EGCG通過(guò)激活A(yù)MPK、抑制PPARγ調(diào)控3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂滴蓄積

管巧麗，吳曉云，李 芳,*，盛 軍

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 普洱茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，云南 昆明 650201）

肥胖是近年來(lái)世界范圍內(nèi)的主要健康問(wèn)題之一，通常是由于食物攝入與能量消耗不平衡，脂肪細(xì)胞肥大和增生而導(dǎo)致的脂肪量過(guò)多和脂肪組織擴(kuò)張[1]。早在2013年肥胖被美國(guó)醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)（American Medical Association）認(rèn)定為一種疾病之前，肥胖的發(fā)生率一直在穩(wěn)步增長(zhǎng)[2]。截至2016年的全球統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，13%（6.5億）的成年人肥胖，19億人超重，據(jù)估計(jì)，2025年全球60%的死亡將由肥胖相關(guān)疾病引起[3]。在遺傳易感性個(gè)體中，高熱量飲食和缺乏體力活動(dòng)等環(huán)境因素可能會(huì)引發(fā)肥胖。作為一種慢性疾病，抗肥胖治療依賴于生活方式的改變、手術(shù)和藥物治療[4-6]。相對(duì)于使用手術(shù)和藥物減輕體質(zhì)量，運(yùn)動(dòng)或者通過(guò)飲食干預(yù)更容易被人們接受。

茶是一種被人們廣泛接受的飲料。綠茶已被證明具有許多潛在的健康益處[7]，包括抗氧化、抗癌和保護(hù)心臟活性，并可能影響能量平衡的多個(gè)方面[8-9]，綠茶對(duì)健康的好處主要是由于其高濃度的多酚，這些多酚統(tǒng)稱為兒茶素。綠茶多酚被廣泛報(bào)道可以改善人類和動(dòng)物模型的肥胖和代謝綜合征[10-11]。有研究表明綠茶提取物和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）可顯著提高脂質(zhì)活性并降低脂肪組織質(zhì)量[12-13]。在探究綠茶多酚對(duì)減輕體質(zhì)量作用的研究中，報(bào)道了幾種多酚可以刺激腺苷一磷酸（adenosine monophosphate，AMP）活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）的活性[14-16]。激活A(yù)MPK會(huì)降低糖異生和脂肪酸合成，增加分解代謝[17-19]，有研究者提出“AMPK假說(shuō)”，AMPK在介導(dǎo)EGCG對(duì)脂肪酸合成和分解代謝的作用中起重要作用[6]。他們提出了EGCG促進(jìn)減輕體質(zhì)量的兩個(gè)主要機(jī)制：1）減少腸道內(nèi)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的吸收，從而減少熱量攝入；2）AMPK在肝臟、骨骼肌和白色脂肪組織中的激活。激活A(yù)MPK途徑可能為肥胖、胰島素抵抗、內(nèi)分泌和心血管疾病的治療提供新的靶點(diǎn)[20]。Moreno等在EGCG影響高脂飲食誘導(dǎo)肥胖模型的研究中發(fā)現(xiàn)，EGCG可以降低小鼠肥胖和附睪白色脂肪組織質(zhì)量，并且部分是通過(guò)激活A(yù)MPK實(shí)現(xiàn)的[21]。也有文獻(xiàn)指出EGCG可以抑制脂肪細(xì)胞的分化[6]，但EGCG減輕體質(zhì)量和脂肪組織質(zhì)量的具體機(jī)制不清楚，也鮮有文獻(xiàn)報(bào)道EGCG改善細(xì)胞中脂滴蓄積的具體機(jī)制。因此，本研究以EGCG為實(shí)驗(yàn)原料，通過(guò)體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞，研究EGCG對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂滴蓄積的影響，為改善肥胖癥的分子機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3T3-L1前脂肪細(xì)胞 中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所；EGCG（純度大于98%） 成都生物凈化植物化工有限公司；Dublecco改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）和高糖培養(yǎng)基 美國(guó)HyClone公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒上海碧云天生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國(guó)Amresco公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%聚丙烯酰胺貯液 中國(guó)Bio-RAD公司；0.5 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 6.8）、1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 6.8）、四甲基乙二胺、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methyl-7H-xanthine，IBMX） 美國(guó)Sigma公司；噻唑藍(lán)（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT） 博美生物有限公司；抗兔免疫球蛋白、抗鼠免疫球蛋白 美國(guó)R&D公司；無(wú)水乙醇、油紅O 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；異丙醇 四川西隴化工有限公司；TransZol Up 北京全式金生物技術(shù)有限公司；三氯甲烷（氯仿） 重慶川東化工集團(tuán)有限公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛濟(jì)南百博生物技術(shù)有限公司；馬來(lái)酸羅格列酮中國(guó)蓋德化工廠；胰島素 江蘇萬(wàn)邦生物醫(yī)藥股份有限公司；PrimeScript RT reagent kit with gDNA試劑盒日本Takara公司；去污劑、裂解液、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、硫酸銨、甘氨酸、甘油、β-巰基乙醇、溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)G250、牛血清白蛋白、青鏈霉素混合液、10×磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS，pH 7.4） 北京索萊寶生物科技有限公司；脫脂奶粉 美國(guó)BD公司。

1.2 儀器與設(shè)備

C150型CO2氣體培養(yǎng)箱 德國(guó)Binder公司；DM-1L LED倒置顯微鏡 德國(guó)Leica公司；CKX41倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司；U-2910紫外分光光度計(jì)日本日立公司；7900HT型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；Z36HK型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Hermle Labortechnik GmbH公司；VORTES QL-902型漩渦儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；掌上離心機(jī)日本TOMY公司；DHG-9240A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FST-III-80純水機(jī) 普力菲爾純凈水有限公司；96 孔板 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化及EGCG處理細(xì)胞

細(xì)胞復(fù)蘇：取凍存的3T3-L1前脂肪細(xì)胞，將其置于37 ℃流水下快速融化，融化后加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基10 mL，混勻后離心（1500 r/min、3 min），吸棄離心后的上清液，加入10 mL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基吹打細(xì)胞并混勻，將含細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿至80%～90%，融合4～5 d觀察細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，吸除培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入37 ℃預(yù)熱的PBS清洗細(xì)胞，吸除PBS，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青鏈霉素、10 μg/mL胰島素、0.5 μmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1 μmol/L羅格列酮、1 μmol/L地塞米松的DMEM高糖培養(yǎng)基）。培養(yǎng)3 d后再換胰島素誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%雙抗、10 μg/mL胰島素的DMEM高糖培養(yǎng)基）培養(yǎng)3 d，最后換含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，誘導(dǎo)分化10 d左右，顯微鏡下觀察3T3-L1細(xì)胞90%表現(xiàn)為成熟脂肪細(xì)胞表型（油紅O染色鑒定），即可用于實(shí)驗(yàn)。EGCG處理細(xì)胞時(shí)使用pH 6.5的DMEM酸性培養(yǎng)基，作用質(zhì)量濃度分別為25、50 μg/mL，以不含EGCG的培養(yǎng)基為對(duì)照組（即0 μg/mL的EGCG，后同），孵育時(shí)間分別為72 h和144 h。

1.3.2 細(xì)胞存活率測(cè)定

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3T3-L1細(xì)胞接種于96 孔板（2×104個(gè)/孔），加入含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（200 μL/孔），37 ℃孵育24 h后吸棄培養(yǎng)液，更換為含有不同質(zhì)量濃度EGCG（0、25、50 μg/mL）的DMEM培養(yǎng)基（200 μL/孔），每組設(shè)置3個(gè)平行，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，每孔加20 μL 5 mg/mL MTT儲(chǔ)備液，避光，繼續(xù)孵育培養(yǎng)4 h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，搖床上振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀上設(shè)置492 nm波長(zhǎng)，檢測(cè)各孔光密度值并按下式計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.3 3T3-L1脂肪細(xì)胞的鑒定（油紅O染色鑒定）和甘油三酯相對(duì)含量的測(cè)定

取1.3.1節(jié)不同質(zhì)量濃度EGCG（0、25、50 μg/mL）處理144 h后的3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)板，PBS清洗兩次；4%多聚甲醛（4 ℃冰箱存放）固定30 min后，使用PBS清洗兩次；使用異丙醇配制0.5%油紅O儲(chǔ)液，再按油紅O儲(chǔ)液與蒸餾水體積比3∶2配制油紅O工作液，混勻靜置10 min；取500 μL油紅O工作液覆蓋培養(yǎng)板，染色10 min左右；PBS清洗一次，棄上清液；在倒置顯微鏡下調(diào)整物鏡、目鏡，在相同倍數(shù)下觀察并拍照保存圖片。

甘油三酯相對(duì)含量的測(cè)定：取1.3.1節(jié)不同質(zhì)量濃度EGCG（0、25、50 μg/mL）處理72、144 h后的3T3-L1細(xì)胞，參考甘油三酯試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定甘油三酯的相對(duì)含量。

1.3.4 AMPK抑制劑Dorsomorphin處理3T3-L1脂肪細(xì)胞的方法

按1.3.1節(jié)方法誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞以及EGCG（0、50 μg/mL）處理，孵育3T3-L1細(xì)胞144 h：加入含有EGCG（50 μg/mL）和AMPK抑制劑Dorsomorphin（40 μmol/L）的DMEM培養(yǎng)基共同孵育3T3-L1細(xì)胞144 h，即Dorsomorphin抑制組；只含40 μmol/L Dorsomorphin的DMEM培養(yǎng)基孵育3T3-L1細(xì)胞144 h，即單獨(dú)抑制劑組。

1.3.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法測(cè)定蛋白表達(dá)水平

取1.3.1節(jié)不同質(zhì)量濃度EGCG（0、25、50 μg/mL）處理72、144 h后的3T3-L1細(xì)胞以及1.3.4節(jié)中Dorsomorphin抑制組和單獨(dú)抑制劑組細(xì)胞，使用含體積分?jǐn)?shù)1%苯甲基磺酰氟的裂解液提取總蛋白，采用BCA定量法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。在每孔加入蛋白溶液（含60 μg蛋白），用質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，將膜用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉試劑封閉1 h，在4 ℃下與一抗Bax、cleaved-Caspase 3、β-actin、磷酸化-AMPK（phospho-AMPK，p-AMPK）、AMPK、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARγ）、Tubulin、PGC-1α（1∶1 000）孵育12 h以上，然后與4 μL相應(yīng)的二抗（抗兔免疫球蛋白和抗鼠免疫球蛋白，1∶5 000）室溫?fù)u床孵育1 h。采用Western blotting圖像用超靈敏增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物試劑盒成像，通過(guò)FluorChem E系統(tǒng)獲得結(jié)果圖像，使用AlphaView軟件對(duì)相應(yīng)的條帶進(jìn)行量化。

1.3.6 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)定基因表達(dá)水平

取1.3.1節(jié)不同質(zhì)量濃度EGCG（0、25、50 μg/mL）處理72、144 h后的3T3-L1細(xì)胞，使用TRIzol提取總RNA，采用TaKaRa PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用SYBR Green I reaction system進(jìn)行PCR，基因表達(dá)水平采用2－ΔΔCt法計(jì)算。引物序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR基因引物序列Table 1 Sequences of primers for real time quantitative polymerase chain reaction used in this study

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件和GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析和最小顯著差異（least significant difference，LSD）檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，其中P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著性，P＜0.001為差異高度顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞活性及脂代謝的影響

2.1.1 EGCG處理對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞活性的影響

為了檢測(cè)EGCG對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的影響，使用EGCG不同質(zhì)量濃度處理3T3-L1前脂肪細(xì)胞72 h，與對(duì)照組相比，細(xì)胞活性顯著增強(qiáng)（圖1A），然后對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行蛋白免疫印跡分析。結(jié)果顯示，不同質(zhì)量濃度的EGCG對(duì)細(xì)胞凋亡促進(jìn)蛋白Bax的表達(dá)沒(méi)有影響（圖1B、C），而細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的Cleaved-caspase 3的表達(dá)水平在使用50 μg/mL EGCG 處理72 h后顯著降低（圖1B）。以上研究結(jié)果表明，EGCG可能不會(huì)引起3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞的凋亡。

圖1 EGCG處理對(duì)3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白Bax、Cleaved-caspase 3表達(dá)水平的影響Fig. 1 Effect of EGCG treatment on cell viability and the expression of Bax and Cleaved-caspase 3 related to apoptosis in mature 3T3-L1 adipocytes

2.1.2 EGCG對(duì)成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞脂滴蓄積的影響

脂肪細(xì)胞的數(shù)量和大小決定了人體的胖瘦程度。以脂滴體積增大為特征的脂肪細(xì)胞肥大已被證實(shí)是導(dǎo)致肥胖者脂肪組織擴(kuò)張的主要機(jī)制。脂滴是一種分布廣泛、進(jìn)化高度保守的細(xì)胞器，由磷脂單分子層、中性脂核和大量脂滴相關(guān)蛋白組成[22-23]。因此在3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化成為成熟的脂肪細(xì)胞后，檢測(cè)了EGCG對(duì)3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞脂滴大小的影響。在EGCG處理時(shí)間相同的條件下，隨著EGCG處理質(zhì)量濃度的增加，3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞脂滴數(shù)量以及大小減小，當(dāng)EGCG處理質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，脂滴變小得最為明顯（圖2A）。而在EGCG處理質(zhì)量濃度相同的條件下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞脂滴數(shù)量以及大小也減?。ńY(jié)果未顯示），當(dāng)EGCG處理時(shí)間為144 h時(shí)，脂滴變小得最明顯（圖2A）。分析EGCG處理72、144 h后3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞中的甘油三酯相對(duì)含量，可發(fā)現(xiàn)EGCG處理減少了脂肪細(xì)胞中甘油三酯的相對(duì)含量（圖2B）。以上結(jié)果表明，EGCG的處理可以減小成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞脂滴的大小并減少甘油三酯的相對(duì)含量。

圖2 EGCG處理3T3-L1細(xì)胞油紅O染色結(jié)果及甘油三酯相對(duì)含量的變化Fig. 2 Oil red O staining and relative content of total triglycerides in 3T3-L1 cells treated with EGCG

2.1.3 EGCG對(duì)成熟3T3-L1細(xì)胞脂代謝相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平的影響

為了探討EGCG降低3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞脂滴大小的具體機(jī)制，對(duì)3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞中脂代謝相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)（圖3）。EGCG分別處理3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞72 h和144 h后發(fā)現(xiàn)，脂肪合成相關(guān)基因（acc1、srebp1c、fas、scd-1、pparγ、dgat1、elovl6）的mRNA水平的表達(dá)整體上顯著下降（圖3A、E）。參與脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)基因（mttp、cd36、fatp1、fatp4）的mRNA水平的表達(dá)顯著下降（圖3B、F）；與脂滴形成相關(guān)的基因cgi 58的mRNA水平的表達(dá)顯著下降（圖3C、G）；與脂肪分解相關(guān)的基因atglmRNA水平的表達(dá)顯著下降（圖3D、H）。EGCG處理質(zhì)量濃度為50 μg/mL比25 μg/mL下各基因mRNA表達(dá)水平下降得更加明顯，結(jié)果表明，EGCG抑制了脂肪合成、脂肪分解、脂肪吸收以及脂滴形成這些脂代謝相關(guān)基因的mRNA水平的表達(dá)，且50 μg/mL的EGCG處理抑制效果更加顯著。結(jié)果表明EGCG處理使脂滴大小變小可能與EGCG抑制脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。

圖3 EGCG對(duì)3T3-L1細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因mRNA水平的影響Fig. 3 Effect of EGCG on mRNA expression levels of genes related to lipid metabolism in 3T3-L1 cells

2.2 EGCG通過(guò)激活A(yù)MPK抑制成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞PPARγ的表達(dá)

EGCG可以抑制脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)，但機(jī)制并不清楚。Yang等提出AMPK在介導(dǎo)EGCG對(duì)脂肪酸合成和分解代謝的作用中發(fā)揮主要作用[6]。因此，在使用EGCG處理3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞144 h后通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)AMPK的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示EGCG能顯著激活A(yù)MPK的表達(dá)（圖4A）。有文獻(xiàn)報(bào)道，AMPK可以通過(guò)抑制PPARγ調(diào)控脂肪的合成及儲(chǔ)存[6]。通過(guò)檢測(cè)PPARγ和其輔活化因子PGC-1α的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，EGCG能明顯降低3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞中PPARγ和PGC-1α的蛋白表達(dá)水平（圖4A、B）。另外，PPARγ的蛋白表達(dá)水平也隨著EGCG處理質(zhì)量濃度的提高而顯著下降（圖4B）。這些研究結(jié)果表明，EGCG可能通過(guò)抑制PPARγ的表達(dá)來(lái)調(diào)控成熟脂肪細(xì)胞中脂滴蓄積。

圖4 EGCG對(duì)3T3-L1細(xì)胞p-AMPK、AMPK、PPARγ蛋白表達(dá)水平的影響Fig. 4 Effect of EGCG on the expression levels of phospho-AMPK,AMPK and PPARγ in 3T3-L1 cells

為了驗(yàn)證EGCG是否通過(guò)激活A(yù)MPK來(lái)抑制PPARγ的表達(dá)，使用AMPK的抑制劑Dorsomorphin處理3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞。Dorsomorphin處理3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞后，顯著抑制了p-AMPK的表達(dá)（圖4A）；而當(dāng)EGCG和Dorsomorphin同時(shí)存在時(shí)，EGCG能顯著增加p-AMPK的表達(dá)（圖4A）。與對(duì)照組相比，Dorsomorphin處理以后，PPARγ的表達(dá)顯著增加，而在Dorsomorphin存在下，加入EGCG可以使PPARγ的表達(dá)降低（圖4A）。以上結(jié)果表明，EGCG可以使AMPK活化，并降低PPARγ的表達(dá)，且通過(guò)活化的AMPK來(lái)抑制PPARγ的表達(dá)。

3 討 論

綠茶能夠預(yù)防肥胖，并調(diào)節(jié)脂肪合成和脂肪氧化途徑。綠茶和具有類似性質(zhì)的分子可能成為尋找能量平衡和健康的新靶標(biāo)[24]。茶葉都有降脂減肥作用，直到近幾十年才發(fā)現(xiàn)是茶葉中單體成分EGCG起著重要的作用[25]。EGCG影響脂代謝的機(jī)制仍然是一個(gè)有趣的研究領(lǐng)域。本研究的目的是確定EGCG是否可以減少3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞中的脂滴蓄積并探討其機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞，當(dāng)EGCG處理質(zhì)量濃度為50 μg/mL、處理時(shí)間為144 h時(shí)，與對(duì)照組相比，脂滴大小顯著減?。▓D2A），甘油三酯相對(duì)含量降低（圖2B）。而脂滴大小減小是否影響了其脂類代謝以及信號(hào)傳導(dǎo)，本研究對(duì)脂類代謝相關(guān)因子的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG處理降低了脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)，包括acc1、srebp1c、fas、scd-1、pparγ、dgat1、elovl6；降低了脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)，包括mttp、cd36、fatp1、fatp4；降低了脂肪分解相關(guān)基因atgl的表達(dá)；也降低了與脂滴合成相關(guān)的基因cgi 58的表達(dá)（圖3），這與之前發(fā)表的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果[21]一致。

Yang等提出AMPK在介導(dǎo)EGCG對(duì)脂肪酸合成和分解代謝的作用中發(fā)揮主要作用[6]。AMPK是機(jī)體細(xì)胞主要的能量傳感器，參與脂肪酸氧化與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、甘油三酯的合成與代謝等多種細(xì)胞代謝過(guò)程[6,24]。本研究發(fā)現(xiàn)EGCG處理3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞可以激活A(yù)MPK（圖4A），那么，AMPK在介導(dǎo)EGCG減小3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞脂滴大小的過(guò)程中是否也發(fā)揮作用呢？本研究結(jié)果顯示EGCG可以降低3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞的PGC-1α和PPARγ的表達(dá)水平（圖4B）。有文獻(xiàn)報(bào)道，AMPK可以通過(guò)抑制PPARγ調(diào)控脂肪的合成及儲(chǔ)存，而PGC-1α是PPARγ的輔活化子[6,26]。那么，EGCG是否通過(guò)激活A(yù)MPK抑制PPARγ調(diào)控脂肪的合成及儲(chǔ)存，從而來(lái)調(diào)節(jié)脂滴蓄積呢？本研究使用AMPK的抑制劑Dorsomorphin處理3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)AMPK的抑制劑顯著抑制了p-AMPK的表達(dá)，而EGCG與AMPK抑制劑共同使用處理細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)p-AMPK的表達(dá)可以獲得部分恢復(fù)（圖4A）。與對(duì)照組相比，AMPK的抑制劑Dorsomorphin可以使PPARγ的表達(dá)顯著增加，而在Dorsomorphin存在下，加入EGCG可以使PPARγ的表達(dá)被顯著抑制（圖4A）。這些研究結(jié)果表明，EGCG通過(guò)激活A(yù)MPK抑制PPARγ的表達(dá)，從而達(dá)到減少脂滴蓄積的目的。

在對(duì)脂類代謝相關(guān)因子的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，EGCG顯著降低了參與脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)（圖3B），這表明EGCG可以抑制脂肪的吸收。有文獻(xiàn)報(bào)道，EGCG可以抑制大鼠脂質(zhì)吸收[27]，這與本研究結(jié)果一致，但具體機(jī)制仍不清楚。有文獻(xiàn)指出cd36的表達(dá)受PPARγ的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，因?yàn)樵赾d36啟動(dòng)子的近端區(qū)域存在PPARγ反應(yīng)元件[28]；PPARγ可以激活fatp和ap2基因的表達(dá)，ap2、fatp是PPARγ的靶基因，位于PPARγ下游，受PPARγ調(diào)控，在葡萄糖和脂質(zhì)代謝中起重要作用[29-30]。因此，EGCG可能通過(guò)抑制PPARγ從而降低參與脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)基因如cd36、fatp的表達(dá)從而抑制了脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道，CD36可抑制AMPK的活化，敲減cd36可以顯著增強(qiáng)AMPK的活化水平[31-32]。因此，根據(jù)上述討論內(nèi)容，推測(cè)EGCG調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞脂滴大小的機(jī)制可能是通過(guò)增強(qiáng)AMPK的活化，來(lái)抑制PPARγ的表達(dá)，從而抑制與脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)和脂肪吸收相關(guān)基因的表達(dá)，來(lái)降低脂滴的大?。涣硪环矫?，cd36基因表達(dá)的下調(diào)又反過(guò)來(lái)增強(qiáng)AMPK的活化水平（圖5）。

圖5 EGCG調(diào)控3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞中脂滴蓄積機(jī)制示意圖Fig. 5 Schematic diagram of the mechanism of EGCG regulating lipid droplet accumulation in 3T3-L1 mature adipocytes

綜上，EGCG處理3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞可以降低脂滴大小和脂肪細(xì)胞甘油三酯相對(duì)含量，其降低脂滴大小的機(jī)制可能與增強(qiáng)AMPK活性有關(guān)。一方面，AMPK活性增加使PPARγ的表達(dá)降低從而調(diào)控脂肪合成和分解，進(jìn)而減小脂滴大小；另一方面，AMPK通過(guò)抑制PPARγ從而抑制cd36、fatp1、fatp4這些與脂肪吸收相關(guān)基因的表達(dá)，減少脂肪吸收進(jìn)而減少脂肪細(xì)胞中脂滴蓄積。