急性低氧應(yīng)激對(duì)鯽魚血液生化指標(biāo)的影響

王雪芹，陽(yáng) 濤

(1 水產(chǎn)健康養(yǎng)殖四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；2通威股份有限公司動(dòng)物保健研究所，四川 成都 610041)

隨著人們對(duì)鮮活水產(chǎn)品需求的日漸增大[1]，水產(chǎn)動(dòng)物運(yùn)輸量也不斷增大，運(yùn)輸過程中環(huán)境脅迫所引起的水產(chǎn)動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)問題日漸突出，尤其是長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸造成水體的溶氧不斷消耗，會(huì)引起魚類強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)甚至死亡。適宜的溶氧水平對(duì)魚類的生物活動(dòng)會(huì)起到積極作用，當(dāng)水體低氧時(shí)，會(huì)造成機(jī)體血液生化指標(biāo)的變化，引起魚類應(yīng)激反應(yīng)[2-3]。

應(yīng)激作用下，魚類機(jī)體大量分泌皮質(zhì)醇(COR)，可調(diào)節(jié)糖原、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝[4-6]，加速糖異生，為機(jī)體提供能量，對(duì)抗應(yīng)激[7-8]。因此血清COR和葡萄糖(GLU)含量常被作為檢測(cè)魚體應(yīng)激的敏感指標(biāo)[9]。低氧環(huán)境下，魚體血液攝取和攜帶氧氣的能力會(huì)發(fā)生改變，引起血紅蛋白(Hb)和高鐵血紅蛋白(MetHb)等指標(biāo)的變化[10]；體內(nèi)熱休克蛋白70(Hsp70)基因的表達(dá)量會(huì)顯著上調(diào)[11]，同時(shí)，機(jī)體超氧化物歧化酶(SOD)等的活力上升，用以清除過量的活性氧自由基(ROS)[14]，維持正常的生理活動(dòng)。因此，研究血液相關(guān)生化指標(biāo)的變化，綜合評(píng)價(jià)魚類在持續(xù)低氧狀態(tài)下的應(yīng)激水平，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物運(yùn)輸策略有重大的理論和實(shí)踐指導(dǎo)意義。

鯽魚(Carassiusauratus)是中國(guó)主要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類之一，可作為低氧應(yīng)激研究的理想魚類對(duì)象[15]。本研究在急性低氧條件下，研究鯽魚血液生化指標(biāo)的變化，以期為鯽魚的科學(xué)養(yǎng)殖和運(yùn)輸提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

鯽魚購(gòu)買自成都市新津縣金華鎮(zhèn)養(yǎng)殖戶塘口，魚體質(zhì)量為(54.24±5.65)g，體長(zhǎng)為(14.82±0.41)cm，為同一批次，且健康無病。鯽魚購(gòu)進(jìn)后，使用1%食鹽水浸浴5 min，然后將100尾鯽魚暫養(yǎng)于規(guī)格為150 cm×60 cm×70 cm的玻璃缸中(養(yǎng)殖用水體積500 L)。暫養(yǎng)期間保持水體溫度(20.0±0.5)℃，水中溶氧>5 mg/L，pH 7.2～7.6，氨氮≤0.1 mg/L，每天上午使用曝氣自來水換水一次，每次換水量約為養(yǎng)殖水體的1/2。每天投喂飼料兩次，時(shí)間分別為9：00和16：30，投飼率約1.5%，飼料為通威飼料152#，2.0 mm粒徑膨化料。暫養(yǎng)10 d后待試驗(yàn)魚狀態(tài)及攝食穩(wěn)定后開始進(jìn)行低氧應(yīng)激試驗(yàn)。試驗(yàn)開始前禁食24 h。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

挑選體質(zhì)健康，質(zhì)量均勻的鯽魚25尾，放置在150 L的玻璃缸中。低氧水平的設(shè)置參考相關(guān)文獻(xiàn)[16-18]的研究，溶氧設(shè)置為0.6 mg/L。試驗(yàn)前，完成常氧組(記為0 h，即對(duì)照組)的取樣，隨機(jī)取5尾，此時(shí)的溶氧含量為6.54 mg/L，水溫為20.1℃。隨后往魚缸中持續(xù)注入氮?dú)猓㈤_始計(jì)時(shí)，待溶氧下降到0.6 mg/L左右后，調(diào)節(jié)氮?dú)夂涂諝獾淖⑷肓髁縼矸€(wěn)定水中的溶氧。分別在試驗(yàn)進(jìn)行到3 h、6 h、12 h和24 h時(shí)進(jìn)行采樣。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)從缸中隨機(jī)取樣5尾。低氧脅迫期間水體溶氧(0.61±0.23)mg/L，水溫(20.1±0.3)℃。整個(gè)試驗(yàn)期間每1 h用哈希溶氧測(cè)定儀對(duì)水體溶氧進(jìn)行監(jiān)測(cè)一次。重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.3 血液采集

取樣時(shí)將魚迅速撈起并立即投入200 mg/L MS-222(間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽，Sigma)中快速深度麻醉，用1 mL注射器尾靜脈采血。其中一部分新鮮血液吸入提前準(zhǔn)備好的肝素抗凝管中，用于血液血紅蛋白和高鐵血紅蛋白的測(cè)定。剩余血液放入無菌離心管中4℃靜置待其血清析出，4 000 r/min，離心10 min制備血清，血清置于-80℃中保存，用于其他生化指標(biāo)測(cè)定。

1.4 生化指標(biāo)的測(cè)定

血液及血清生化指標(biāo)測(cè)定使用多功能酶標(biāo)儀(型號(hào)：Bio Tek Epoch)和紫外分光光度計(jì)(型號(hào)：MAPADA UV-1100)，試劑盒采購(gòu)自南京建成生物工程研究所。檢測(cè)指標(biāo)包括血紅蛋白(Hb)和高鐵血紅蛋白(MetHb)；血清激素指標(biāo)皮質(zhì)醇(COR)；血清生化指標(biāo)葡萄糖(GLU)；血清功能性蛋白指標(biāo)熱休克蛋白70(Hsp70)；抗氧化指標(biāo)超氧化物歧化酶(SOD)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，試驗(yàn)結(jié)果用 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，當(dāng)差異顯著時(shí)(P<0.05)，進(jìn)行Ducan多重比較。

2 結(jié)果

2.1 Hb和MetHb的含量

急性低氧應(yīng)激對(duì)Hb含量的影響見圖1 A。在急性低氧應(yīng)激過程中，Hb含量呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢(shì)，低氧應(yīng)激3 h、6 h時(shí)，Hb含量與0 h均無顯著性差異(P>0.05)，12 h時(shí)Hb含量顯著降低(P<0.05)，24 h時(shí)，Hb含量又恢復(fù)至0 h水平。

由圖1 B可知，急性低氧應(yīng)激過程中，MetHb含量呈現(xiàn)先微微上升，后快速下降的變化趨勢(shì)。低氧應(yīng)激3 h、6 h，MetHb含量與0 h均無顯著性差異(P>0.05)，12 h和24 h的MetHb含量較0 h顯著下降，24 h的MetHb含量與0 h有極顯著差異(P<0.01)。

圖1 急性低氧應(yīng)激對(duì)鯽魚血紅蛋白(A)和高鐵血紅蛋白(B)含量的影響Fig.1 Effects of acute hypoxia stress on hemoglobin(A)and methemoglobin(B)concentrations in Carassius auratus

2.2 血清COR和GLU含量

急性低氧應(yīng)激對(duì)血清COR含量的影響見圖2 A。COR含量變化受低氧應(yīng)激影響顯著，在低氧應(yīng)激過程中，COR含量在應(yīng)激3 h時(shí)含量顯著性升高(P<0.05)，3 h后便開始迅速下降，應(yīng)激6 h時(shí)COR含量降低至0 h水平，12 h和24 h的COR含量繼續(xù)降低，且這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)與0 h存在顯著性差異(P<0.05)。

由圖2 B可知，GLU含量隨著低氧應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)。低氧應(yīng)激過程中，GLU含量快速升高，3 h、6 h、12 h、24 h時(shí)，GLU 含量全部高于0 h水平，且存在顯著性差異(P<0.05)，12 h時(shí)GLU含量達(dá)到最高峰。24 h時(shí)含量降低至6 h的含量水平，與0 h血糖含量相比仍然存在極顯著差異(P<0.01)。

圖2 急性低氧應(yīng)激對(duì)鯽魚血清皮質(zhì)醇激素(A)和葡萄糖(B)含量的影響Fig.2 Effects of acute hypoxia stress on serum cortisol(A)and glucose(B)concentrations in carassius auratus

2.3 Hsp70含量

急性低氧應(yīng)激對(duì)血清Hsp70含量的影響見圖3 A。血清Hsp70含量隨著低氧應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)明顯的先升高后降低的變化趨勢(shì)。應(yīng)激3 h血清Hsp70含量顯著性升高(P<0.05)，6 h含量達(dá)到最高峰，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，應(yīng)激12 h血清Hsp70含量降至3 h含量水平，之后Hsp70含量繼續(xù)下降，24 h時(shí)Hsp70含量顯著低于0 h水平(P<0.05)。

圖3 急性低氧應(yīng)激對(duì)鯽魚血清熱休克蛋白70含量(A)和超氧化物歧化酶活力(B)的影響Fig.3 Effects of acute hypoxia stress on serum heat shock protein70(A)concentrations and superoxide dismutase activity(B)in Carassius auratus

2.4 血清SOD酶活力

由圖3B可知，鯽魚血清SOD活力在急性低氧3～12 h持續(xù)緩慢升高，24 h又有所下降，總體呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，但各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上SOD酶活力的變化差異不顯著(P>0.05)。

3 討論

3.1 急性低氧應(yīng)激對(duì)Hb和MetHb的影響

本研究結(jié)果顯示，低氧應(yīng)激12 h鯽魚血清Hb含量較應(yīng)激前水平降低約25%，24 h又恢復(fù)到應(yīng)激前水平。這與王曉雯[19]的研究結(jié)果基本一致，西伯利亞鱘魚(Acipenserbaerii)Hb含量在低氧處理3 h含量降低31.3%。Hb含量代表機(jī)體攜帶和運(yùn)輸氧氣的能力。鯽魚的Hb在低氧應(yīng)激后呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢(shì)，可能是隨著氧氣的消耗及機(jī)體缺氧程度的增加，血紅蛋白含量下降，以降低血氧親和力，使更多的氧氣供其他身體組織使用，后期機(jī)體逐漸由有氧呼吸轉(zhuǎn)為無氧呼吸方式，因此Hb含量又恢復(fù)至應(yīng)激前水平。另有研究發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)魚血液Hb含量與溶氧水平呈負(fù)相關(guān)，張曦等[20]研究發(fā)現(xiàn)鯽魚幼魚在急性低氧條件下處理3 h，Hb含量增加58%。董曉煜等[21]、黃國(guó)強(qiáng)等[22]也得到類似結(jié)論。此類研究認(rèn)為血紅蛋白與氧氣結(jié)合的程度受到PO2的影響，當(dāng)PO2較低，血紅蛋白與氧結(jié)合能力降低，機(jī)體血紅蛋白的增加可以補(bǔ)償由于水體溶氧較低造成的機(jī)體缺氧[23]。

MetHb是Hb的氧化產(chǎn)物，不能攜帶氧。本研究中，隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，試驗(yàn)魚缺氧的程度不斷加強(qiáng)，MetHb含量降低，意味著血紅蛋白更多的是以可與氧結(jié)合的形式存在于血液中，更加有利于機(jī)體對(duì)氧氣的充分利用，這可能與機(jī)體自身的防御性機(jī)制有關(guān)。一般研究顯示，MetHb含量受水體亞硝酸鹽含量影響較大，而有關(guān)低氧對(duì)其含量影響的研究較少[24]。

3.2 急性低氧應(yīng)激對(duì)血清COR和GLU含量的影響

本研究結(jié)果顯示，鯽魚血清COR在低氧應(yīng)激后呈現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)快速大量分泌，用以促進(jìn)葡萄糖的大量產(chǎn)生，為機(jī)體供能。另有大量研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)輸應(yīng)激[25]、擁擠應(yīng)激[26]、溫度應(yīng)激[27]、氨氮應(yīng)激[28]都會(huì)使試驗(yàn)魚血清COR含量在一定時(shí)間內(nèi)迅速升高。低氧處理后期COR含量又迅速降低，這可能與COR的負(fù)反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。

鯽魚在急性低氧應(yīng)激后，血清GLU含量快速升高，與齊明等[3]、陳德舉等[29]、黃建盛等[30]、劉旭佳等[31]、王慧娟等[32]的研究結(jié)果一致。說明急性低氧脅迫導(dǎo)致魚體出現(xiàn)應(yīng)激性血糖升高，為機(jī)體提供能量并應(yīng)對(duì)和適應(yīng)應(yīng)激脅迫，是一種機(jī)體自我保護(hù)機(jī)制的體現(xiàn)。隨著能量的大量消耗，應(yīng)激反應(yīng)后期，GLU水平就隨之下降。這也與試驗(yàn)過程中觀察到的試驗(yàn)魚狀態(tài)相吻合，隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，能量消耗嚴(yán)重，試驗(yàn)魚活力減弱，出現(xiàn)靜止不動(dòng)，昏迷，失衡等情況。除了低氧應(yīng)激，魚類受到的其他大多數(shù)應(yīng)激也伴隨著血糖的升高，如水溫變化[33]、氨氮脅迫[34]、擁擠脅迫[35]和干露脅迫[36]等。

3.3 急性低氧應(yīng)激對(duì)血清Hsp70含量的影響

本研究中，鯽魚在急性低氧應(yīng)激后血清Hsp70含量先顯著性升高，24 h時(shí)又大幅度下降。王曉陽(yáng)[37]研究發(fā)現(xiàn)，低氧條件下，鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)的心臟、腦、肝臟、脾等不同組織中，Hsp70基因表達(dá)在不同時(shí)間點(diǎn)均有不同程度的上調(diào)。崔彥婷等[38]、王曉雯等[39]研究高溫應(yīng)激后試驗(yàn)魚肝臟Hsp70基因表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，與本研究結(jié)果一致。HSPs表達(dá)被認(rèn)為是生物細(xì)胞抵抗有害刺激，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定最原始的機(jī)制之一，當(dāng)然，如果應(yīng)激強(qiáng)度過大，造成細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)損傷和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，就會(huì)使HSPs的表達(dá)合成降低[11]。

3.4 急性低氧應(yīng)激對(duì)血清SOD活力的影響

本研究中，鯽魚血清SOD活力總體呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，但各個(gè)時(shí)間點(diǎn)酶活力均稍高于應(yīng)激前水平。這與陳世喜等[40]和王維政等[41]對(duì)試驗(yàn)魚在低氧環(huán)境下肝臟SOD活力的研究結(jié)果一致。熊向英等[42]研究同樣顯示，鯔魚(Mugilcephalus)血漿中的總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力在低氧條件下有所升高。但在有些情況下，低氧應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致抗氧化相關(guān)酶活性被抑制，如王曉雯等[19]和郭志雄等[43]研究發(fā)現(xiàn)，低氧處理后試驗(yàn)魚肝臟SOD活力明顯降低，認(rèn)為低氧應(yīng)激后肝臟中產(chǎn)生了過多的活性氧自由基(ROS)，從而抑制了酶活性。另有研究發(fā)現(xiàn)[44-45]，低氧處理后，不同組織中的SOD活性變化趨勢(shì)不同，這可能與不同組織在受到脅迫后的損傷程度不同，或是組織內(nèi)SOD酶活對(duì)環(huán)境因子的敏感程度和調(diào)節(jié)機(jī)制不同導(dǎo)致。

4 結(jié)論

急性低氧應(yīng)激條件下，鯽魚的血液生化指標(biāo)Hb、MetHb、COR、GLU、Hsp70會(huì)隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)和低氧程度的增加產(chǎn)生顯著性的變化，暗示低氧應(yīng)激對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物激素分泌、血細(xì)胞水平、能量利用和機(jī)體抗應(yīng)激相關(guān)酶的活力等方面產(chǎn)生重要影響。因此，在水產(chǎn)動(dòng)物運(yùn)輸過程中，注重水體溶氧監(jiān)測(cè)及其他水質(zhì)指標(biāo)的調(diào)控，謹(jǐn)防由于低氧引起的魚類應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，降低運(yùn)輸損傷、提高運(yùn)輸存活率。此外，Hb、COR、GLU、Hsp70等指標(biāo)在用于水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體應(yīng)激水平的評(píng)價(jià)方面具有重要指導(dǎo)意義。

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