過表達(dá)HMGA1 影響動(dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和p38MAPK 信號(hào)通路

朱沈輝 酈俊 （長沙市第一醫(yī)院急診科,湖南 長沙 410005）

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是指主要發(fā)生在大中動(dòng)脈管腔內(nèi)的慢性炎癥及纖維增生性病變，是大部分心血管疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)，具有高的發(fā)病率、致殘率和死亡率的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人類的生命健康〔1，2〕。AS形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，其中炎癥、氧化應(yīng)激被認(rèn)為是AS 的核心發(fā)病機(jī)制〔3，4〕。有研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞損傷是導(dǎo)致AS 和高血壓的一個(gè)關(guān)鍵因素〔5〕。因此，抑制由氧化應(yīng)激引起的AS 血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷對(duì)于其治療具有重要意義。高遷移率族蛋白（HMG）A1 是一種非組蛋白性質(zhì)的染色體蛋白，參與包括DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和修復(fù)等多種重要的生理功能調(diào)控，其中對(duì)基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控尤為重要〔6〕。有研究表達(dá)，HMGA1 表達(dá)與糖尿病大血管病變形成有關(guān)〔7〕。此外，也有研究顯示，AS 斑塊中有HMGA1 蛋白存在，HMGA1 可通過調(diào)節(jié)CD44 參與AS 形成，是AS 病變發(fā)生發(fā)展過程的一個(gè)重要調(diào)節(jié)者〔8〕。目前關(guān)于HMGA1 對(duì)AS 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長影響尚未明確。本研究通過過表達(dá)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）HMGA1 表達(dá)，旨在探討HMGA1 表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs 增殖凋亡的影響，并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。

1 材料方法

1.1 試劑和儀器 HUVECs 購自美國ATCC。DMEM 培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素、胎牛血清（FBS）均購自美國Gibco；Lopofectamine 2000 購自美國Invitrogen；MTT、DMSO 及SB203580 均購自美國Sigma；HMGA1、p38MAPK、p-p38MAPK、Bcl-2 和Bax 抗體均購自美國CST；細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京凱基；酶標(biāo)儀購自美國Thermo；流式細(xì)胞儀購自美國BD。

1.2 研究對(duì)象 本研究所用AS 組織來源于長沙市第一醫(yī)院自2017 年1 月至2018 年1 月經(jīng)血管造影確診為AS 患者52 例，其中男28 例，女24 例，年齡51.9～78.2 歲，平均（67.1±11.1）歲。嚴(yán)格排除有糖尿病、心肌梗死病史及曾有心絞痛的AS 患者。上述AS 患者中的20 例，后期進(jìn)行心血管手術(shù)切除斑塊組織時(shí)，同時(shí)切除正常血管組織作為自身正常對(duì)照（對(duì)照組）。組織采集后做好標(biāo)記，即可放入液氮中保存。所有樣本的采集經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過，并簽署知情同意書。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) HUVECs 在DMEM 培養(yǎng)基中（含10% FBS 及青霉素和鏈霉素），于5% 體積分?jǐn)?shù)CO2、37℃及相對(duì)飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隔日換液，待細(xì)胞生長至融合時(shí)，按照實(shí)驗(yàn)需要傳代。實(shí)驗(yàn)為生長至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及處理 將生長至對(duì)數(shù)期的HUVECs細(xì)胞分為空白組、H2O2組、H2O2+NC 組和H2O2+HMGA1 組?？瞻捉M細(xì)胞不經(jīng)特殊處理。H2O2組使用0.5 mmol/L 的H2O2刺激細(xì)胞4 h。H2O2+NC 組和H2O2+si-HMGA1 組分別用0.5 mmol/L 的H2O2刺激細(xì)胞4 h，再分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 空載體及重組體pcDNA3.1-HMGA1 48 h。其中pcDNA3.1 的轉(zhuǎn)染參照Lopofectamine 2000 說明進(jìn)行操作。

1.5 Western 印跡 采用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。按照50 μg/孔等量上樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、電轉(zhuǎn)移聚偏氟乙烯（PVDF）膜及封閉膜后，加HMGA1、p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、p-p38MAPK、B 淋巴細(xì)胞瘤（Bcl）-2 和Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）抗體（稀釋比例1 ∶1000），4℃孵育過夜，次日，TBST 洗膜，加HRP 標(biāo)記的羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h，TBST 洗膜，電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色，顯影、定量。Quantity One 軟件進(jìn)行灰度值分析。蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH 灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 甲基噻唑基四唑（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞活力 以5×103個(gè)/孔接種HUVECs 細(xì)胞等量于96 孔板，按照1.4 分組處理細(xì)胞，處理結(jié)束后每孔中加入20 μl的MTT 溶液（5 mg/ml），培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄掉上清，加入150 μl/孔的二甲基亞砜（DMSO），搖床震蕩10 min，以使結(jié)晶能夠溶解充分。490 nm 波長下，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值（A）。以A 值衡量細(xì)胞的增殖活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 AnnexinV-FITC/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集按照1.3 分組處理后的細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，收集1×106個(gè)細(xì)胞。按照膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（AnnexinV-FITC/PI）雙染細(xì)胞凋亡試劑盒說明。預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞，然后用1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。分別加入5 μl 的AnnexinV-FITC和5 μl 的PI，避光孵育10 min，1 h 內(nèi)通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.8 制p38MAPK 信號(hào)對(duì)HUVECs 細(xì)胞活力和凋亡影響 使用5 mmol/L 的p38MAPK 信號(hào)通路抑制劑SB203580 處理HUVECs 細(xì)胞，細(xì)胞分為H2O2組、H2O2+SB203580 組和H2O2+SB203580+HMGA1組。通過MTT 法及流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)3 組細(xì)胞活力和凋亡率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 軟件進(jìn)行方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 AS 組織HMGA1 表達(dá) 以正常血管組織作為對(duì)照，AS 患者斑塊組織HMGA1 表達(dá)（0.481 ±0.052）明顯高于對(duì)照組（0.046±0.006，P＜0.05）。見圖1。

圖1 Western 印跡檢測(cè)AS 患者斑塊組織HMGA1 表達(dá)

2.2 HMGA1 在H2O2誘導(dǎo)的HUVECs 細(xì)胞表達(dá) 空白組、H2O2組、H2O2+NC 組和H2O2+HMGA1 組HMGA1 蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.711 ±0.058、0.053±0.006、0.074±0.009、0.335±0.026；F=271.396，P＜0.05）。與空白組比較，H2O2組和H2O2+NC 組HMGA1 表達(dá)明顯降低（P＜0.05），H2O2組和H2O2+NC 組間HMGA1 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與H2O2+NC 組比較，H2O2+HMGA1 組HMGA1 表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 Western 印跡檢測(cè)H2O2 誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞HMGA1 蛋白表達(dá)

2.3 HMGA1 表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs 細(xì)胞活力影響 空白組、H2O2組、H2O2+NC 組和H2O2+HMGA1 組A 值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.806 ±0.062、0.432±0.038、0.424±0.035、0.671±0.056；F=43.758，P＜0.05），H2O2可明顯降低HUVECs 細(xì)胞活力，而過表達(dá)HMGA1 后細(xì)胞活力明顯升高（P＜0.05）。

2.4 HMGA1 表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs 細(xì)胞凋亡影響 空白組、H2O2組、H2O2+NC 組和H2O2+HMGA1 組細(xì)胞凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔（2.47±0.34）%、（30.97 ± 1.65）%、（30.60 ±1.57）%、（15.77±1.01）%；F=284.271，P＜0.05〕。H2O2可明顯誘導(dǎo)HUVECs 細(xì)胞凋亡，而過表達(dá)HMGA1 后細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過表達(dá)HMGA1 后HUVECs 細(xì)胞凋亡率

2.5 HMGA1 表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs 細(xì)胞p38MAPK 信號(hào)通路影響 空白組、H2O2組、H2O2+NC 組和H2O2+HMGA1 組p38MAPK 蛋白表達(dá)分別為（0.682 ±0.058、0.662 ±0.054、0.691 ±0.059、0.690 ± 0.060），p-p38MAPK 蛋白表 達(dá)分別 為（0.023±0.005、0.134±0.015、0.148±0.016、0.078±0.010），Bcl-2 蛋白表達(dá)分別為（0.654 ±0.062、0.089±0.011、0.096±0.013、0.547±0.056），Bax 蛋白表達(dá)分別為（0.067±0.008、0.482±0.052、0.491±0.053、0.166±0.018），4 組的p-p38MAPK、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=64.691、145.152、96.147，均P＜0.05）而p38MAPK 蛋白表達(dá)整體比較差異不顯著（F=0.163，P＞0.05），見圖4。H2O2可明顯上調(diào)HUVECs 細(xì)胞p-p38MAPK 和Bax表達(dá)，下調(diào)Bcl-2，而過表達(dá)HMGA1 后p-p38MAPK和Bax 表達(dá)明顯降低，Bcl-2 表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。

圖4 Western 印跡檢測(cè)過表達(dá)HMGA1 后HUVECs 細(xì)胞p38MAPK、p-p38MAPK、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)

2.6 抑制p38MAPK 信號(hào)通路對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs 細(xì)胞活力和凋亡影響 H2O2組、H2O2+SB203580 組和H2O2+SB203580+HMGA1 組細(xì)胞A值（0.438±0.041、0.613±0.049、0.825±0.069），凋亡率〔（30.47±1.72）%、（17.03±1.21）%、（6.90±0.72）%〕 差異均 有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義（F=38.223、236.164，均P＜0.05），見圖5。與H2O2組比較，H2O2+SB203580 組細(xì)胞活力明顯升高，凋亡率降低（P＜0.05），與H2O2+SB203580 組比較，H2O2+SB203580+HMGA1 組細(xì)胞活力明顯升高，凋亡率降低（P＜0.05）。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常與AS 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是AS 一系列改變的始動(dòng)者〔9〕。活性氧是導(dǎo)致內(nèi)皮損傷的一個(gè)主要因素〔10〕。H2O2是機(jī)體產(chǎn)生的活性氧，可通過對(duì)生物膜中多不飽和脂肪酸過氧化引起細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致AS 形成，并加重動(dòng)脈狹窄及增加血管支架成型術(shù)后再狹窄發(fā)生率〔11〕。目前多項(xiàng)研究實(shí)現(xiàn)，H2O2可引起細(xì)胞內(nèi)皮損傷、凋亡〔12〕。本研究也使用H2O2為處理因素建立血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型。HMG 家族在高等真核生物細(xì)胞核中廣泛分布，廣泛的參與多種重要的核內(nèi)生物學(xué)功能調(diào)節(jié)，HMGA1 基因定位于人類第6 號(hào)染色體，其表達(dá)水平高低與多種腫瘤惡性程度密切相關(guān)〔13，14〕。最近的研究表明，HMGA1 表達(dá)減少被證實(shí)與2 型糖尿病發(fā)生及胰島素抵抗有關(guān)〔15〕。HMGA1 突變可增加胰島素抵抗及代謝性綜合征的風(fēng)險(xiǎn)，而糖尿病是導(dǎo)致AS 的重要危險(xiǎn)因素之一〔16〕。HMGA1 在AS 中研究較少，已有研究表明，AS 中HMGA1 呈現(xiàn)陽性表達(dá)〔8〕。本研究通過H2O2刺激HUVECs 細(xì)胞，檢測(cè)HMGA1 過表達(dá)對(duì)細(xì)胞活力和凋亡影響，結(jié)果顯示，HMGA1 可明顯降低H2O2對(duì)HUVECs 細(xì)胞生長抑制和凋亡促進(jìn)作用。提示HMGA1 對(duì)AS 具有保護(hù)作用。MAPKs 級(jí)聯(lián)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方式之一，在哺乳動(dòng)物中廣泛存在，可將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)，從而引起細(xì)胞增殖、凋亡、分化等生物學(xué)改變，對(duì)多種心血管疾病進(jìn)展均發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用〔17，18〕。p38MAPK 是MAPKs 超家族成員之一，有研究表明，AS 形成過程與p38MAPK 信號(hào)激活存在密切關(guān)系，p38MAPK 信號(hào)通路的激活可促進(jìn)VSMCs 增殖信號(hào)傳入細(xì)胞核，使其從中膜浸入內(nèi)膜，并發(fā)生增殖，從而促進(jìn)AS 的形成〔19，20〕。有研究顯示，使用p38MAPK 抑制劑SB203580 干預(yù)HUVECs 細(xì)胞，可明顯降低細(xì)胞凋亡率，上調(diào)Bcl-2 及下調(diào)Bax 表達(dá)〔21，22〕。Bcl-2 家族成員與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，Bcl-2 和Bax 分別為Bcl-2 家族的抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白，其比例可決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。Bcl-2 表達(dá)升高，Bax 表達(dá)降低，可抑制細(xì)胞凋亡〔23，24〕。本研究結(jié)果提示HMGA1 可能通過抑制p38MAPK 信號(hào)對(duì)VSMCs 細(xì)胞損傷起保護(hù)作用。進(jìn)一步研究表明，SB203580 可降低VSMCs 細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，并增加HMGA1 對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。說明HMGA1 可通過抑制p38MAPK 信號(hào)影響VSMCs 細(xì)胞生長。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HMGA1 在AS 斑塊組織高表達(dá)，HMGA1 可通過抑制p38MAPK 信號(hào)降低H2O2誘導(dǎo)的VSMCs 細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞增殖。提示HMGA1 可能是AS 治療的有效靶點(diǎn)之一。