LncRNA H19對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的影響及作用機(jī)制

林 曉，丁 晨，朱 偉，朱曉冬

(牡丹江醫(yī)學(xué)院免疫教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

LncRNA H19是最早被鑒定的長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)之一，其在許多生理和病理學(xué)過程中發(fā)揮廣泛生物學(xué)功能[1]。研究顯示,LncRNA H19在炎癥反應(yīng)[2]、自身免疫病[3]、血管老化和腫瘤生物學(xué)[4]中具有重要功能作用。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯穆匝装Y性自身免疫性疾病[5]。課題組前期研究表明，LncRNA H19對(duì)RA患者巨噬細(xì)胞極化有調(diào)控作用。本研究旨在探討LncRNA H19對(duì)關(guān)節(jié)炎模型鼠的影響及其可能存在的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑AAV8(和元生物，中國上海)，CFA(Sigma公司)，Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)；H19、TNF-α、CCL-2、CCR-7PCR引物(生工合成)；RIPA裂解液(北京碧云天公司)，蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(北京碧云天公司)，PVDF膜(Millipore公司)，IRF5抗體(Santa Cruz公司)，p-IRF5抗體(affinity公司)。

1.2 動(dòng)物模型與分組將24只清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠(6～8周齡，購自牡丹江醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過牡丹江醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn))，在室溫控制在20 ℃左右無菌的SPF動(dòng)物房飼養(yǎng)，自由飲水，進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)的小鼠飼料。按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：Normal組，AIA組、AIA+AAV8-CMA組、AIA+AAV8-CMV-H19組，每組6只。異氟烷麻醉小鼠，Normal組在左側(cè)踝關(guān)節(jié)周圍皮下注射30 μL生理鹽水；其余組在相同位置注射30 μL含結(jié)核分枝桿菌的弗氏完全佐劑(CFA)誘導(dǎo)佐劑性關(guān)節(jié)炎；AIA+AAV8-CMA組建模前3周，向AIA小鼠踝關(guān)節(jié)注射5 μL腺相關(guān)病毒(AAV8)空載，作為AAV8過表達(dá)LncRNA H19對(duì)照組；AIA+AAV8-CMV-H19組建模前3周，向AIA小鼠模型踝關(guān)節(jié)注射5 μL攜帶H19的AAV8過表達(dá)LncRNA H19；8 d后，處死小鼠收集踝關(guān)節(jié)標(biāo)本。

1.3 關(guān)節(jié)腫脹程度的判定使用足趾容積測(cè)量?jī)x，分別在建模前1 d以及建模后每天檢測(cè)一次小鼠的足和踝關(guān)節(jié)體積，連續(xù)檢測(cè)8 d，與Normal小鼠踝關(guān)節(jié)體積變化比較觀察體積變化(△體積=造模后體積-造模前體積)。

1.4 組織病理學(xué)染色(HE染色)頸椎脫臼處死小鼠后，取小鼠踝關(guān)節(jié)，4%多聚甲醛固定，10 %EDTA脫鈣兩個(gè)月。制成6 μm厚的石蠟切片，置60 ℃烘箱4 h脫蠟，二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ分別浸泡5 min，無水酒精、95%酒精、80%酒精、70%酒精分別浸泡3 min，放入蘇木素染色3 min，水洗3遍后1%鹽酸酒精分化12 s，自來水沖洗返藍(lán)20～30 min，0.5%伊紅水溶液復(fù)染10 min，水洗3遍；再次使用梯度酒精脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠關(guān)節(jié)部位炎癥病變程度。

1.5 RNA提取和RT-qPCR按照Trizol試劑盒的操作流程提取踝關(guān)節(jié)組織處總RNA，超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)純度及含量(A260/A280大約為1.8～2.0)。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書進(jìn)行cDNA鏈合成，然后按照PCR反應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)，以GAPDH為內(nèi)參，RT-qPCR引物序列為：

表1 PCR中的引物序列

1.6 Western blotting將收集的踝關(guān)節(jié)處滑膜組織充分研磨，加入含有1%蛋白酶抑制劑苯基甲基磺酰氟的RIPA裂解緩沖液，提取總蛋白，在10% Bis-Tris凝膠上分離等量的蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h后，將膜與一抗在4 ℃孵育過夜，并輕輕搖動(dòng)。然后，將膜與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗在室溫下溫育1.5 h，加顯色液，凝膠成像看條帶，用圖像處理軟件Image.J對(duì)目的蛋白條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩樣本數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)分析兩組之間差異，并對(duì)兩組以上差異進(jìn)行方差分析，以P<0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠踝關(guān)節(jié)和足部腫脹隨時(shí)間變化情況與AIA組相比，自建模后第一次檢測(cè)腫脹體積開始AIA+AAV8-CMV-H19組腫脹程度明顯高于AIA組、AIA+AAV8-CMA組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，n=6。

表2 小鼠踝關(guān)節(jié)和足部腫脹體積變化量

2.2 HE染色觀察各組小鼠踝關(guān)節(jié)處病理變化HE染色顯示，Normal組小鼠踝關(guān)節(jié)組織未見明顯病理性改變；與Normal組比較，AIA組、AIA+AAV8-CMA組小鼠關(guān)節(jié)滑膜明顯增生，炎性細(xì)胞浸潤，水腫明顯；AIA+AAV8-CMV-H19組可見大量炎性細(xì)胞浸潤，水腫十分顯著，如圖3所示。

圖1 HE染色觀察各組小鼠踝關(guān)節(jié)病理變化(×40)

2.3 小鼠踝關(guān)節(jié)處LncRNA H19及炎癥相關(guān)因子mRNA表達(dá)情況熒光定量PCR檢測(cè)LncRNA H19的表達(dá)，與Normal組相比，AIA組、AIA+AAV8-CMA組H19表達(dá)明顯升高，AIA+AAV8-CMV-H19組升高最顯著；檢測(cè)各組炎癥相關(guān)因子mRNA的表達(dá)，與AIA+AAV8-CMA組相比，AIA+AAV8-CMV-H19組H19、TNF-α、CCL-2、CCR-7表達(dá)顯著上升，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，n=6，見表3、圖2。

圖2 LncRNA H19過表達(dá)促進(jìn)IRF5磷酸化

表3 熒光定量PCR檢測(cè)H19、TNF-α、CCL-2、CCR-7結(jié)果

2.4 LncRNA H19對(duì)關(guān)節(jié)炎模型鼠組織中IRF5表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，各組IRF5表達(dá)情況無顯著差異，但p-IRF5表達(dá)情況各組差異顯著，與Normal組相比，AIA組、AIA+AAV8-CMA組p-IRF5表達(dá)量均有不同程度升高，與AIA+AAV8-CMA組相比，AIA+AAV8-CMV-H19組p-IRF5表達(dá)量明顯升高，明可能存在LncRNA H19過表達(dá)促進(jìn)IRF5磷酸化，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.01，如圖4所示。

3 討論

RA是一種慢性自身免疫性疾病,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，沒有明確的治療方法。對(duì)于RA的研究普遍集中在其發(fā)病的免疫調(diào)節(jié)過程及相關(guān)免疫細(xì)胞。長鏈非編碼RNA是一類長度大于200 bp且不能翻譯成蛋白質(zhì)的RNA分子。越來越多的研究證實(shí)，LncRNA與RA的滑膜細(xì)胞持續(xù)增生、抑炎因子、促炎因子之間平衡破壞有密切關(guān)系[6]。LncRNA H19作為最早被鑒定的長鏈非編碼RNA之一，其在許多生物學(xué)過程中發(fā)揮重要功能。已有研究表明，LncRNA H19在RA患者中表達(dá)異常[7]，并對(duì)巨噬細(xì)胞極化有重要調(diào)節(jié)作用，其過表達(dá)促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞極化，加重炎癥病情[8]。巨噬細(xì)胞是引發(fā)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的重要細(xì)胞，其大量存在于RA患者的軟骨組織和滑膜細(xì)胞中。免疫調(diào)節(jié)異常也是RA發(fā)病的重要因素，其中炎性因子和趨化因子的失衡在RA病情進(jìn)展中起關(guān)鍵作用；有研究顯示，敲低LncRNA H19，使IL-1β，TNF-α和IL-6等炎癥因子表達(dá)下調(diào)[9]。在膽管炎中，膽管細(xì)胞衍生的外泌體LncRNA H19誘導(dǎo)趨化因子CCL-2和IL-6的表達(dá)和分泌[2]。我們通過對(duì)關(guān)節(jié)炎模型鼠轉(zhuǎn)染攜帶LncRNA H19的AAV8來過表達(dá)LncRNA H19，RT-qPCR結(jié)果顯示，LncRNA H19過表達(dá)上調(diào)炎癥因子TNF-α、CCL-2、CCR-7mRNA表達(dá)；HE染色檢測(cè)踝關(guān)節(jié)處炎癥病變加重，與RT-qPCR結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)LncRNA H19過表達(dá)加重關(guān)節(jié)炎模型病情，與前期報(bào)道一致。

IRF5是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)活動(dòng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控炎癥因子和趨化因子的表達(dá)，在自身免疫性疾病中起免疫調(diào)節(jié)作用[10]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，RA患者IRF5表達(dá)量低于正常對(duì)照組[11]，并且在RA的發(fā)病過程中調(diào)控IFN-α、IFN-β、IL-6、TNF等炎癥因子的表達(dá)[12]，另外，IRF5的表達(dá)受miR-125b[13]、miR-125a[14]、miR-22-3p[15]抑制后，可促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化，減緩炎癥；研究還發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染H19的巨噬細(xì)胞中，IRF5的表達(dá)量增加?；谏鲜鲅芯?，我們檢測(cè)了關(guān)節(jié)炎模型中IRF5及p-IRF5的表達(dá)情況，Western blot結(jié)果顯示，LncRNA H19過表達(dá)促進(jìn)IRF5磷酸化。證實(shí)了LncRNA H19過表達(dá)加重關(guān)節(jié)炎病情，可能與IRF5有關(guān)。

綜上所述，LncRNA H19可能通過調(diào)控IRF5磷酸化，加重關(guān)節(jié)炎模型病情，但是涉及的詳細(xì)的調(diào)控機(jī)制還仍不清楚，有待進(jìn)一步研究。