中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白對(duì)造影劑腎病的早期診斷價(jià)值

孫冬璇 楊挺 （北華大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林 吉林 132000）

隨著現(xiàn)代影像學(xué)和介入技術(shù)的不斷發(fā)展，造影劑在臨床的診斷和治療中得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。隨之而來(lái)的是由碘造影劑（IC）導(dǎo)致的一系列醫(yī)源性并發(fā)癥，造影劑腎病（CIN）就是其中之一〔1〕。目前臨床多依靠肌酐診斷CIN。但有研究證實(shí)，肌酐受年齡、性別、肌肉質(zhì)量、飲食、用藥、水化狀況等多種因素影響較大，且對(duì)于早期腎損傷缺乏敏感性及特異性，可能導(dǎo)致CIN 早期診斷困難，無(wú)法進(jìn)行早期干預(yù)，影響治療效果〔2〕。因此，探尋能夠早期診斷CIN 的標(biāo)志物對(duì)于臨床診斷及治療CIN 具有積極而重要的意義〔3，4〕。而有研究表明，中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（NGAL）可以反映腎小管損傷，對(duì)CIN 的早期診斷較血肌酐更有優(yōu)勢(shì)〔5〕。故本研究旨在動(dòng)態(tài)觀(guān)察大鼠CIN 模型中NGAL 在血清及腎臟組織中的表達(dá)，評(píng)價(jià)NGAL 在大鼠CIN 模型中對(duì)早期CIN 的診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)成年雄性SD 大鼠60 只，體重（200±16）g，由天津焱利華生物制品有限公司提供〔合格證號(hào):SCXK（津）2018-00028〕。

1.2 主要試劑 吲哚美辛購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；碘帕醇370 購(gòu)于上海博科萊信宜藥業(yè)；NGAL 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒、NGAL 抗體、二抗試劑盒均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大鼠預(yù)處理 將60 只大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各30 只，禁食水12 h 后，經(jīng)尾靜脈注射吲哚美辛10 mg/kg，15 min 后經(jīng)尾靜脈注射L-NAME 10 mg/kg。

1.3.2 制備大鼠 CIN 模型參考研究〔6～8〕的方法，在接受預(yù)處理后15 min，實(shí)驗(yàn)組大鼠尾靜脈注射碘帕醇370（3 gI/kg），建立CIN 大鼠模型；對(duì)照組處理方法同上，用生理鹽水替代碘帕醇370。

1.3.3 血肌酐及血NGAL 檢測(cè) 接受造影劑前及接受注射后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h 分別取兩組大鼠內(nèi)眥靜脈血，測(cè)定大鼠血肌酐及血NGAL 水平。

1.3.4 腎臟病理變化 分別于接受造影劑前和接受注射后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h，用麻醉劑過(guò)量（10%水合氯醛，0.5 ml/100 g）將兩組大鼠各處死4只，打開(kāi)腹腔經(jīng)腹主動(dòng)脈冰鹽水反復(fù)沖洗，取雙側(cè)腎臟，去包膜經(jīng)10%甲醛固定后石蠟包埋切片，用蘇木素-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)比觀(guān)察大鼠腎臟病理變化。

1.3.5 NGAL 免疫組化 常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水后，枸櫞酸抗原修復(fù)液抗原修復(fù)，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。在室溫下用10%羊血清封閉30 min 后，加入NGAL 抗體并于4℃冰箱過(guò)夜。次日，將孵育后的切片用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗。滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育30 min，PBS 緩沖液清洗后，進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色及蘇木素復(fù)染。對(duì)照組在相同條件下，用PBS 代替NGAL 抗體作陰性對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0 軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組血肌酐、血NGAL 水平比較 實(shí)驗(yàn)組大鼠血肌酐在接受造影劑后2 h、6 h 無(wú)明顯變化，在12 h、24 h 有輕度增高，在48 h 明顯升高，注射12 h后，實(shí)驗(yàn)組血肌酐水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。血NGAL 從接受造影劑后2 h 即開(kāi)始明顯升高，24 h達(dá)峰值，24 h 后呈下降趨勢(shì)（P＜0.05）。而對(duì)照組血NAGL 在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯變化（P＞0.05）。注射2 h后，實(shí)驗(yàn)組NGAL 水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表1、表2。

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)血肌酐水平比較(,n=3,mg/dl)

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)血肌酐水平比較(,n=3,mg/dl)

與同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較:1）P＜0.05；與同組注射后12 h 比較:2）P＜0.05；與同組注射后24 h 比較:3）P＜0.05

表2 各組各時(shí)間點(diǎn)血NGAL 水平比較(,n=3,pg/ml)

與同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較:1）P＜0.05；與同組接受造影劑前比較:2）P＜0.05；與同組注射后前一時(shí)點(diǎn)比較:3）P＜0.05

2.2 腎組織病理學(xué)改變 實(shí)驗(yàn)組在注射后2 h 即出現(xiàn)腎小管細(xì)胞腫大；注射后6 h，腎小管細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，部分小管結(jié)構(gòu)破壞；注射后12 h，腎小管細(xì)胞大量脫落，小管結(jié)構(gòu)破壞明顯；注射后24 h，腎小管細(xì)胞排列混亂，部分腎小管結(jié)構(gòu)恢復(fù)；注射后48 h，腎小管細(xì)胞部分脫落，小管結(jié)構(gòu)較前有所恢復(fù)。對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)腎臟未見(jiàn)明顯病理改變。見(jiàn)圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)腎臟病理改變(HE,×400)

2.3 NGAL 免疫組化 近端管狀細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)棕黃色著色即可說(shuō)明NGAL 表達(dá)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組注射后2 h 即可見(jiàn)棕黃色著色，隨后逐漸增多，24 h 達(dá)高峰，隨后呈下降趨勢(shì)。對(duì)照組未見(jiàn)明顯變化。見(jiàn)圖2。

圖2 實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)NGAL 表達(dá)(免疫組化,×400)

3 討論

隨著放射診斷及介入治療技術(shù)的發(fā)展，IC 的使用也日益增多，而由注射IC 導(dǎo)致的CIN 已成為院內(nèi)獲得性腎衰竭的第3 大原因，占總發(fā)病率的11%。而伴有慢性腎臟病、糖尿病、高血壓和心血管疾病等患者CIN 的發(fā)病率可達(dá)20%～50%〔9〕。CIN 患者多在接受造影劑后48～72 h 后，出現(xiàn)血肌酐升高，若血肌酐相對(duì)值升高25%或絕對(duì)值＞44.2 μmol/L（0.5 mg/dl），并除外其他可能的原因則可明確CIN的診斷〔6〕。多數(shù)CIN 患者腎功能在造影后7～10 d逐漸恢復(fù)正常，但也有20%～30%的患者出現(xiàn)不可逆的腎臟損害，導(dǎo)致慢性腎衰竭的發(fā)生。

目前CIN 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但有研究指出IC 引起的腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變及其對(duì)腎小管的毒性作用等都是CIN 發(fā)生的重要原因〔10～12〕。IC 導(dǎo)致的腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變以腎髓質(zhì)缺血缺氧為中心環(huán)節(jié)〔13，14〕。IC 可直接損傷腎血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起腎血流量減少。還可影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的分泌功能，導(dǎo)致收縮血管物質(zhì)（如:內(nèi)皮素、腺苷等）分泌增加，舒張血管物質(zhì)（如:前列腺素、一氧化氮等）分泌減少，引起腎血管過(guò)度收縮，間接導(dǎo)致腎髓質(zhì)的缺血缺氧〔15〕。另外，IC 對(duì)腎小管上皮細(xì)胞還具有直接毒性，可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞壞死、脫落〔16〕。

NGAL 是一條含有178 個(gè)氨基酸的多肽鏈〔17〕，屬脂質(zhì)運(yùn)載蛋白，主要表達(dá)于腎小管髓袢及遠(yuǎn)端小管〔18〕。腎臟功能正常時(shí)NGAL 經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)后，被近端小管重吸收。當(dāng)出現(xiàn)腎臟缺血缺氧或腎毒性損害時(shí)，腎小管迅速分泌大量NGAL，引起血液中NGAL 含量大幅升高〔19〕。且近端小管受損，其重吸收功能障礙，故尿液中NGAL 含量亦大幅升高。另外，NGAL 還具有分子量小、不易在體內(nèi)降解的特點(diǎn)〔20〕，故NGAL 易于采集，從血清或尿液中均可檢出。本研究結(jié)果說(shuō)明NGAL 在注射后2 h 即開(kāi)始升高，其指標(biāo)變化基本與腎臟病理改變同步，能比肌酐更早地反映出造影劑大鼠的腎臟損傷，對(duì)CIN 早期診斷具有臨床意義。