類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清細(xì)胞因子檢測(cè)與CD100 的相關(guān)性

周進(jìn) 袁錕 劉巍 范建波 王雯雯 虞子良 周小鋼 徐大偉

（南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院 南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院南通臨床醫(yī)學(xué)院 1 骨科,江蘇 南通 226001;2 風(fēng)濕免疫科）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是自身免疫類疾病，發(fā)病率為0.32%～0.36%，發(fā)病率及致殘率均較高〔1，2〕。中國目前有（400～500）萬人患有類風(fēng)濕疾病，主要發(fā)病有關(guān)節(jié)表現(xiàn)和關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，關(guān)節(jié)表現(xiàn)以手關(guān)節(jié)為主，近端指間關(guān)節(jié)、掌指關(guān)節(jié)、腕關(guān)節(jié)有關(guān)節(jié)疼痛、腫脹，關(guān)節(jié)功能受限，關(guān)節(jié)變形及末端關(guān)節(jié)嚴(yán)重骨質(zhì)疏松〔3〕；關(guān)節(jié)外表現(xiàn)包括眼部結(jié)膜炎、干眼癥及肺間質(zhì)病變，腎臟壓迫，心臟壓迫及消化道壓迫，外周神經(jīng)壓迫等關(guān)節(jié)肌肉表現(xiàn)，所以是全身性、多器官、多系統(tǒng)病變，致殘率較高，病程反復(fù)，但最終會(huì)造成小關(guān)節(jié)變形，提前干預(yù)對(duì)于治療RA 至關(guān)重要〔4〕。

RA 的發(fā)病機(jī)制與免疫細(xì)胞有關(guān)（T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等），這類細(xì)胞在血液循環(huán)過程中，聚集到關(guān)節(jié)內(nèi)從而激發(fā)炎癥。在RA 形成過程中起重要作用是異常增殖的炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)相互作用。研究表明，RA 患者初期關(guān)節(jié)囊滑膜成纖維細(xì)胞層下血管網(wǎng)已出現(xiàn)血管增生現(xiàn)象〔5〕。這種血管的異常增生為RA 病程的發(fā)展提供至關(guān)重要的微環(huán)境基礎(chǔ)。新生血管網(wǎng)密度增加，形成血管翳〔6〕。密集的血管網(wǎng)為各種類型的免疫細(xì)胞到達(dá)關(guān)節(jié)腔提供了物理空間上的道路，關(guān)節(jié)囊內(nèi)細(xì)胞表面表達(dá)的自身抗原又為吸引各種免疫細(xì)胞提供了化學(xué)成分上的引誘。從理論上講，治療RA 的關(guān)鍵在于兩個(gè)通路，一是提前干預(yù)，阻止血管翳的形成；二是中和抗體，阻斷免疫細(xì)胞趨化而來〔7〕。

分化抗原簇100（CD）100 在免疫細(xì)胞活化及免疫應(yīng)答方面發(fā)揮了重要作用，被稱為軸突導(dǎo)向因子（Sema）4D，有兩種存在形式，一種以Ⅰ型跨膜蛋白存在于細(xì)胞膜表面，被稱為膜結(jié)合型CD100（mCD100），另一種是可溶型CD100（sCD100）游離于血清中〔8，9〕。CD100 結(jié)合CD72 可能會(huì)對(duì)B 淋巴細(xì)胞起到負(fù)調(diào)控作用，參與RA 的發(fā)病，抑制T 細(xì)胞來源的CD100 的功能或?qū)⒊蔀榉浅Ｓ星熬暗闹委烺A 的方法。本文擬分析RA 患者血清細(xì)胞因子檢測(cè)與CD100 的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2019 年9 月1 日至2020 年6 月1日南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治58 例RA 患者，包括活動(dòng)期RA 患者26 例，穩(wěn)定期RA 患者32 例，年齡60～72 歲，平均62.7 歲，男30 例，女28 例。體檢中心行常規(guī)體檢26 例為對(duì)照組，其中男12 例，女14 例，年齡61～70 歲，平均63.2 歲。符合《2018 中國類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診療指南》中活動(dòng)期RA 診斷標(biāo)準(zhǔn):晨僵（≥45 min）、滑膜炎憑證、典型放射學(xué)RA 骨破壞變化，出現(xiàn)1 個(gè)及以上關(guān)節(jié)腫痛，且排除其他疾病所致關(guān)節(jié)炎，紅細(xì)胞沉降率（ESR）≥40 mm/h、C 反應(yīng)蛋白（CRP）＞15 mg/L。若部分標(biāo)準(zhǔn)欠缺，評(píng)分可用美國風(fēng)濕學(xué)會(huì)（ACR）/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）2009 系統(tǒng)，總分≥6 分確診RA；RA 患者病情活動(dòng)度的評(píng)估:DAS28=〔0.56×sqrt（T28）+0.28×sqrt（SW28）+0.7×Ln（ESR）〕×1.08+0.16，數(shù)值范圍為0～10。所有病例無尿蛋白、周圍神經(jīng)病變、生物制劑應(yīng)用史、藥物過敏史、肺間質(zhì)纖維化等其他影響因素，所有人群精神認(rèn)知正常，試驗(yàn)前簽署知情同意。

1.2 主要試劑 淋巴細(xì)胞分離液（北京索萊寶公司）；R&D 公司重組人CD100；美天旎CD8+T 細(xì)胞分選試劑盒；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GMCSF）、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-17 試劑盒（美國RB 公司）；武漢華美公司CD100、干擾素（IFN）-γ 和腫瘤壞死因子（TNF）-α 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒；美國BD 公司的抗CD3-APC、抗CD8-APC Cy7、抗CD100-PE 試劑盒；抗CD3/CD28（美國eBioscience 公司）；Abcam 穿孔素、顆粒酶B 酶聯(lián)吸附斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISPOT）檢測(cè)試劑盒。

1.3 主要儀器 M680 型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司）、SORVALL 高速低溫離心機(jī)（美國Kendor 公司）；FACS-Calibur 流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）；ELISPOT 讀板儀（德國AID 公司）；磁力分離架（德國美天旎公司）。

1.4 血清的收集與保存 采集RA 患者和對(duì)照組靜脈血15 ml，保存于促凝管。2 h 內(nèi)，4 000 r/min離心10 min，收集上層血清，置于1.5 ml 離心管中，編號(hào)。-80℃冰箱備檢、保藏。

1.5 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）分離:選取淋巴細(xì)胞分離液、密度梯度離心法分離PBMCs。取5 ml 樣品，等體積無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋混勻、取5 ml 淋巴細(xì)胞上清分離液。20℃，3 000 r/min 離心25 min。吸取白膜層，收集PBMC。

CD8+T 細(xì)胞分選:用試劑盒進(jìn)行分選，取1×107個(gè)PBMCs，3 000 r/min 離心15 min 棄上清，重懸細(xì)胞（40 μl 緩沖液），加生物素（10 μl）標(biāo)記的抗體，混勻、4℃孵化5 min，加入緩沖液（30 μl），加20 μl CD8+T 細(xì)胞微球抗體（包含抗CD14、抗CD61、抗生物素），混勻，4℃孵育10 min。通過分離柱的未標(biāo)記細(xì)胞，為富集的CD8+T 細(xì)胞。

1.6 構(gòu)建直接接觸培養(yǎng)、間接接觸培養(yǎng)系統(tǒng) 按照王新偉等〔10〕的方法建立，HLA-A2 限制性RA 患者的CD8+T 細(xì)胞和HepG 細(xì)胞直接接觸和間接接觸培養(yǎng)系統(tǒng)。

1.7 細(xì)胞因子檢測(cè) 取GM-CSF、IL-6、IL-17 和TNF-α 試劑盒，嚴(yán)格按照說明書操作。采用ELISA，應(yīng)用Bio-RAD 酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm 處吸光度值，并換算成濃度值。

1.8 CD100 和細(xì)胞因子表達(dá)檢測(cè) 血漿/培養(yǎng)上清細(xì)胞因子:酶標(biāo)抗體工作液進(jìn)行稀釋，洗滌液稀釋。標(biāo)注標(biāo)準(zhǔn)品曲線，設(shè)立空白對(duì)照、選擇陰性對(duì)照，將100 μl 標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本加入反應(yīng)孔中，封口。37℃，90 min 孵 育，吸 樣，加入洗 滌緩沖 液（250 μl/孔），吸出前浸泡1 min，吸干，洗滌5 次。加入生物素標(biāo)記的二抗（100 μl/孔），封死，37℃孵育60 min，洗板5 次，加ABC 工作液（100 μl/孔），封孔，37℃孵育30 min，洗板5 次，加入TMB 顯色工作液（100 μl/孔），37℃避光反應(yīng)，出現(xiàn)藍(lán)色梯度（標(biāo)準(zhǔn)品3～4 孔）、且有后3～4 孔差別不明顯，加入終止液100 μl TMB 每孔，30 min 顯色反應(yīng)。計(jì)算酶標(biāo)儀測(cè)定OD 450 nm 波長處吸光度細(xì)胞因子濃度。

1.9 CD8+T 細(xì)胞MFI 檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀，將PBMCs 轉(zhuǎn)入FACS 管中，1 000 r/min 離心5 min。PBS 洗滌2 次，加入滴加流式抗體稀釋液80 μl（抗CD3-APC、抗CD8-APCCy7、抗CD100-PE），加1 μl流式抗體，重懸，4℃避光孵育30 min，PBS 洗滌2次，2%多聚甲醛溶液固定，上機(jī)檢測(cè)分析結(jié)果。

1.10 顆粒酶B、CD8+T 細(xì)胞分泌穿孔素水平檢測(cè) 取PBS（100 μl/孔）至聚偏氟乙烯（PVDF）平板，室溫孵育10 min，吸凈液體，加入CD8+T 細(xì)胞（5×104個(gè)/孔），加抗CD3/CD28（終濃度1 μg/ml），設(shè)立陰性對(duì)照（無刺激源），37℃、5% CO2培養(yǎng)20 h，吸凈液體，加0.1%吐溫20 的PBS（100 μl/孔），4℃孵育10 min，并洗滌3 次。采用1% BSA 的PBS（10 ml）稀釋檢測(cè)抗體，稀釋檢測(cè)抗體，加入孔中（100 μl/孔），25℃孵育1.5 h，PBS 洗滌3 次，含0.1%吐溫20。稀釋的鏈霉親和素堿性磷酸酶（100 μl/孔），倍數(shù)為1 ∶5 000。室溫孵育1 h，洗滌3 次，吸凈殘留液，加入BCIP/NBT 顯色底物，5～15 min（100 μl/孔）后，顯色細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)，采用ELISPOT 讀板儀。SFC=樣本SFC-陰性對(duì)照SFC，分析斑點(diǎn)形成數(shù)SFC。CD8+T 細(xì)胞受HLA-A02 限制，用sCD100 刺激24 h。清洗CD8+T 細(xì)胞兩次，直接接觸方式與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）共培養(yǎng)，或間接接觸的方式。48 h 培養(yǎng)，收獲上清液。直接接觸共培養(yǎng):HUVECs 的死亡是通過CD8+T 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子來介導(dǎo)的穿孔素和顆粒酶途徑。以間接接觸共培養(yǎng)的方式，HUVECs 的死亡僅由CD8+T 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，不需要細(xì)胞直接接觸〔9〕。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0、Origin9.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)、配對(duì)t檢驗(yàn)及Wilcoxon 配對(duì)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CRP、ESR 水平、DAS28 檢測(cè) 活動(dòng)期RA 組CRP、ESR、DAS28 水平顯著高于穩(wěn)定期RA 組、對(duì)照組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組年齡、CRP、ESR 和DAS28 比較〔〕

表1 各組年齡、CRP、ESR 和DAS28 比較〔〕

與活動(dòng)期RA 組比較:1）P＜0.05

2.2 各組細(xì)胞因子水平檢測(cè) 與穩(wěn)定期RA 組和對(duì)照組相比，活動(dòng)期RA 組血清GM-CSF、IL-6、TNF-α水平均較高（P＜0.01 ）；穩(wěn)定期RA 組血清中GM-CSF、IL-6 和TNF-α 水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），3 組IL-17 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組血清GM-CSF、IL-6、IL-17 和TNF-α 水平比較(,pg/ml)

表2 各組血清GM-CSF、IL-6、IL-17 和TNF-α 水平比較(,pg/ml)

與對(duì)照組比較:1）P＜0.05，2）P＜0.01；與穩(wěn)定期RA 組比較:3）P＜0.01

2.3 RA 患者血漿sCD100、IgA 水平檢測(cè) 對(duì)照組血漿sCD100 水平為（5.73±1.36）ng/ml，活動(dòng)期RA組為（7.05±1.77）ng/ml，較RA 組顯著升高（P=0.002 6），穩(wěn)定期RA 組為（6.01±0.95）ng/ml，較對(duì)照組顯著升高（P=0.047）。對(duì)照組血清IgA 水平〔（2.19±0.83）g/L〕低于活動(dòng)期RA 組〔（3.40±1.50）g/L〕、穩(wěn)定期RA 組〔（2.68±1.14）g/L〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.033、0.041）。血清sCD100 水平與IgA 水平呈正相關(guān)（R2=0.542 2，P＜0.001），見圖1。

圖1 RA 患者sCD100 水平與IgA 水平的相關(guān)性

2.4 外周血CD8+T 細(xì)胞CD100 的MFI 值檢測(cè) 與對(duì)照組相比，活動(dòng)期RA 組外周血CD100+CD4+T淋巴細(xì)胞表面100 的MFI 值明顯降低（P＜0.05），穩(wěn)定期RA 組MFI 值明顯高于活動(dòng)期RA 組（P＜0.05）。3 組外周血CD100+CD15+粒細(xì)胞、CD100+CD8+T 淋巴細(xì)胞、CD100+CD19+B 淋巴細(xì)胞、CD100+CD14+單核細(xì)胞表面CD100 的MFI 值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 外周血各細(xì)胞亞群胞膜表面CD100 的MFI 值()

表3 外周血各細(xì)胞亞群胞膜表面CD100 的MFI 值()

與對(duì)照組比較:1）P＜0.05；與穩(wěn)定期RA 組比較:2）P＜0.05

2.5 sCD100 刺激RA 患者CD8+T 細(xì)胞水平檢測(cè) 重組人sCD100 刺激24 h，從健康對(duì)照組和RA 患者中純化CD8+T 細(xì)胞。RA 患者T 細(xì)胞與對(duì)照組比較，CD100 刺激后CD8+T 細(xì)胞上清液中IFN-γ 和TNF-α 水平顯著升高（P＜0.01）。此外，CD8+T 細(xì)胞與對(duì)照組穿孔素和顆粒酶B 的水平相比，sCD100 刺激后產(chǎn)生增加（P＜0.01）。見表4。RA 患者與對(duì)照組相比，sCD100 刺激的CD8+T 細(xì)胞誘導(dǎo)靶細(xì)胞HUVECs 死亡率顯著高于無sCD100 刺激的對(duì)照組（P＜0.05）。在間接接觸共培養(yǎng)的方式下，sCD100刺激RA 組與對(duì)照組時(shí)，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的HUVECs死亡無顯著差異（P＞0.05）。與直接接觸和間接接觸共培養(yǎng)方式的對(duì)照組相比，RA 組培養(yǎng)的上清液中IFN-γ 和TNF-α 水平顯著升高（P＜0.05）。CD8+T 細(xì)胞在RA 組和間接接觸共培養(yǎng)的對(duì)照組的刺激中，分泌IFN-γ 和TNF-α 也顯著增加（P＜0.05），見表5～7。

表4 重組人CD100 刺激CD8+T 細(xì)胞、TNF-α、INF-γ、穿孔素檢測(cè)及顆粒酶B 檢測(cè)()

表4 重組人CD100 刺激CD8+T 細(xì)胞、TNF-α、INF-γ、穿孔素檢測(cè)及顆粒酶B 檢測(cè)()

表5 不同培養(yǎng)方式靶細(xì)胞死亡率檢測(cè)(,%)

表5 不同培養(yǎng)方式靶細(xì)胞死亡率檢測(cè)(,%)

表6 不同培養(yǎng)方式IFN-γ 檢測(cè)(,pg/ml)

表6 不同培養(yǎng)方式IFN-γ 檢測(cè)(,pg/ml)

表7 不同培養(yǎng)方式TNF-α 檢測(cè)(,pg/ml)

表7 不同培養(yǎng)方式TNF-α 檢測(cè)(,pg/ml)

3 討論

本研究結(jié)果表明，細(xì)胞因子誘導(dǎo)RA 患者發(fā)生關(guān)節(jié)滑膜炎，RA 的活動(dòng)度可借助GM-CSF、IL-6 及TNF-α 的水平進(jìn)行判斷；GM-CSF 參與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，與血清IL-6 和TNF-α 的水平呈正相關(guān)。

CD100 以軸突誘導(dǎo)因子方式，定向誘導(dǎo)軸突生長錐的生長。CD100 廣泛表達(dá)于靜息狀態(tài)下的B細(xì)胞、激活的T 細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等。CD100 有固定在細(xì)胞表面的膜蛋白和可溶性CD100，只存在于病理狀態(tài)下，如炎癥和腫瘤。

RA 患者外周sCD100 上調(diào)，調(diào)節(jié)下調(diào)CD8+T 細(xì)胞上的mCD100，導(dǎo)致CD8+T 細(xì)胞的細(xì)胞毒性升高。重要的是，sCD100 刺激促進(jìn)了CD8+T 細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性使靶細(xì)胞的直接細(xì)胞毒性升高。CD100 發(fā)揮重要的 生物學(xué)活性，是免疫 調(diào)控分 子〔12〕。mCD100 脫落，逐漸形成細(xì)胞亞群CD8-CD100-T 細(xì)胞，用于控制病毒感染〔13〕。感染后的免疫應(yīng)答可以檢測(cè)到CD100 的作用，增強(qiáng)B 細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及CD8+T 細(xì)胞功能，加快病毒清除〔14，15〕。

RA 患者體內(nèi)存在多種免疫分子表達(dá)。血清sCD100 表達(dá)水平在RA 患者中降低，水平升高是T細(xì)胞表面mCD100。機(jī)體免疫個(gè)體的差異，導(dǎo)致表達(dá)模式變化，降低的CD8+T 細(xì)胞表面mCD100 水平可能與mCD100 脫落有關(guān)〔16～18〕；穩(wěn)定期RA 患者血漿sCD100 水平下降，CD8+T 細(xì)胞表面mCD100 水平升高。

由于CD8+T 細(xì)胞存在CD100 的受體CD72，RA患者的CD8+T 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子增加，但殺傷靶細(xì)胞不足，可發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。CD8+T 細(xì)胞功能難以保持，是受sCD100 表達(dá)減少影響，發(fā)生功能障礙。單核細(xì)胞、T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等的表面表達(dá)mCD100。mCD100 脫落，sCD100 表達(dá)。CD100 在其他免疫細(xì)胞中的調(diào)控作用有待進(jìn)一步研究。RA 的癥狀是由兩條通路，兩條通路的交匯點(diǎn)CD100 具有重要病理學(xué)價(jià)值，所以將CD100 作為治療的分子靶標(biāo)，有很大可能減弱RA 的癥狀。

總之，改變mCD100 和sCD100 表達(dá)模式變化，以CD100 作為治療靶點(diǎn)，極有可能會(huì)大大減輕RA的癥狀，副作用也會(huì)較小，為未來治療RA 提供了有力的理論和實(shí)踐支撐。