BoBs技術(shù)在復(fù)雜先天性心臟病遺傳學(xué)檢測(cè)和病因研究中的應(yīng)用

樊若溪，王 瑜，謝明星，楊必成，朱寶生

(1.云南省第一人民醫(yī)院 兒科, 云南 昆明 650032； 2. 國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)西部?jī)?yōu)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南 昆明 650032；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院, 湖北 襄陽(yáng) 441000；4.華中科技大學(xué) 同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院, 湖北 武漢 430022)

0 引 言

先天性心臟病(Congenital Heart Disease, CHD, 先心病)是指胚胎發(fā)育時(shí)期心臟或大血管形成及發(fā)育異常所引起的心臟解剖結(jié)構(gòu)異常；或是胎兒期血液循環(huán)所特有的孔道在出生后未正常閉合，從而形成的先天性心血管畸形.復(fù)雜先天性心臟病是指患者存在一個(gè)以上的心血管病理解剖改變，或幾種心血管畸形同時(shí)存在.先心病復(fù)雜畸形種類(lèi)多，病因復(fù)雜，可單獨(dú)或以綜合征的形式發(fā)生，一般由胚胎發(fā)育環(huán)節(jié)的遺傳和環(huán)境因素單獨(dú)或互作所致[1-3].2011年中國(guó)出生缺陷兒童約占新生兒人數(shù)的5.6%，先心病約占其中的26.7%，每年新增患兒約13萬(wàn)例，圍產(chǎn)期發(fā)病率高達(dá)4.10‰，是最常見(jiàn)的出生缺陷和先天畸形[4-7].目前通過(guò)妊娠期超聲影像產(chǎn)前篩查能檢查出大多數(shù)先心病患兒[8-10]，早期診斷及干預(yù)能顯著改善患兒預(yù)后質(zhì)量[8, 11-12].然而，胎兒心臟發(fā)育形態(tài)差異變化大，超聲醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)水平、疾病復(fù)雜程度、孕周、胎兒體位等因素又都與產(chǎn)前先心病的檢出率和診斷準(zhǔn)確率密切相關(guān)[13]，因此，先心病的產(chǎn)前診斷存在一定程度的漏診和誤診.

染色體數(shù)量、結(jié)構(gòu)變異，基因拷貝數(shù)變異和基因突變等遺傳因素是先心病的重要致病原因[14-25].由染色體微缺失微重復(fù)所導(dǎo)致的臨床綜合征已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多達(dá)數(shù)十種[26-28]，與復(fù)雜先心病表型具有較高的相關(guān)性[29-30].據(jù)2015年《胎兒先天性心臟病診斷及圍產(chǎn)期管理專(zhuān)家共識(shí)》建議，對(duì)于先心病胎兒確診和具有胎兒先心病高危因素的孕婦，以及出生后確診的先心病患者，都有必要進(jìn)行相關(guān)可行的遺傳學(xué)檢測(cè)[8]，對(duì)于提高胎兒時(shí)期先心病產(chǎn)前診斷和干預(yù)質(zhì)量，提供高質(zhì)量臨床遺傳咨詢(xún)和臨床管理具有重要作用，為深入解析先心病的發(fā)病機(jī)制提供重要的臨床資料.

細(xì)菌人工染色體標(biāo)記微球列陣(BACs-on-BeadsTM，BoBs)[31]是近年來(lái)發(fā)展成熟的一項(xiàng)技術(shù)，該技術(shù)基于流式基因芯片技術(shù)平臺(tái)，將標(biāo)記樣品和參考DNA分別與固定有特定探針的熒光編碼微球進(jìn)行雜交，通過(guò)對(duì)兩者的熒光信號(hào)強(qiáng)度校正和比對(duì)，鑒定探針目標(biāo)區(qū)域的DNA拷貝數(shù)變化.2011年，美國(guó)Perkin Elmer公司推出產(chǎn)前BoBs(Prenatal BoBs)技術(shù)，可同時(shí)快速準(zhǔn)確檢測(cè)13、18、21、X和Y染色體的非整倍體以及9個(gè)微缺失綜合征區(qū)域的微重復(fù)和微缺失[32-35]，包括DiGeorge、Williams-Beuren、Prader-Willi/Angelman、Smith-Magenis、Wolf-Hirschhorn、Cri du Chat、Langer-Giedion及Miller Dieker綜合征，其中多種微缺失綜合征已經(jīng)報(bào)道能夠?qū)е禄蚝喜⑾刃牟〉陌l(fā)生[26-27].

本研究中，作者收集了不明原因的確診復(fù)雜先心病患者，使用產(chǎn)前BoBs技術(shù)進(jìn)行了遺傳學(xué)檢測(cè)，對(duì)患者病例樣本的遺傳學(xué)病因進(jìn)行了探討，擴(kuò)展了先天性心臟病遺傳學(xué)研究和病因探索的檢測(cè)模式.

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究收集了2014年4月-2018年11月間，經(jīng)超聲心動(dòng)圖臨床確診的復(fù)雜先心病胎兒病例樣本77例.其中由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院收治65例，由昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院收治12例.孕婦經(jīng)超聲診斷為胎兒嚴(yán)重心臟結(jié)構(gòu)異常，知情同意后自愿選擇引產(chǎn)或行羊水穿刺進(jìn)行產(chǎn)前診斷.孕婦年齡為21～43歲，平均(27.61±4.86)歲.

1.2 方 法

1.2.1 先天性心臟病胎兒診斷及標(biāo)本采集

入院孕婦在產(chǎn)前臨床超聲檢查中，經(jīng)超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果異常，確診胎兒為合并有多種畸形和復(fù)雜結(jié)構(gòu)的復(fù)雜先心病患者，醫(yī)院詳細(xì)記錄孕婦年齡、妊娠史、個(gè)人史、家族史及家族遺傳病史等信息，進(jìn)行資料分析和后續(xù)觀察.遵照父母意愿，選擇繼續(xù)妊娠者在知情同意的情況下行羊水穿刺，取羊水標(biāo)本并進(jìn)行產(chǎn)前診斷；選擇終止妊娠者，在知情同意的情況下引產(chǎn)胎兒并收集組織樣本進(jìn)行科學(xué)研究.

1.2.2 產(chǎn)前BoBs檢測(cè)

本檢測(cè)方法采用產(chǎn)前染色體非整倍體和微缺失檢測(cè)試劑盒，使用BoBs技術(shù)(Perkin Elmer公司，美國(guó))進(jìn)行分析，用于檢測(cè)人類(lèi)中高發(fā)的13、18、21、X和Y染色體的非整倍體以及9個(gè)微缺失綜合征區(qū)域的擴(kuò)增和缺失.該檢測(cè)針對(duì)13、18、21、X和Y染色體分別選擇5條獨(dú)立的BoBs探針；其他9個(gè)微缺失綜合征區(qū)域分別選擇4～8個(gè)探針用于檢測(cè)(見(jiàn)表1).

表1 產(chǎn)前BoBs檢測(cè)的覆蓋范圍

收集的羊水細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后，和引產(chǎn)組織分別使用DNA提取試劑盒提取基因組DNA；應(yīng)用微量紫外分光光度計(jì)(Nanodrop 2000)測(cè)定DNA 濃度，各樣本均以50～250ng(A260 波長(zhǎng)測(cè)量)作為上樣量，不同標(biāo)本類(lèi)型對(duì)于檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響.產(chǎn)前BoBs主要檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行：1)使用酶標(biāo)記的生物素化核苷酸，標(biāo)記待測(cè)樣品基因組DNA和參考DNA；2)使用PCR純化試劑盒對(duì)帶標(biāo)記的DNA進(jìn)行純化；3)將純化后的標(biāo)記DNA和BoBs混合物以單孔運(yùn)行雜交過(guò)夜；4)對(duì)雜交DNA后的微球進(jìn)行洗滌，轉(zhuǎn)到濾板上再次洗滌，之后將微球與報(bào)告分子進(jìn)行孵育，使報(bào)告分子與生物素化的標(biāo)記DNA相結(jié)合，再次洗滌微球，并重懸以進(jìn)行測(cè)定；5)采用Luminex200型流式熒光儀(美國(guó)Luminex公司)，通過(guò)熒光值測(cè)定結(jié)合到微球上DNA的相對(duì)含量，使用BoBsoft分析軟件(美國(guó)Perkin Elmer公司產(chǎn)品)計(jì)算樣本熒光檢測(cè)值與參考熒光檢測(cè)值的比值.

2 結(jié) 果

2.1 胎兒先天性心臟病病種類(lèi)型

本次研究的77例樣本經(jīng)過(guò)胎兒超聲心動(dòng)圖檢查診斷，均為結(jié)構(gòu)復(fù)雜或合并有多種畸形的復(fù)雜先心病病例.樣本中引產(chǎn)組織66例，胎兒羊水11例；男性病例45例，女性病例32例.

研究樣本經(jīng)胎兒超聲心動(dòng)圖檢測(cè)診斷，主要分類(lèi)位于前5位的胎兒先心病類(lèi)型依次是大面積缺損或復(fù)雜結(jié)構(gòu)的室間隔缺損(12例)，完全性心內(nèi)膜墊缺損(10例)，單心室(9例)，左室發(fā)育不良綜合征(8例)和法絡(luò)四聯(lián)癥(7例)，病種類(lèi)型見(jiàn)表2.

表2 77例先心病樣本病種類(lèi)型分布

2.2 染色體異常類(lèi)型

對(duì)本組全部77個(gè)樣本進(jìn)行產(chǎn)前BoBs檢測(cè)，全部檢測(cè)成功且結(jié)果可靠.其中檢出染色體異常的陽(yáng)性標(biāo)本17例，檢出率為22%；檢出13、18、21和性染色體數(shù)目異常11例，包括13三體綜合征1例，18三體綜合征5例，21三體綜合征3例，三倍體或46、 XX/46、 XY嵌合體2例(產(chǎn)前BoBs檢測(cè)無(wú)法區(qū)分此兩種類(lèi)型)；微缺失微重復(fù)綜合征包括Miller-Dieker綜合征合并Williams-Beuren綜合征1例，Langer-Giedion綜合2例，DiGeorge I型微缺失綜合征3例，詳見(jiàn)表3.

表3 77例先心病胎兒的產(chǎn)前BoBs檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

先天性心臟病是病因和病癥都極其復(fù)雜的出生缺陷，在研究先心病患者的遺傳背景時(shí)，應(yīng)綜合考慮染色體畸變，染色體微缺失微重復(fù)及基因?qū)用娴榷嗨揭蛩?本研究使用的樣本經(jīng)診斷均為結(jié)構(gòu)復(fù)雜或存在多種心臟結(jié)構(gòu)和血管異常的復(fù)雜畸形，而復(fù)雜表型可能與嚴(yán)重的遺傳變異具有較高的相關(guān)性.由于染色體畸變及微缺失微重復(fù)的變異更易累及更多基因功能片斷，造成多種畸形并存的復(fù)雜先心病，或伴隨系統(tǒng)性綜合征的嚴(yán)重后果.因此，相對(duì)于表型癥狀較輕的單一型先心病和其他出生缺陷，探索復(fù)雜先心病更需重點(diǎn)關(guān)注大片段DNA異常和染色體畸變等關(guān)鍵途徑.本研究在77例復(fù)雜先心病樣本中，快速準(zhǔn)確檢測(cè)出其中11例樣本具有染色體數(shù)目異常和6例染色體微缺失微重復(fù)綜合征，染色體異常比例高達(dá)22%.表明染色體畸變是導(dǎo)致復(fù)雜先心病的重要遺傳因素，對(duì)于其病因?qū)W的研究必須重點(diǎn)關(guān)注染色體水平異常.

染色體數(shù)目畸變是造成個(gè)體出現(xiàn)嚴(yán)重出生缺陷的重要因素.本研究檢測(cè)出11例染色體數(shù)目異常的樣本，其中1例13三體綜合征，先心病病癥確診為法洛四聯(lián)癥；5例18三體綜合征，先心病主要病癥以右室雙出口、室間隔缺損合并心外畸形為主；3例21三體綜合征，先心病病癥均診斷為完全型心內(nèi)膜墊缺損；2例三倍體或46、XX/46、XY嵌合體，先心病病癥表型以單心室合并主動(dòng)脈發(fā)育不良為主(詳見(jiàn)表3).

染色體微缺失在人群中總發(fā)生率約為1/2 000～1/200 000，是臨床先天畸形等出生缺陷的重要因素[36].本研究檢測(cè)出3例染色體微缺失綜合征均為21q11.2缺失導(dǎo)致的DiGeorge I型微缺失綜合征，其先心病分別確診為永存動(dòng)脈干合并室間隔缺損、肺動(dòng)脈閉鎖合并室間隔缺損和法絡(luò)四聯(lián)癥.染色體微重復(fù)的生物學(xué)效應(yīng)一般來(lái)說(shuō)相比微缺失較為緩和，然而在本研究中發(fā)現(xiàn)由3例染色體微重復(fù)則導(dǎo)致的復(fù)雜先心病的嚴(yán)重后果，其中1例為17p13重復(fù)和7q11重復(fù)導(dǎo)致的Miller-Dieker綜合征合并Williams-Beuren綜合征，先心病診斷為右室發(fā)育不良綜合征合并室間隔缺損；2例8q23-q24重復(fù)導(dǎo)致的Langer-Giedion綜合征，先心病表型分別為右室發(fā)育不良綜合征合并室間隔缺損，以及右室雙出口.

在常規(guī)的染色體檢測(cè)中，傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析技術(shù)在染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常的診斷中由于其準(zhǔn)確率高，實(shí)驗(yàn)室和設(shè)備要求不高，成本低廉，目前大量應(yīng)用于染色體水平的遺傳學(xué)檢測(cè)和產(chǎn)前診斷，也被認(rèn)作產(chǎn)前診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”.但染色體核型分析技術(shù)不能全方位覆蓋各種類(lèi)型的染色體缺陷，只能分辨大于10Mb的染色體片段，對(duì)大部分染色體微缺失微重復(fù)存在檢測(cè)難點(diǎn)和盲點(diǎn)[37].在實(shí)際應(yīng)用中，分析人員的經(jīng)驗(yàn)對(duì)分析結(jié)果準(zhǔn)確性的影響非常大，而培養(yǎng)細(xì)胞、制片與核型分析流程所需的時(shí)間較長(zhǎng)，一次檢測(cè)往往耗費(fèi)2～4周時(shí)間.對(duì)于先心病胎兒及患者的遺傳學(xué)檢測(cè)，仍然缺乏高效、高特異性的檢測(cè)研究手段.

對(duì)于表型復(fù)雜的先心病病例，使用產(chǎn)前BoBs的技術(shù)方法，在染色體水平上針對(duì)細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析所不能實(shí)現(xiàn)的染色體畸變高發(fā)區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)，從覆蓋層面、分辨率到檢驗(yàn)時(shí)間，都非常有效地彌補(bǔ)了細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析的不足，具有一定的臨床意義和科學(xué)研究?jī)r(jià)值.產(chǎn)前BoBs技術(shù)是高通量的檢測(cè)手段，特異性針對(duì)了人類(lèi)高發(fā)的13、18、21、X、Y染色體非整倍體和9個(gè)綜合征區(qū)域的微重復(fù)與微缺失，能夠在24h內(nèi)同時(shí)檢測(cè)92個(gè)樣本，結(jié)果判定清晰客觀，準(zhǔn)確度極高，是非?？煽康娜旧w非整倍體異常和微缺失微重復(fù)遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)，與細(xì)胞遺傳學(xué)染色體核型分析技術(shù)構(gòu)成非常好的互補(bǔ)關(guān)系，在產(chǎn)前診斷中已經(jīng)形成了“核型分析+BoBs”的臨床應(yīng)用模式[37].產(chǎn)前BoBs所特異性覆蓋的染色體區(qū)域與已報(bào)道的先心病高發(fā)區(qū)域具有較強(qiáng)的相關(guān)性，將此技術(shù)用于檢測(cè)和探索先心病的遺傳學(xué)病因，有望快速獲得更多可靠的遺傳診斷結(jié)果.本研究使用產(chǎn)前BoBs技術(shù)檢出的6例染色體微缺失微重復(fù)綜合征，如果僅依賴(lài)細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析技術(shù)是難以檢出的.證明將產(chǎn)前BoBs技術(shù)用于快速可靠的檢測(cè)和探索先心病的遺傳學(xué)病因，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值.

產(chǎn)前BoBs技術(shù)在其原理上也存在一些局限性.首先，產(chǎn)前BoBs技術(shù)的檢測(cè)不能覆蓋染色體的全部區(qū)域，只能針對(duì)設(shè)計(jì)的特定區(qū)域，而不能檢測(cè)染色體其他區(qū)域的拷貝數(shù)變異.其次，Bobs技術(shù)對(duì)于染色體平衡易位等結(jié)構(gòu)異常以及低比例的染色體嵌合體異常無(wú)法正常檢出和分辨[38].本研究中兩例病例通過(guò)產(chǎn)前BoBs技術(shù)檢測(cè)結(jié)果為“三倍體或46、 XX/46、 XY嵌合體”，即該技術(shù)能夠檢出該患者具有染色體異常，但無(wú)法區(qū)分和鑒定病例為三倍體還是46、 XX/46、 XY嵌合體；此外，對(duì)于性染色體三倍體XXX患者，BoBs技術(shù)會(huì)提示為“正常女性XX”，從而出現(xiàn)漏檢.以上有漏診可能的染色體平衡易位、低比例的染色體嵌合體異常和三倍體XXX，患者本身不一定引起明顯的臨床癥狀，但可能造成無(wú)法生育，或在生育時(shí)反復(fù)死胎、流產(chǎn)、產(chǎn)下染色體畸變患者或攜帶者等不良妊娠結(jié)果.因此，產(chǎn)前BoBs技術(shù)可作為復(fù)雜先心病遺傳學(xué)病因研究的快速檢測(cè)手段，或與核型分析互補(bǔ)組成更具優(yōu)勢(shì)的臨床應(yīng)用模式，但不宜作為產(chǎn)前診斷技術(shù)獨(dú)立應(yīng)用[37].

4 結(jié) 論

先天性心臟病是一類(lèi)病因復(fù)雜的疾病.對(duì)于結(jié)構(gòu)復(fù)雜或合并多種畸形的復(fù)雜先心病的遺傳學(xué)病因探索，從染色體水平入手進(jìn)行分析，有望高效獲得明確的檢測(cè)結(jié)果，為患者家庭提供指導(dǎo)和參考.產(chǎn)前BoBs技術(shù)作為一項(xiàng)高通量的檢測(cè)技術(shù)，特異性檢測(cè)了人類(lèi)高發(fā)的13、18、21、X、Y染色體非整倍體和9個(gè)綜合征區(qū)域的微重復(fù)與微缺失，使用簡(jiǎn)便，獲取結(jié)果快速準(zhǔn)確，對(duì)揭示先心病的遺傳學(xué)病因有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值.基于其設(shè)計(jì)原理，與傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析技術(shù)在檢測(cè)范圍和檢測(cè)內(nèi)容上形成有效互補(bǔ).在臨床應(yīng)用中，兩者結(jié)合共同應(yīng)用，可以有效地獲得更有價(jià)值的先天性心臟病染色體遺傳信息.