刺五加提取物對(duì)酒精戒斷大鼠海馬去甲腎上腺素的影響

王加葦，吳宜艷，劉 欣

(牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

目前，中國(guó)大概有4.5億飲酒消費(fèi)者，其中約1.23億人存在過(guò)度飲酒的行為[1]，而嚴(yán)重飲酒問(wèn)題在醫(yī)學(xué)上被歸類(lèi)為“酒精使用障礙”(alcohol use disorder,AUD)。這是一種慢性復(fù)發(fā)性腦疾病，其發(fā)作特征在于強(qiáng)迫性飲酒、無(wú)法控制飲酒量以及不飲酒時(shí)情緒低落。AUD的主要生理指征是精神焦慮、腎上腺素能亢進(jìn)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)亢進(jìn)和飲酒欲望的增強(qiáng)[2]。本研究以酒精戒斷模型大鼠為研究對(duì)象，研究刺五加對(duì)酒精戒斷焦慮樣行為的作用，并且探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器刺五加浸膏(黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司，20190506)，95%乙醇，氯化鈉注射液(0.9%)(哈爾濱市化工試劑廠分廠，批號(hào)：20200520分析純)，磷酸二氫鉀(恒興試劑，批號(hào)：2020630色譜純)，去甲腎上腺素標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物公司，批號(hào)：20210105色譜純)，高效液相色譜儀LC2000(上海天美科學(xué)儀器有限公司)，離心機(jī)(eppendorf centrifuge 5424)，勻漿機(jī)(motor cordless749540-0000)，高架十字迷宮(上海欣軟信息科技有限公司)。

1.2 分組與造模SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，體重220～250 g，由牡丹江醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心提供，許可證號(hào)：SCXK(黑)2019-00。動(dòng)物房溫度(22.0±2.0)℃，飼養(yǎng)期間自由飲食進(jìn)水。將60只大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為空白組、模型組、陽(yáng)性藥物組、高劑量刺五加組、中劑量刺五加組和低劑量刺五加組。空白組按體重進(jìn)行腹腔注射生理鹽水(15 mL/kg)作為對(duì)照，其他五組則按照體重腹腔注射20%(w/v)酒精(15 mL/kg)，1次/d，持續(xù)28 d，建立大鼠的酒精依賴(lài)。以大鼠進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù)百分比和在開(kāi)放臂停留的時(shí)間百分比的差別同時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，評(píng)價(jià)為造模成功。3 d后，空白組和模型組用生理鹽水灌胃作為對(duì)照(15 mL/kg)；刺五加浸膏用溫水溶解成需要的濃度，高劑量刺五加組、中劑量刺五加組和低劑量刺五加組分別按照900 mg/kg、300 mg/kg、100 mg/kg的劑量灌胃，陽(yáng)性藥物組地西泮則按照5 mg/kg的劑量進(jìn)行灌胃；所有組均1次/d，連續(xù)5 d。

1.3 行為學(xué)評(píng)價(jià)停止腹腔注射第3天和最后一次給大鼠灌胃給藥1 h后，進(jìn)行高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)。高架十字迷宮裝置由兩條相對(duì)封閉臂(50 cm×10 cm)、兩條相對(duì)開(kāi)放臂(50 cm×10 cm×40 cm)以及中央?yún)^(qū)(10 cm×10 cm)組成。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，將大鼠從中央?yún)^(qū)域面向閉合臂放入迷宮，由軟件自動(dòng)記錄5 min內(nèi)的活動(dòng)情況。

采集器記錄的指標(biāo)包括：開(kāi)放臂的進(jìn)入次數(shù)(open arm entry,OE)，在開(kāi)放臂的停留時(shí)間(open arm time,OT)，閉合臂的進(jìn)入次數(shù)(close arm entry,CE)，在閉合臂的停留時(shí)間(close arm time,CT)。根據(jù)記錄的數(shù)據(jù)計(jì)算以下指標(biāo)：進(jìn)入開(kāi)放臂和閉合臂的總次數(shù)(OE+CE)：用于表示大鼠的自主活動(dòng)性；進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù)百分比(OE%)=OE/(OE+CE)×100%和在開(kāi)放臂停留的時(shí)間百分比(OT%)=OT/(OT+CT)×100%。OE%和OT%與大鼠的焦慮情緒成負(fù)相關(guān)，OE%和OT%越小，說(shuō)明老鼠的焦慮情緒越嚴(yán)重。

1.4 HPLC測(cè)試大鼠海馬組織去甲腎上腺素含量

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Kromasi 100-5 Cl8(4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相：0.15 mol/L磷酸二氫鉀(pH=5.5)-甲醇=9∶1，流速1 mL/min，等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm，柱溫30 ℃。

1.4.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)定去甲腎上腺素標(biāo)準(zhǔn)品2 mg，并用0.1 mol/L的高氯酸溶解、定容至50 mL，得到40 ng/μL的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。取適量貯備液，分別稀釋為20 ng/μL、10 ng/μL、5 ng/μL、2.5 ng/μL、1.25 ng/μL的對(duì)照品溶液。

1.4.3 海馬腦組織勻漿樣品的制備 5%水合氯醛麻醉大鼠，斷頭處死，迅速取出海馬，稱(chēng)重，將4 ℃保存的0.1 mol/L高氯酸按照1 mL/g加入至海馬樣品中，在冰盤(pán)中進(jìn)行1 min的勻漿后，立即15000 r/min離心20 min后取出上清液，將上清液再次在15000 r/min的條件下離心20 min，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，迅速進(jìn)樣。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SPSS 22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)量資料用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，計(jì)數(shù)資料以n(%)表示。采用單因素方差分析(ANOVA)，運(yùn)用Dunnett-t檢驗(yàn)多重比較，P<0.05則具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 刺五加提取物對(duì)大鼠OE%和OT%的影響給藥前，相對(duì)于空白組，其余各組的OE%和OT%顯著降低，說(shuō)明大鼠酒精戒斷模型造模成功；給藥后，相對(duì)于模型組，高劑量刺五加明顯提高了酒精戒斷大鼠OE%(P=0.0108)和OT%(P=0.0267)；但是與模型組相比，中、低劑量的刺五加對(duì)酒精戒斷的大鼠焦慮的影響不顯著(P>0.05)；與陽(yáng)性藥物組相比，高劑量刺五加組的作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 六組大鼠OE%和OT%比較

2.2 HPLC測(cè)定結(jié)果

2.2.1 去甲腎上腺素的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線 取對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下各進(jìn)樣20 μL，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣濃度X(ng/μL)為橫坐標(biāo)作圖，檢測(cè)線性范圍為1.25 ng/μL～40 ng/μL，峰面積與進(jìn)樣濃度成良好的線性關(guān)系；通過(guò)SPSS 22.0軟件進(jìn)行線性回歸模擬，得到線性回歸方程。如圖1所示，經(jīng)SPSS 22.0得到去甲腎上腺素的標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線方程為：y=10.0188x-0.6970(R2=0.9998)。

圖1 HPLC條件下繪制的去甲腎上腺素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 儀器精密度及重復(fù)性試驗(yàn) 按照1.4.1色譜條件，取濃度為20 μg/mL的去甲腎上腺素對(duì)照品液連續(xù)測(cè)定5次，測(cè)得精密度RSD為2.6%，表明儀器精密度良好。取同一樣品5份，進(jìn)樣，考察樣品峰面積的日內(nèi)精密度，結(jié)果表明，去甲腎上腺素的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.2%，表明試驗(yàn)方法具有良好的重復(fù)性。

2.2.3 加樣回收率試驗(yàn) 取濃度為20 μg/mL的去甲腎上腺素對(duì)照品溶液16 μL、20 μL、24 μL加入6 份海馬勻漿液樣品中，按“1.4.3”項(xiàng)下方法處理，測(cè)定含量，以計(jì)算方法回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率測(cè)定結(jié)果

2.2.4 大鼠海馬中去甲腎上腺素的含量 結(jié)果顯示(表3)，與空白組相比，模型組的去甲腎上腺素濃度明顯升高(P=0.003)；與模型組相比，高劑量刺五加組的去甲腎上腺素含量降低(P=0.029)；中低劑量刺五加組的去甲腎上腺素的降低不顯著(P>0.05)。

表3 HPLC檢測(cè)六組大鼠海馬中去甲腎上腺素的濃度

3 討論

對(duì)去甲腎上腺素能神經(jīng)在中樞神經(jīng)的作用機(jī)制的研究顯示，去甲腎上腺素能神經(jīng)元支配邊緣和前腦的關(guān)鍵區(qū)域，這些區(qū)域參與覺(jué)醒、強(qiáng)化和壓力反應(yīng)過(guò)程，參與AUD的發(fā)展和維持。去甲腎上腺素能神經(jīng)元胞體聚集在腦干和腦橋的七個(gè)離散的核中，其軸突廣泛投射到大腦和脊髓。這些核中最大、最具特征的是藍(lán)斑(A6)。而海馬接受了大量的來(lái)自藍(lán)斑的腎上腺素能纖維投射，海馬內(nèi)分布著豐富的腎上腺素能受體。經(jīng)過(guò)證明，它與應(yīng)激、焦慮、酒類(lèi)和阿片類(lèi)藥物反應(yīng)有關(guān)[6]。過(guò)度的去甲腎上腺素能激活，伴隨著酒精戒斷和壓力反應(yīng)，產(chǎn)生焦慮。

本研究的高架十字迷宮測(cè)試的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酒精戒斷后大鼠表現(xiàn)出了焦慮樣癥狀，但在使用高劑量的刺五加浸膏灌胃治療后，焦慮樣癥狀得到了緩解。高效液相的結(jié)果則從神經(jīng)遞質(zhì)的角度，揭示其起作用的機(jī)制，即降低酒精戒斷大鼠的海馬中去甲腎上腺素的濃度。而臨床上針對(duì)性用藥也印證了這一點(diǎn)[7]，針對(duì)腎上腺素能神經(jīng)的受體藥物可以用于治療AUD，比如：阻斷突觸后α-1受體(哌唑嗪和多沙唑嗪)或突觸后β受體(普萘洛爾)，或作用于突觸前α-2受體(可樂(lè)定)的藥物，經(jīng)臨床證明，都可減少患者臨床前和臨床中的酒精攝入，改善患者AUD癥狀。

綜上所述，本研究證實(shí)刺五加提取物的應(yīng)用，可使酒精戒斷大鼠的焦慮行為得到緩解，并且改善了由于酒精戒斷引起的海馬中去甲腎上腺素水平升高，為進(jìn)一步探討刺五加提取物治療酒精戒斷后的焦慮提供了依據(jù)。