生長(zhǎng)周期更短一些，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰亡期的時(shí)間分別是2 h、10 h 和38 h。

圖2 F0-1 菌在兩種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curves of F0-1 bacteria strain in two culture media

由圖3 可見，兩種培養(yǎng)基都是在衰亡期合成α-萜品醇濃度高于對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期，且NA 培養(yǎng)基產(chǎn)量更高，在衰亡期轉(zhuǎn)化12 h 合成α-萜品醇最高，為38.7 mg/L；細(xì)菌基本培養(yǎng)基中的最高產(chǎn)量在衰亡期轉(zhuǎn)化24 h 處獲得，為28.6 mg/L。臺(tái)亞楠[24]在優(yōu)化指狀青霉DSM 62840 轉(zhuǎn)化檸檬烯條件時(shí)，發(fā)現(xiàn)對(duì)數(shù)期添加檸檬烯能獲得最大產(chǎn)量。菌種不同，最適底物添加時(shí)期也不同，細(xì)菌Pseudomonas gladioli 和指狀青霉不同，其最適底物添加時(shí)期為對(duì)數(shù)晚期至穩(wěn)定期，此時(shí)的菌量較高[25]。而F0-1 菌衰亡期α-萜品醇生成量高的原因可能是由于這時(shí)體系中碳源消耗過大，此時(shí)添加檸檬烯作為新的碳源，被菌種利用。也可能是細(xì)胞衰亡裂解，胞內(nèi)的酶更容易和底物接觸。對(duì)比兩種培養(yǎng)基，NA 培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)化量較高，且最高轉(zhuǎn)化量在添加底物后的12 h，轉(zhuǎn)化時(shí)間短，效率高。因此，最優(yōu)條件為將F0-1 菌接種到NA 培養(yǎng)基中，在衰亡期（培養(yǎng)38 h）添加檸檬烯，轉(zhuǎn)化12 h。

圖3 不同生長(zhǎng)時(shí)期及轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)α-萜品醇產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of different growth stages and conversion time on the α-terpineol production

2.3 共溶劑種類對(duì)檸檬烯生物轉(zhuǎn)化的影響

檸檬烯難溶于水相，溶解度僅為0.015 mmol/L，化學(xué)穩(wěn)定性差，易發(fā)生自動(dòng)氧化[26]。用共溶劑可以增加檸檬烯的溶解度，從而提高產(chǎn)物濃度[27]。由圖4 可知，共溶劑促進(jìn)作用從大到小依次為乙醇＞甲醇＞乙酸乙酯＞甘油。添加乙醇為共溶劑，α-萜品醇濃度比對(duì)照組提高48.5%，極性有機(jī)溶劑可以提高檸檬烯等萜烯物質(zhì)的溶解度，在生物轉(zhuǎn)化中形成單向系統(tǒng)，加快反應(yīng)速度，一般會(huì)促進(jìn)產(chǎn)物生成[28]。因此甲醇和乙醇對(duì)生物轉(zhuǎn)化均有促進(jìn)作用；與空白對(duì)照相比，甘油使α-萜品醇濃度降低3.14 mg/L，在4 種共溶劑中，甘油對(duì)F0-1 的生物轉(zhuǎn)化影響并不顯著。非極性有機(jī)溶劑乙酸乙酯對(duì)生物轉(zhuǎn)化也有一定的促進(jìn)作用，α-萜品醇濃度提高了9.1%?？紤]到乙醇價(jià)格低，可用于食品添加劑的萃取，且對(duì)檸檬烯生物轉(zhuǎn)化的促進(jìn)作用明顯，因此選擇乙醇作為生物轉(zhuǎn)化的共溶劑。

圖4 共溶劑對(duì)檸檬烯生物轉(zhuǎn)化的影響Fig.4 Effects of cosolvent on biotransformation of limonene

2.4 底物濃度對(duì)萜品醇產(chǎn)量的影響

研究表明，高濃度的萜烯物質(zhì)對(duì)微生物細(xì)胞有毒害作用[29]，這也是微生物轉(zhuǎn)化單萜生成含氧衍生物的難點(diǎn)之一，單萜濃度過高會(huì)影響微生物轉(zhuǎn)化能力并抑制微生物的生長(zhǎng)[28]。由圖5 可知，檸檬烯轉(zhuǎn)化的最適濃度為880 mg/L，當(dāng)高于880 mg/L 時(shí)，產(chǎn)量下降。Gloria等[23]用指狀青霉DSM62840 轉(zhuǎn)化檸檬烯時(shí)，當(dāng)檸檬烯濃度過高時(shí)會(huì)影響轉(zhuǎn)化的選擇性，生成其他含氧衍生物。因此，選擇880 mg/L 的檸檬烯作為F0-1 轉(zhuǎn)化的最適濃度。

圖5 檸檬烯濃度對(duì)α-萜品醇產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of limonene concentrations on the α-terpineol production

2.5 轉(zhuǎn)化條件對(duì)α-萜品醇合成的影響

2.5.1 溫度對(duì)α-萜品醇產(chǎn)量的影響

檸檬烯生物轉(zhuǎn)化效率與溫度相關(guān)[25]。由圖6 可知，培養(yǎng)溫度對(duì)α-萜品醇產(chǎn)量有較大的影響，30 ℃時(shí)產(chǎn)量最高。從10～30 ℃，轉(zhuǎn)化量逐漸上升，轉(zhuǎn)化溫度40 ℃時(shí)產(chǎn)量大幅下降，可能是高溫影響了轉(zhuǎn)化酶活力，并且高溫也不適合微生物生長(zhǎng)。

圖6 培養(yǎng)溫度對(duì)α-萜品醇產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of culture temperatures on the α-terpineol production

2.5.2 pH 對(duì)α-萜品醇產(chǎn)量的影響

由于在pH 為3.0 和4.0 時(shí)，F(xiàn)0-1 菌無法生長(zhǎng)，故不在圖7 中體現(xiàn)。由圖7 可見，pH 為6.0 時(shí)α-萜品醇產(chǎn)量最高。當(dāng)pH 大于7.0 時(shí)，α-萜品醇濃度下降。有研究報(bào)道，pH 大于3.5 時(shí)，檸檬烯產(chǎn)生分子內(nèi)重排，通過不同碳原子的羥基化反應(yīng)、異構(gòu)化反應(yīng)、氧化反應(yīng)和斷裂循環(huán)，促進(jìn)了檸檬烯含氧化合物的形成[23]。pH 大于7.0 時(shí)，α-萜品醇濃度降低，原因可能是堿性條件下的α-萜品醇性質(zhì)不穩(wěn)定。Bicas 等[30]報(bào)道尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum 152b 在pH 5.2～8.2 之間生物轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-萜品醇；Gloria 等[23]報(bào)道指狀青霉Penicillium digitatum DSM 62840 轉(zhuǎn)化檸檬烯的最適pH 為3.5，此pH 下α-萜品醇產(chǎn)量最大。Tan 等[31]的研究也發(fā)現(xiàn)Penicillium digitatum NRRL 1202 在酸性環(huán)境下更利于生物轉(zhuǎn)化，在pH 4.0 時(shí)產(chǎn)量最高。與這些真菌略有不同，P.oryzihabitans F0-1 在pH 小于5 時(shí)無法轉(zhuǎn)化，在6.0～7.0 的微酸性反應(yīng)體系中轉(zhuǎn)化檸檬烯合成α-萜品醇的產(chǎn)量最高。

圖7 體系pH 對(duì)α-萜品醇產(chǎn)量影響Fig.7 Effects of system pH values on the α-terpineol production

2.5.3 轉(zhuǎn)速對(duì)α-萜品醇產(chǎn)量的影響

萜烯生物轉(zhuǎn)化為含氧衍生物是需氧的[32]，溶氧量對(duì)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化量影響較大，振蕩培養(yǎng)可以提高體系的溶氧量[33]。在假絲酵母Candida maltosa 生物轉(zhuǎn)化過程中，其關(guān)鍵酶NADPH-cytochrome P-450 和cytochrome P-450 單加氧酶在60 r/min 時(shí)的轉(zhuǎn)化效率更高[34]。圖8 顯示在轉(zhuǎn)速為200 r/min 時(shí)，α-萜品醇的產(chǎn)量最高，達(dá)到97.54 mg/L，當(dāng)體系靜止或處于過高轉(zhuǎn)速時(shí)都不利于生成產(chǎn)物，因此選用中等轉(zhuǎn)速200 r/min 作為生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)條件。

圖8 轉(zhuǎn)速對(duì)α-萜品醇合成的影響Fig.8 Effects of rotational speeds on the α-terpineol production

3 結(jié)論

從新鮮酒花中篩選出能轉(zhuǎn)化(R)-(+)-檸檬烯合成α-萜品醇的內(nèi)生菌F0-1。對(duì)該菌株進(jìn)行生理生化和分子生物學(xué)鑒定，為棲稻假單胞菌Pseudomonas oryzihabitans。并對(duì)F0-1 菌生物轉(zhuǎn)化的條件進(jìn)行了優(yōu)化，F(xiàn)0-1 菌在30 ℃，體系pH 為6.0，轉(zhuǎn)速200 r/min的NA 培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)38 h，添加20%的檸檬烯/乙醇溶液，檸檬烯濃度為880 mg/L，轉(zhuǎn)化12 h，得到的α-萜品醇濃度為（97.54±3.34）mg/L，是最初轉(zhuǎn)化結(jié)果（9.24±1.67）mg/L 的10.6 倍。