基于數(shù)據(jù)挖掘及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討乳香-沒(méi)藥治療乳腺癌的作用機(jī)制

姚 慧，孫 濤，徐君南

1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，沈陽(yáng) 116620；2遼寧省腫瘤醫(yī)院，沈陽(yáng) 110042

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年，女性乳腺癌首次超過(guò)肺癌，成為全球最常見(jiàn)的癌癥，約占新發(fā)癌癥病例的11.7%[1]。我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率也呈逐年上升且年輕化態(tài)勢(shì)。目前乳腺癌主要治療手段有手術(shù)、化療、放療、靶向治療等，均會(huì)產(chǎn)生不同程度的副反應(yīng)，影響患者預(yù)后。而中醫(yī)治療以其不良反應(yīng)小、有效改善患者生存質(zhì)量、延長(zhǎng)患者生存時(shí)間的優(yōu)勢(shì)，在乳腺癌治療中起著舉足輕重的作用。

乳香(frankincense)為橄欖科植物乳香樹(shù)BoswelliacarteriiBirdw.及同屬植物BoswelliabhaurdajianaBirdw.樹(shù)皮滲出的樹(shù)脂，性辛、溫，味苦，歸心、肝、脾經(jīng)，具有活血止痛、消腫生肌之效。沒(méi)藥(myrrh)是橄欖科(Burseraceae)沒(méi)藥屬CommiphoraEngl.植物地丁樹(shù)CommiphoramyrrhEngl.或哈地丁樹(shù)CommiphoramolmolEngl.的干燥樹(shù)脂[2]，性平，味辛、苦，歸心、肝、脾經(jīng)，散瘀止痛、消腫生肌之效佳。乳香、沒(méi)藥配伍應(yīng)用最早出現(xiàn)在《證治準(zhǔn)繩》中的“乳香止痛散”中，臨床上二者常以藥對(duì)形式出現(xiàn)，相須為用，協(xié)同增效，為活血化瘀類(lèi)常用中藥。

目前有乳香、沒(méi)藥針對(duì)關(guān)節(jié)炎、乳腺增生、癌性疼痛的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，這些研究只是直觀反映了化合物的靶點(diǎn)及通路之間的生物過(guò)程，尚沒(méi)有深層次的對(duì)乳香、沒(méi)藥治療乳腺癌進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及相關(guān)驗(yàn)證研究。本文通過(guò)查閱《腫瘤方劑大辭典》等中醫(yī)書(shū)籍，收集乳腺癌相關(guān)臨床診療數(shù)據(jù)，挖掘藥物配伍規(guī)律、核心藥物等關(guān)聯(lián)規(guī)則，得出中醫(yī)治療乳腺癌所使用藥物中置信度最高的為“乳香-沒(méi)藥”藥對(duì)。進(jìn)而對(duì)乳香-沒(méi)藥藥對(duì)展開(kāi)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接研究，進(jìn)一步明確乳香、沒(méi)藥活性成分及作用靶點(diǎn)，并分析其治療乳腺癌的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 中藥復(fù)方的收集

查閱《中華人民共和國(guó)藥典臨床用藥須知·中藥成方制劑卷》(中國(guó)醫(yī)藥科技出版社)、《腫瘤方劑大辭典》(中醫(yī)古籍出版社)、《腫瘤良方大全》(安徽科學(xué)技術(shù)出版社)、《腫瘤良方大全》(山西科學(xué)技術(shù)出版社)、《腫瘤治療名方驗(yàn)方》(人民衛(wèi)生出版社)，篩選出主治乳腺癌的臨床醫(yī)案，檢出乳腺癌內(nèi)服方共351首。

納入標(biāo)準(zhǔn)：所選方劑均為中醫(yī)藥治療乳巖(即乳腺癌)的臨床藥方，符合《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》[3]乳巖診斷；治療處方為中藥內(nèi)服制劑且有明確的藥物組成、劑量；文獻(xiàn)中認(rèn)定此方劑內(nèi)服之療效確切；治療方法以中藥為主。排除標(biāo)準(zhǔn)：中醫(yī)臨床診斷非乳巖的醫(yī)案；臨床癥狀及方藥記錄不全者；以針灸、貼敷等其他治法治療者。

運(yùn)用Apriori關(guān)聯(lián)規(guī)則算法挖掘藥對(duì)所有數(shù)據(jù)采用雙人原則錄入WPS Excel表格，并進(jìn)行篩選、規(guī)范化命名、核查等，例如將忍冬花、二花、雙花統(tǒng)一為金銀花，元胡、元胡索、延胡統(tǒng)一為延胡索，粉甘草、粉草統(tǒng)一為甘草等，建立目標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)。運(yùn)用SPSS Modeler軟件處理目標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的中藥，運(yùn)用Apriori關(guān)聯(lián)規(guī)則算法建立數(shù)據(jù)挖掘模型，得出置信度最高的藥對(duì)。

1.2 建立決策樹(shù)模型

決策樹(shù)算法是一種離散函數(shù)的逼近方法，通過(guò)歸類(lèi)來(lái)解決數(shù)據(jù)特征。經(jīng)數(shù)據(jù)預(yù)讀，選擇乳香作為因變量，其余頻次≥12的84個(gè)中藥作為自變量進(jìn)入決策樹(shù)模型的篩選過(guò)程，運(yùn)用SPSS Statistics 22.0軟件中的CHAID、CRT、QUEST決策樹(shù)方法進(jìn)行決策樹(shù)模型分析。

1.3 藥對(duì)中所含化學(xué)成分的收集與篩選

通過(guò)檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)檢索乳香、沒(méi)藥的化學(xué)成分，結(jié)合口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和藥物相似性(drug likeness，DL)≥0.18作為篩選條件，時(shí)間截止至2021年5月10日，篩選出活性成分較高的化合物并收集靶蛋白，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)作為補(bǔ)充。將上面收集到的靶蛋白在數(shù)據(jù)庫(kù)UniProt(https://www.uniprot.org/)中進(jìn)行校正，選擇物種為人，用靶蛋白的簡(jiǎn)寫(xiě)表示，建立藥物的靶點(diǎn)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.4 乳腺癌與藥對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)的收集

在人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)Genecards(https://www.genecards.org/)中以“breast cancer”為關(guān)鍵詞，檢索出乳腺癌的相關(guān)靶基因，并與藥對(duì)中活性成分靶基因進(jìn)行映射對(duì)比篩選出共同靶點(diǎn)，則為藥對(duì)活性成分治療乳腺癌的靶點(diǎn)。

1.5 “化合物-靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析

運(yùn)用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建乳香-沒(méi)藥“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行可視化分析。網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)(node)分別代表活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)基因；網(wǎng)絡(luò)中邊(edge)用來(lái)連接活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)基因；連接到網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)以度值(degree)為單位進(jìn)行表示。某節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)連接的邊數(shù)越多，則說(shuō)明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中扮演的角色越重要，度值也越大。

1.6 蛋白網(wǎng)絡(luò)互作構(gòu)建及拓?fù)浞治?/h3>

利用Cytoscape 3.7.1軟件中Bisogenet插件分別對(duì)乳香-沒(méi)藥與乳腺癌關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)互做分析(protein-protein interaction，PPI)，通過(guò)Merge功能取二者交集，再用CytoNCA插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)中所有點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)度值(degree)、接近中心性(closeness centrality，CC)和介度中心性(betweenness centrality，BC)進(jìn)行分析，借助網(wǎng)絡(luò)拓?fù)淅砟詈Y選網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，篩選標(biāo)準(zhǔn)為degree大于所有節(jié)點(diǎn)的2倍degree中位數(shù)，CC、BC大于所有節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)值的中位數(shù)。

1.7 GO功能富集和KEGG通路分析

將關(guān)鍵靶點(diǎn)上傳至David 6.8(database for annotation，visualization and integrated discovery)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/，Version 6.8)，以人類(lèi)為研究對(duì)象，進(jìn)行GO(gene ontology)分析以了解靶點(diǎn)主要的作用過(guò)程，主要包括生物過(guò)程(biological process，BP)，細(xì)胞組成(cellular component，CC)，分子功能(molecular function，MF)三方面，并且對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes，https://www.kegg.jp/)富集分析，并使用微生信在線繪制柱狀圖和氣泡圖。

1.8 分子對(duì)接驗(yàn)證

定義CytoNCA篩選后乳香-沒(méi)藥藥對(duì)和乳腺癌相關(guān)疾病的核心交集靶點(diǎn)為受體，篩選整理后的乳香-沒(méi)藥重要活性成分為配體。檢索RSCB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)并下載核心靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)，檢索并下載TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中乳香-沒(méi)藥活性成分的2D結(jié)構(gòu)，利用PyMOL 2.4.0軟件對(duì)乳腺癌靶蛋白進(jìn)行去水、加氫等預(yù)處理。應(yīng)用AutoDock Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接，最后運(yùn)用PyMOL、LigPlot+軟件對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行三維可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 藥物頻數(shù)分析

351首處方涉及中藥358味，用藥總頻次達(dá)4 298次，頻率越高藥物種類(lèi)越少，以6∶3∶1分成高頻藥(頻率>40%)、中頻藥(頻率10%～40%)、低頻藥(頻率<10%)，得出高頻藥1種，中頻藥29種，低頻藥328種，高、中頻藥詳見(jiàn)表1。

表1 治療乳腺癌高、中頻藥物頻次分布

2.2 運(yùn)用關(guān)聯(lián)規(guī)則獲取藥對(duì)

取358味中藥里頻數(shù)大于平均數(shù)12的84味中藥，運(yùn)用SPSS Modeler中的Apriori進(jìn)行建模，選取支持度>0.05，置信度>0.85，前項(xiàng)>18，進(jìn)行二項(xiàng)關(guān)聯(lián)分析(見(jiàn)圖1、表2)。其中，置信度最高的且關(guān)聯(lián)性強(qiáng)的藥對(duì)是乳香-沒(méi)藥，在文獻(xiàn)中有64個(gè)實(shí)例，置信度為96.364%，支持度為15.670%。在此次分析規(guī)則中，置信度較高的藥對(duì)，可作為臨床上治療乳腺癌的常用藥對(duì)。

圖1 關(guān)聯(lián)關(guān)系可視圖Fig.1 Visual graph of association relationship

表2 治療乳腺癌處方中藥物的關(guān)聯(lián)規(guī)則

2.3 決策樹(shù)模型分析

經(jīng)數(shù)據(jù)預(yù)讀，選擇乳香作為因變量，其余頻次≥12的84個(gè)中藥作為自變量進(jìn)入決策樹(shù)模型的篩選過(guò)程。采用SPSS Statistics 22.0軟件中的CHAID、CRT、QUEST決策樹(shù)方法進(jìn)行識(shí)別規(guī)律的挖掘，使用10倍交叉驗(yàn)證方法進(jìn)行模式驗(yàn)證，統(tǒng)一將父節(jié)點(diǎn)數(shù)設(shè)定為100，子節(jié)點(diǎn)為50。三種決策樹(shù)模型的最佳識(shí)別中藥均為沒(méi)藥，摘要見(jiàn)表3。

表3 CHAID、CRT、QUEST決策樹(shù)模型摘要

2.4 乳香-沒(méi)藥活性成分的篩選

在TCMSP中檢索乳香-沒(méi)藥所有成分?jǐn)?shù)據(jù)，設(shè)置口服生物利用度OB≥30%，藥物相似性DL≥0.18，同時(shí)篩去無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的成分，最終篩選出乳香8個(gè)主要活性成分，沒(méi)藥45個(gè)主要活性成分，見(jiàn)表4。

表4 乳香-沒(méi)藥的有效活性成分

續(xù)表4(Continued Tab.4)

2.5 “化合物-靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析

在TCMSP中以O(shè)B≥30%和DL≥0.18作為篩選條件，收集到乳香有效成分8個(gè)，沒(méi)藥有效成分45個(gè)，刪除重復(fù)并去除假陽(yáng)性，利用UniProt(http://www.uniprot.org)將蛋白質(zhì)名稱(chēng)轉(zhuǎn)換成Gene symbol，通過(guò)Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建乳香-沒(méi)藥“化合物-靶點(diǎn)”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖2)。

圖2 乳香-沒(méi)藥“化合物-靶點(diǎn)”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Visualization network diagram of “compound-target” of frankincense-myrrh 注：淺綠色為乳香；墨綠色為沒(méi)藥；粉色為基因靶點(diǎn)。Note:Light green is frankincense;Dark green is myrrh;Pink is the gene target.

2.6 蛋白網(wǎng)絡(luò)互作構(gòu)建及拓?fù)浞治?/h3>

利用GeneCards(http://www.genecards.org)收集乳腺癌靶點(diǎn)，通過(guò)多次截取參數(shù)Relevance score中位數(shù)法最終選取1 123個(gè)乳腺癌靶點(diǎn)。利用Cytoscape 3.7.1軟件中Bisogenet插件分別構(gòu)建藥物和疾病靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)，并取交集進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)互做分析，得到由5 633個(gè)節(jié)點(diǎn)和141 839個(gè)邊組成的網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖3)，再用CytoNCA插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，選取degree大于所有節(jié)點(diǎn)的2倍degree中位數(shù)，CC、BC大于所有節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)值的中位數(shù)，提取Hithubs網(wǎng)絡(luò)，得到1 459個(gè)節(jié)點(diǎn)和63 918個(gè)邊組成的網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖3)，再次使用截取中位數(shù)法篩選，最終構(gòu)建了1個(gè)具有81個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 524條邊的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖3)。這81個(gè)核心基因?yàn)樗幬锱c疾病中共同基因的核心部分，其中degree值評(píng)分較高的有酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-單加氧酶活化蛋白(YWHAE)、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREBBP)、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2(GRB2)、酪氨酸3-單氧合酶/色氨酸5-單氧合酶激活蛋白γ肽(YWHAG)、核內(nèi)不均一性核糖核蛋白K(HNRNPK)等，為后續(xù)進(jìn)行GO功能富集、KEGG通路分析以及分子對(duì)接奠定基礎(chǔ)。

圖3 蛋白網(wǎng)絡(luò)互作構(gòu)建及拓?fù)浞治鯢ig.3 Protein network interaction construction and topology analysis注：A有5 633個(gè)節(jié)點(diǎn)、141 839條邊；B有1 459個(gè)節(jié)點(diǎn)、63 918條邊；C有81個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 524條邊。Note:A contains 5 633 nodes and 141 839 edges;B contains 1 459 nodes and 63 918 edges;C contains 81 nodes and 1 524 edges.

2.7 GO功能富集分析

將“2.6”中81個(gè)核心基因利用DAVID平臺(tái)進(jìn)行GO功能富集分析，包括3個(gè)分支：BP、CC和MF。設(shè)定閾值P<0.05(見(jiàn)圖4)。BP分析可以看出這些靶點(diǎn)主要涉及positive regulation of transcription from RNA Pol-II、negative regulation of transcription from RNA Pol-II、transcription/DNA-template等248條生物過(guò)程。CC分析可以看出靶點(diǎn)主要涉及nucleus、nucleoplasm、cytoplasm等60條細(xì)胞組分。MF分析中可以看出，靶點(diǎn)主要涉及protein binding、poly(A) RNA binding、enzyme binding等94條分子功能。

圖4 乳香-沒(méi)藥活性成分治療乳腺癌靶點(diǎn)的GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of frankincense-myrrh active ingredients for breast cancer target

2.8 KEGG通路富集分析

利用DAVID平臺(tái)進(jìn)對(duì)81個(gè)核心基因進(jìn)行KEGG通路分析，設(shè)定閾值為P<0.05，得到39條KEGG通路富集，并繪制氣泡圖，結(jié)合表5和圖5，可知基因主要集中在病毒致癌作用(viral carcinogenesis)、癌癥的途徑(pathways in cancer)、PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、癌癥中的微小核糖核酸(microRNAs in cancer)等通路上。

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.5 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

表5 KEGG通路富集分析(前20條)

2.9 分子對(duì)接分析

在Cytoscape中使用cytoNCA插件對(duì)乳香、沒(méi)藥的有效成分進(jìn)行分析，根據(jù)degree結(jié)果得出評(píng)分較高的活性成分有沒(méi)藥中的3-甲氧基呋喃酮-9-烯-8酮、槲皮素和乳香中的乳香酸等。運(yùn)用PyMOL、AutoDock Vina等軟件對(duì)關(guān)鍵成分及主要靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接(見(jiàn)圖6)，同時(shí)對(duì)主要有效成分作用于CREBBP、GRB2、HNRNPK、YWHAE、YWHAG的結(jié)合能進(jìn)行了測(cè)定，一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)能量越低，發(fā)生的作用可能性越大。本研究中與GRB2結(jié)合能最低的化合物為Boswellic acid(結(jié)合能為-9.1 kcal/mol)，由此可見(jiàn)乳香-沒(méi)藥中的核心化學(xué)成分乳香酸與受體蛋白GRB2形成構(gòu)象能量低，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，結(jié)合活性較高。

圖6 乳香-沒(méi)藥活性成分與靶蛋白對(duì)接三維圖(結(jié)合能 ≥ -9.1 kcal/mol)Fig.6 Three dimensional docking diagram of the active component of frankincense-myrrh and target protein (binding energy ≥ -9.1 kcal/mol)注：A～F分別為GRB2與乳香酸、HNRNPK與乳香酸、YWHAE與乳香酸、YWHAE與槲皮素、YWHAG與乳香酸、YWHAG與槲皮素的分子對(duì)接圖。Note:A-F are the molecular docking diagrams of GRB2 and boswellic acid,HNRNPK and boswellic acid,YWHAE and boswellic acid,YWHAE and quercetin,YWHAG and boswellic acid,and YWHAG and quercetin,respectively.

表6 乳香-沒(méi)藥活性成分與靶點(diǎn)的結(jié)合能

3 討論與結(jié)論

通過(guò)Apriori關(guān)聯(lián)規(guī)則分析目標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)里的用藥規(guī)律，得到乳香與沒(méi)藥同時(shí)配伍治療乳腺癌置信度最高，置信度越高，沒(méi)藥與乳香配伍出現(xiàn)的可能性就越大。CHAID、CRT、QUEST是三種常用決策樹(shù)預(yù)測(cè)方法。CHAID默認(rèn)情況下使用多路拆分，使節(jié)點(diǎn)中的樣本大小變薄，從而導(dǎo)致樹(shù)的深度減少。CRT會(huì)執(zhí)行二進(jìn)制拆分(每個(gè)節(jié)點(diǎn)都拆分為兩個(gè)子節(jié)點(diǎn))。CHAID旨在與分類(lèi)/離散的目標(biāo)一起使用，CRT可以進(jìn)行回歸和分類(lèi)。與CART相比，CHAID中的拆分變量和拆分點(diǎn)選擇的混淆程度較小。QUEST節(jié)點(diǎn)可提供用于構(gòu)建決策樹(shù)的二元分類(lèi)法，此方法的設(shè)計(jì)目的是減少大型CRT決策樹(shù)分析所需的處理時(shí)間，同時(shí)減小分類(lèi)樹(shù)方法中常見(jiàn)的偏向類(lèi)別較多預(yù)測(cè)變量的趨勢(shì)。運(yùn)算過(guò)程比CRT更簡(jiǎn)單有效，三種方法優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。決策樹(shù)算法以乳香為因變量，CHAID、CRT、QUEST三種決策樹(shù)算法均篩選出沒(méi)藥與乳香的配伍可能性更大，表明乳香、沒(méi)藥這一活血化瘀藥對(duì)參與樹(shù)模型構(gòu)建組方意義較大。乳香最早記載于《明醫(yī)別錄》，性溫味淡，氣香而走竄，善理氣活血。沒(méi)藥最早記載于宋代的《開(kāi)寶本草》，性平，氣薄味苦，重在化瘀理血[4]，二者常相須為用，協(xié)同增效。

通過(guò)Cytoscape中的插件cytoNCA進(jìn)一步挖掘乳香與沒(méi)藥中53個(gè)活性成分，根據(jù)參數(shù)degree排名，結(jié)合臨床研究文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)3-甲氧基呋喃酮-9-烯-8-酮、乳香酸、槲皮素等成分發(fā)揮著重要的作用?，F(xiàn)代研究表明，乳香中最具特征性、研究最為深入的成分為乳香酸類(lèi)(例如乳香酸)成分，屬于五環(huán)三萜類(lèi)化合物，對(duì)腫瘤細(xì)胞有抗增殖、分化誘導(dǎo)和細(xì)胞凋亡等作用，特別是其中的乙酰乳香酸毒性低，是一個(gè)有前景的抗腫瘤藥物和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑[5]。呋喃酮類(lèi)也能在一定程度上能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性[6]。槲皮素是存在于多種水果與植物中的多酚類(lèi)物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、促凋亡等作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過(guò)抑制TLR-4/NF-κB信號(hào)通路，間接抑制炎性因子白介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子(TNF-α)的表達(dá)[8]。

對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，進(jìn)一步探究乳香-沒(méi)藥治療乳腺癌的作用機(jī)制，GO包含了基因參與的生物過(guò)程、所具有的細(xì)胞組分、發(fā)揮的分子功能三方面功能信息，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳香-沒(méi)藥可能通過(guò)參與RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正/負(fù)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄/DNA模板等248條生物過(guò)程，細(xì)胞核、核質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)等60條細(xì)胞組分，蛋白質(zhì)結(jié)合、聚(A)RNA結(jié)合、酶結(jié)合等94條分子反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路、Estrogen信號(hào)通路、MicroRNAs in cancer、MAPK信號(hào)通路、P53信號(hào)通路等發(fā)揮抗腫瘤作用。關(guān)鍵基因在乳香-沒(méi)藥治療乳腺癌中具有重要意義，利用Cytoscape中的cytoHubba插件篩選出degree值排名前十的核心基因，根據(jù)參考相關(guān)文獻(xiàn)和KEGG富集分析中的關(guān)鍵通路，篩選出2條有效作用通路MicroRNAs in cancer和MAPK信號(hào)通路，核心基因富集于這兩條通路的有CREBBP、GRB2、HNRNPK、YWHAE、YWHAG。MicroRNAs in cancer通路中MicroRNAs的異常表達(dá)與乳腺癌血管形成、腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲及腫瘤耐藥性等過(guò)程有密切的關(guān)系[9]，miRNAs可以用于乳腺癌的早期診斷指標(biāo)[10]，也有希望成為用于乳腺癌的有效治療藥物。研究證明，沒(méi)藥中的沒(méi)藥甾酮也可能通過(guò)調(diào)節(jié)miRNAs的表達(dá)進(jìn)而影響某些關(guān)鍵靶蛋白的活性從而起到抗瘤作用[11]。MAPK是細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的絲/蘇氨酸蛋白激酶，MAPK signaling pathway(絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路)參與細(xì)胞增殖、凋亡、自噬過(guò)程及調(diào)控耐藥相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)[12]，干預(yù)MAPK信號(hào)通路，可以提高腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性，從而逆轉(zhuǎn)耐藥[13]，有研究表明，沒(méi)藥中的β-欖香烯也具有很好的抗腫瘤療效，其對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的抗增殖作用是通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)[14]。YWHAE與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，主要在腫瘤細(xì)胞周期、生長(zhǎng)凋亡、擴(kuò)散遷移及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑發(fā)揮作用[15]。CREBBP作為轉(zhuǎn)錄輔激活因子可參與多種細(xì)胞功能，同時(shí)有抑制腫瘤的作用，其突變能夠?qū)е侣殉舶?、濾泡性淋巴癌及乳腺癌的發(fā)病率增加[16]。GRB2是一種在細(xì)胞中廣泛表達(dá)的銜接蛋白，其異常表達(dá)或活化與腫瘤的發(fā)生息息相關(guān)，研究表明，它可以作為抗腫瘤治療的分子靶點(diǎn)[17]，因此GRB2抑制劑也就成了抗腫瘤藥物的研發(fā)熱點(diǎn)。YWHAG為酪氨酸3-單氧合酶/色氨酸5-單氧合酶激活蛋白γ肽(14-3-3γ)，參與蛋白定位及運(yùn)輸、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡[18]。HNRNPK基因在細(xì)胞內(nèi)可分布于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核，能與不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的多種蛋白相互作用[19]，在腫瘤中參與調(diào)控多種癌基因及抑癌基因的表達(dá)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果的可靠性，利用分子對(duì)接技術(shù)將核心成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)分別進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，核心成分3-甲氧基呋喃鳥(niǎo)苷-9-烯-8-酮、乳香酸、槲皮素與靶點(diǎn)CREBBP、GRB2、HNRNPK、YWHAE、YWHAG的結(jié)合能均小于-5.0 kcal/mol，表明它們有較好的結(jié)合活性。其中乳香酸與GRB2的結(jié)合能為-9.1 kcal/mol，表明它們具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性，提示GRB2是乳香-沒(méi)藥可能發(fā)揮治療乳腺癌作用的重要靶點(diǎn)。

綜上，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-疾病”相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，從整體上分析乳香-沒(méi)藥成分、靶點(diǎn)、信號(hào)通路之間的相互作用關(guān)系，采用分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證了乳香、沒(méi)藥抗乳腺癌作用機(jī)制，推測(cè)了乳香、沒(méi)藥可能通過(guò)3-甲氧基呋喃鳥(niǎo)苷-9-烯-8-酮、乳香酸、槲皮素等成分協(xié)同作用于CREBBP、GRB2、HNRNPK、YWHAE、YWHAG等靶點(diǎn)，通過(guò)MicroRNAs in cancer通路、MAPK信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、凋亡、自噬過(guò)程及調(diào)控耐藥相關(guān)基因等，側(cè)面展示了乳香、沒(méi)藥通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮抗癌作用的機(jī)制，后續(xù)可對(duì)乳香-沒(méi)藥藥對(duì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)本文分子靶向?qū)犹摂M篩選研究的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，深入探討關(guān)鍵作用機(jī)制，為治療乳腺癌藥物的研發(fā)提供新的方向及依據(jù)。