溫和灸對(duì)小鼠腹腔銅綠假單胞菌生物被膜感染的影響※

景 政,劉曉嵐,唐 妮,劉曉慶,荊雪寧,孔晉亮,宋志軍,吳 紅

(1.山東中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校,山東 煙臺(tái) 264199;2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530021;3.丹麥西南日德蘭醫(yī)院,丹麥 埃斯比約 D K-6700;4.丹麥國(guó)家醫(yī)院,丹麥 哥本哈根 D K-2100)

銅綠假單胞菌是最常見(jiàn)的細(xì)菌生物被膜(BF)感染致病菌,也是臨床上最常見(jiàn)的條件致病菌之一。臨床上銅綠假單胞菌BF相關(guān)感染發(fā)生率高,而且極難根治。BF是細(xì)菌黏附于活性或惰性物體表面形成的高密度細(xì)菌團(tuán)塊,并由自身產(chǎn)生的黏性胞外基質(zhì)包裹著的具有三維立體結(jié)構(gòu)的生物群體[1-2]。大量實(shí)驗(yàn)表明,艾灸能抑制炎性反應(yīng),促使炎癥消散及破損病灶恢復(fù),并且能顯著調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能[2-8]。本實(shí)驗(yàn)探討溫和灸在銅綠假單胞菌生物被膜感染的致病性方面的作用,對(duì)于臨床研究這種難治性院內(nèi)感染尤其留置導(dǎo)管相關(guān)感染的發(fā)生、治療、預(yù)防均有重要的指導(dǎo)意義,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8～9周齡清潔級(jí)健康雌性昆明(KM)小鼠(18～22g)(由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,動(dòng)物合格證號(hào):SC X K桂2014-0002)。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株 銅綠假單胞菌PAO1野生型(丹麥哥本哈根大學(xué)醫(yī)院臨床微生物科惠贈(zèng))。

1.3 BF載體 將一次性使用引流管(蘇州鑫達(dá)醫(yī)療器材有限公司)切割成5mm直徑的小圓片,高壓滅菌后備用。銅綠假單胞菌在37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)20h,將細(xì)菌濃度調(diào)整至所需的O D600＝0.05,用24孔板每孔分別加入2.0m L調(diào)好的菌液或生理鹽水,浸泡一次性引流管圓片,37℃恒溫培養(yǎng)20h,取出載體,0.9%氯化鈉注射液沖洗兩遍備用。

1.4 動(dòng)物模型的建立 32只雌性KM小鼠飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)鼠糧、隨意飲水1周。按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、PAO1組、PAO1灸組和空白灸組4組,每組8只。將4組小鼠用4%水合氯醛(0.10m L/10g)腹腔麻醉后,于左側(cè)下腹部局部消毒后切開(kāi)約8mm切口,逐層分離進(jìn)入腹腔,將BF載體用0.9%氯化鈉注射液輕輕沖洗后放入腹腔,縫合關(guān)腹。術(shù)后,艾灸組小鼠每日給予腹部溫和灸15min,飼養(yǎng)3d后處死小鼠。

1.5 藥物和器材 蘄艾條(蘄春藥圣草本科技有限公司,長(zhǎng)200mm,直徑18mm)[9];試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純;生物安全柜(蘇州凈化設(shè)備有限公司,BHC-1300 II A/B2);全自動(dòng)血液分析儀(SY SME X,X T-2000 i),智能生化培養(yǎng)箱(常州市偉嘉儀器制造有限公司,SPX 250)。

1.6 指標(biāo)檢測(cè) 小鼠腹腔銅綠假單胞菌生物被膜載體植入3d后取出,采用連續(xù)稀釋法計(jì)算活菌計(jì)數(shù);檢測(cè)小鼠血常規(guī)、腹部病理學(xué)和細(xì)菌學(xué)改變(標(biāo)本選擇載體及其周?chē)M織等)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

(1)載體活菌計(jì)數(shù) PAO1灸組載體活菌計(jì)數(shù)為(5.24±0.17)CFU/m L,明顯少于PAO1組(5.92±0.29)CFU/m L(P＜0.01),空白對(duì)照組、空白灸組均未培養(yǎng)出活菌。

(2)血常規(guī)結(jié)果 PAO1灸組、PAO1組、空白灸組白細(xì)胞計(jì)數(shù)均高于空白對(duì)照組(P＜0.05),且PAO1組白細(xì)胞計(jì)數(shù)低于空白灸組(P＜0.05);PAO1灸組、PAO1組單核細(xì)胞比值均高于空白對(duì)照組(P＜0.05),且PAO1組高于空白灸組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 4組小鼠腹腔植入細(xì)菌生物被膜載體后血常規(guī)結(jié)果比較(±s)

表1 4組小鼠腹腔植入細(xì)菌生物被膜載體后血常規(guī)結(jié)果比較(±s)

注:與空白對(duì)照組比較,△P＜0.05;與空白灸組比較,▲P＜0.05。

組別 只數(shù) 白細(xì)胞計(jì)數(shù)(109/L) 單核細(xì)胞比值(%)PA O 1灸組 8 4.89±0.55△ 8.25±1.37△PA O 1組 8 3.61±0.64△▲ 10.28±2.68△▲空白灸組 8 4.03±0.41△ 3.65±1.49空白對(duì)照組 8 2.86±0.80▲ 5.54±1.65

(3)腹腔感染組織病理學(xué)改變 空白對(duì)照組未見(jiàn)明顯炎性反應(yīng)。與空白對(duì)照組比較,PAO1組腹腔載體附近組織炎性反應(yīng)嚴(yán)重,可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn);與PAO1組比較,空白灸組組織炎癥明顯減輕。掃描題目右側(cè)二維碼查看圖1—4。

3 討論

銅綠假單胞菌是免疫缺陷患者院內(nèi)感染和致命感染的常見(jiàn)病原菌之一,可引起慢性感染。隨著生物醫(yī)學(xué)材料的廣泛使用,相關(guān)的臨床感染也日益增多,能引起許多慢性感染,如慢性呼吸系統(tǒng)感染、慢性泌尿生殖系統(tǒng)感染、牙周炎及體內(nèi)留置導(dǎo)管等的感染等。銅綠假單胞菌是常見(jiàn)的BF相關(guān)感染病原菌之一。臨床抗感染的經(jīng)驗(yàn)證明,單一抗生素對(duì)大多數(shù)革蘭氏陰性菌,尤其是銅綠假單胞菌的治療是不理想的,因其會(huì)很快出現(xiàn)耐藥株,從而導(dǎo)致治療失敗。因此,銅綠假單胞菌慢性感染的研究已成為醫(yī)學(xué)及相關(guān)學(xué)科等眾多領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)課題。

灸法是利用陳艾葉制成的艾絨柱或艾條,在選定的穴位皮膚表面上點(diǎn)燃或熏灸,借艾火的熱力透入肌膚,通過(guò)溫?zé)岽碳ぎa(chǎn)生溫經(jīng)散寒、疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)和氣血的作用,從而達(dá)到治病和保健作用的一種療法。灸法在針灸治療中屬于與針?lè)ɑパa(bǔ)的一種療法,灸法在現(xiàn)代臨床應(yīng)用廣泛,治療以扶正為主,古有“七年之病,求三年之艾”“陷下則灸之”等描述,“扶助正氣”與臨床慢性感染治療多從提高細(xì)胞免疫力的思路類(lèi)似。溫和灸通過(guò)艾灸的溫?zé)嶙饔糜谘ㄎ?對(duì)皮膚的溫?zé)岽碳た梢栽诰植恳鹧軘U(kuò)張,加速血液循環(huán),增強(qiáng)血液代謝,改善局部組織營(yíng)養(yǎng),加快組織中異常產(chǎn)物的吸收和清除[1-2]。除了改善血液循環(huán)、促進(jìn)炎癥吸收外,溫和灸還能促進(jìn)小動(dòng)脈及毛細(xì)血管周?chē)准?xì)胞移行、浸潤(rùn),增強(qiáng)吞噬細(xì)胞功能,促進(jìn)抗體形成,增強(qiáng)免疫功能,故對(duì)淺層組織的慢性炎癥亦有效[3-4]。臨床報(bào)道中,溫和灸在新型冠狀病毒、慢性結(jié)腸炎及氣管哮喘慢性持續(xù)期等疾病的治療中,發(fā)揮了獨(dú)特而有效的作用[6-8]。?本草綱目?記載艾葉:“自成化以來(lái),則以蘄州者為勝,用充方物,天下重之,謂之蘄艾?！碧I艾,性溫、苦、辛、微甘,具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化等藥理作用,其揮發(fā)油、總黃酮含量及藥理藥效均明顯優(yōu)于其他地區(qū)所產(chǎn)艾葉[9-10]。本實(shí)驗(yàn)以蘄艾艾條為工具[9],根據(jù)本課題研究實(shí)際需要設(shè)計(jì)了一種動(dòng)物用艾灸懸掛裝置(專(zhuān)利號(hào):Z L 201920668212.5),艾灸過(guò)程中盡可能避免因?yàn)榫牧考皶r(shí)間差異帶來(lái)的實(shí)驗(yàn)影響,通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,溫和灸后小鼠血液白細(xì)胞數(shù)量明顯增多,溫和灸治療對(duì)假銅綠單胞菌生物被膜感染引起的腹腔炎癥有明顯的抑制和治療作用,對(duì)溫和灸抑制炎性滲出及促進(jìn)痊愈可能是通過(guò)提高白細(xì)胞數(shù)量及提高相關(guān)免疫機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)支撐。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究也表明,針灸可使免疫反應(yīng)趨于平衡,調(diào)節(jié)嗜酸粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的數(shù)量,減少B淋巴細(xì)胞分泌免疫球蛋白E等,說(shuō)明針灸可對(duì)相關(guān)免疫細(xì)胞作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行多靶點(diǎn)和多環(huán)節(jié)的動(dòng)態(tài)調(diào)控,從而發(fā)揮抑制慢性炎癥的作用[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也印證了采取溫和灸治療銅綠假單胞菌生物被膜感染有效,從而為臨床相關(guān)炎癥治療采取溫和灸治療提供理論基礎(chǔ)。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)此類(lèi)感染的艾灸治療研究報(bào)道極少。艾灸治療安全經(jīng)濟(jì)、療效穩(wěn)定可靠,對(duì)臨床這種難治性感染的防治指明一個(gè)新的方向。