姜黃素對(duì)酒精性肝損傷大鼠CYP3A的影響及機(jī)制探討

陳潔，劉斌，袁橋玉

酒精性肝損傷（alcoholic liver disease，ALD）由長(zhǎng)期過(guò)量飲酒造成，若不及時(shí)治療，可導(dǎo)致肝硬化，甚至肝癌［1］。姜黃素作為姜黃、莪術(shù)、郁金等姜黃科植物干燥根莖中的有效成分，具有抗癌、抗氧化、降脂、抗衰老等重要藥理學(xué)功效，可以改善ALD大鼠的腸損傷和肝損傷，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝損傷的保護(hù)［2］，但具體機(jī)制尚不清楚。細(xì)胞色素P450 3A（cytochrome P450 3A，CYP3A）作為肝細(xì)胞主要代謝酶，其表達(dá)增強(qiáng)可實(shí)現(xiàn)對(duì)肝毒性的保護(hù)［3］。孕烷X受體（pregnane X receptor，PXR）、組成型雄甾烷受體（constitutive androstane receptor，CAR）同作為核受體（nuclear receptors，NRs）家族成員，在調(diào)節(jié)藥物代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)、糖異生等方面具有重要作用［4］。另有研究發(fā)現(xiàn)，PXR/CAR通路可調(diào)控CYP3A的表達(dá)［5］。基于以上研究背景，筆者推測(cè)姜黃素在ALD中對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)可能與藥物代謝有關(guān)。因此，本研究通過(guò)建立ALD大鼠模型及乙醇誘導(dǎo)的體外肝細(xì)胞損傷模型，探討姜黃素對(duì)ALD的作用，并初步探討其代謝機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 雄性SD大鼠72只，SPF級(jí)，7周齡，平均體質(zhì)量（260±10）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。大鼠在溫度23℃、濕度40%、12 h黑暗/12 h光照條件下暫養(yǎng)7 d進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)本院倫理學(xué)會(huì)審核并通過(guò)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則。大鼠原代肝細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室自備。

1.2試劑與儀器 姜黃素購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司；乙醇購(gòu)自天津化工廠；siRNA-CYP3A25、siRNA-NC購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；腺苷蛋氨酸購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；一抗PXR、CAR、GAPDH購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。全自動(dòng)生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，型號(hào)BS-280）；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time PCR，qPCR）儀（美國(guó)ABI公司，型號(hào)7500）。

1.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.1動(dòng)物造模及分組 參考文獻(xiàn)［6］并改進(jìn)建立ALD模型，灌胃10 mL/kg 56度白酒（體積分?jǐn)?shù)56%的乙醇）、2 mL/kg玉米油、25 mg/kg吡唑混合物，1次/d；同時(shí)腹腔注射0.3 mL/kg四氯化碳橄欖油溶液（四氯化碳∶橄欖油=1∶3），1次/周，連續(xù)6周，參考酒精性肝病防治指南［7］判定ALD模型成功與否。60只建模成功大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組，姜黃素低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組，每組12只。姜黃素低、中、高劑量組分別用40、80、160 mg/kg姜黃素灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射200 mg/kg腺苷蛋氨酸，連續(xù)6周。另取12只正常飼養(yǎng)的大鼠為對(duì)照組，對(duì)照組和模型組均灌胃等體積生理鹽水。期間觀察大鼠一般情況。

1.3.2樣本收集 造模12周末，股動(dòng)脈采血并處死大鼠，血液室溫靜置2 h，1 000 r/min離心10 min，上清液置于-20℃冰箱保存待用；肉眼觀察肝臟大體形態(tài)，取部分肝臟右葉置于4%多聚甲醛中固定，其余部分置于-80℃冰箱保存待用。

1.3.3肝功能生化指標(biāo)檢測(cè) 取出血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）水平。

1.3.4HE染色觀察肝臟形態(tài)變化 取經(jīng)4%多聚甲醛固定的肝臟，梯度乙醇脫水，連續(xù)切片，厚度4μm。經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇和蒸餾水水化后，蘇木素染色、流水沖洗、鹽酸乙醇分色，伊紅染色后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下（×200）觀察肝組織情況。

1.3.5qPCR檢測(cè)肝臟組織中PXR、CAR、CYP3A25mRNA水平 取-80℃凍存肝臟組織30 mg，添加500μL Trizol，Trizol法提取總RNA，cDNA第一條鏈合成試劑盒合成cDNA，qPCR檢測(cè)組織中PXR、CAR、CYP3A25mRNA水平。引物序列見表1。上樣體積20μL：50 mg/L cDNA 1μL，2×SYBR qPCR Mix 10μL，上、下游引物（均為10μmol/L）各0.5μL，ddH2O 8μL。反應(yīng)條件：94℃90 s；95℃50 s，58℃（PXR）或60℃（CAR）或61℃（CYP3A25）30 s，40個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法計(jì)算PXR、CAR、CYP3A25mRNA相對(duì)表達(dá)量。

Tab.1 Sequences of the primers and product size表1 引物序列及產(chǎn)物大小

1.3.6Western blot檢測(cè)肝臟組織中PXR、CAR蛋白表達(dá)水平 取-80℃凍存肝臟組織30 mg，手術(shù)剪剪碎，冰上研磨，添加1 mL蛋白裂解液冰上裂解20 min，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，每孔上樣20μg，凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，PVDF膜轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；對(duì)應(yīng)加入一抗PXR（1∶500）、CAR（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000），4℃孵育過(guò)夜；對(duì)應(yīng)加入二抗，室溫孵育2 h；DAB顯色試劑盒避光顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

綜上所述，雖然IgD型MM發(fā)病率低，但初發(fā)時(shí)或病程中易出現(xiàn)髓外累及和病情進(jìn)展，臨床表現(xiàn)不典型，需盡早進(jìn)行IgD、IgE免疫固定電泳及游離輕鏈的檢測(cè)，避免漏診或誤診。

1.4細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)與干預(yù) 將細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞以1×105個(gè)/mL置于96孔板中，每孔100μL，分別添加0、100、200、300、400、500 mmol/L乙醇培養(yǎng)細(xì)胞，處理24 h，添加CCK-8試劑，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)光密度（OD）490。分別添加0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μmol/L姜黃素培養(yǎng)細(xì)胞24 h，添加CCK-8試劑，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)OD490。增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD490/對(duì)照組OD490）×100%。

1.4.2細(xì)胞分組 以300 mmol/L乙醇、4.0μmol/L姜黃素進(jìn)行下一步研究。實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組、乙醇組、姜黃素組、姜黃素+siRNA-NC組和姜黃素+siRNA-CYP3A25組。細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)以Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染siRNA-NC、siRNACYP3A25，轉(zhuǎn)染6 h后更換為完全培養(yǎng)液。對(duì)照組正常培養(yǎng)；乙醇組以300 mmol/L乙醇培養(yǎng)細(xì)胞24 h；姜黃素組、姜黃素+siRNA-NC組、姜黃素+siRNA-CYP3A25組均用300 mmol/L乙醇、4.0μmol/L姜黃素分別處理正常細(xì)胞、轉(zhuǎn)染siRNA-NC細(xì)胞、轉(zhuǎn)染siRNA-CYP3A25細(xì)胞24 h。每組均設(shè)6個(gè)平行孔。

1.4.3CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 按1.4.2處理各組細(xì)胞，添加CCK-8試劑，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)OD490。

1.4.4qPCR檢測(cè)細(xì)胞中CYP3A25mRNA水平 將1×105個(gè)/mL細(xì)胞置于6孔板中，參考1.4.2各劑量分別添加乙醇、姜黃素，處理24 h，Trizol法提取總RNA，cDNA第一條鏈合成試劑盒合成cDNA，qPCR儀檢測(cè)細(xì)胞中CYP3A25mRNA水平。引物序列見表1。其余步驟參考1.3.5進(jìn)行。

1.4.5Western blot檢測(cè)細(xì)胞中PXR、CAR蛋白水平 按照1.4.2方法處理各組細(xì)胞，添加1 mL蛋白裂解液冰上裂解20 min，參考1.3.6方法檢測(cè)細(xì)胞中PXR、CAR蛋白水平。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)大鼠一般情況的影響 對(duì)照組大鼠毛色發(fā)亮、反應(yīng)靈敏，食欲和大便均正常；模型組，姜黃素低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組均出現(xiàn)四肢癱軟、步履蹣跚癥狀，以及不同程度的毛色無(wú)光澤，食欲減退，反應(yīng)遲鈍。模型組大鼠出現(xiàn)明顯的稀便現(xiàn)象。隨著姜黃素劑量的增加，大鼠的癥狀減輕。

2.2 姜黃素對(duì)肝功能生化指標(biāo)的影響 與對(duì)照組相比，模型組ALT、AST、ALP水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，除姜黃素低劑量組的AST與其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余姜黃素各劑量組血清ALT、AST、ALP水平均降低，且隨著姜黃素劑量的增高，效果愈加明顯（P＜0.05）；而陽(yáng)性對(duì)照組血清中ALT、AST和ALP水平較模型組亦降低，其AST水平與姜黃素高劑量組相當(dāng)，ALT和ALP水平與姜黃素中劑量組相當(dāng)（P＞0.05），但ALT和ALP水平高于姜黃素高劑量組（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of serum levels of ALT,AST and ALP between the six groups of rats表2各組大鼠血清中ALT、AST、ALP水平比較（n=12，U/L，±s）

Tab.2 Comparison of serum levels of ALT,AST and ALP between the six groups of rats表2各組大鼠血清中ALT、AST、ALP水平比較（n=12，U/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，c與姜黃素低劑量組比較，d與姜黃素中劑量組比較，e與姜黃素高劑量組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組模型組姜黃素低劑量組姜黃素中劑量組姜黃素高劑量組陽(yáng)性對(duì)照組F ALT 36.46±6.16 175.41±12.12a 133.35±10.54ab 83.48±6.51abc 49.87±5.37abcd 76.86±8.45abce 448.542＊＊AST 134.58±5.19 276.59±12.46a 246.45±12.15a 203.15±7.58abc 164.46±9.56abcd 173.16±12.15abcd 328.714＊＊ALP 103.16±8.46 213.25±9.13a 176.45±8.15ab 139.48±6.85abc 129.11±7.41abcd 143.12±7.52abce 272.341＊＊

2.3 姜黃素對(duì)肝臟大體形態(tài)及肝組織病理學(xué)的影響 肉眼觀察，對(duì)照組大鼠肝臟呈紅褐色，質(zhì)地均勻，邊緣銳利，被膜光滑；模型組肝臟體積增大，表面充血，呈淺紅色，表面可見黃色顆粒，邊緣變鈍，被膜緊張；姜黃素低、中、高劑量組隨著姜黃素劑量的增加，肝臟損傷出現(xiàn)不同程度的改善，體積增大、表面充血程度緩解，姜黃素高劑量組肝臟呈紅褐色，質(zhì)地均勻，邊緣銳利，被膜稍緊張；陽(yáng)性對(duì)照組肝臟體積稍大，表面可見少許黃色顆粒，邊緣稍變鈍，被膜緊張。

Fig.1 Liver histomorphology of rats in each group(HE staining,×200)圖1 各組大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)情況（HE染色，×200）

鏡下可見，對(duì)照組肝臟組織細(xì)胞核大，位于細(xì)胞中央，肝細(xì)胞體積大，呈多面體形；模型組肝細(xì)胞大小不均，細(xì)胞漿出現(xiàn)不同程度的空泡；姜黃素低、中、高劑量組隨著姜黃素劑量的增加，細(xì)胞漿內(nèi)空泡數(shù)量降低，但肝細(xì)胞體積變小現(xiàn)象未緩解；陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞漿內(nèi)可見少數(shù)空泡，肝細(xì)胞體積增大，見圖1。

2.4 姜黃素對(duì)肝臟組織中PXR、CAR、CYP3A25mRNA水平的影響 對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組肝臟組織中PXR、CAR、CYP3A25mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。分別與上述3組相比，姜黃素各劑量組肝臟組織中PXR、CAR、CYP3A25mRNA表達(dá)水平升高，且隨著姜黃素劑量增加，3種基因表達(dá)水平逐漸升高（P＜0.05），見表3。

2.5 姜黃素對(duì)肝臟組織中PXR、CAR蛋白表達(dá)水平的影響 對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組肝臟組織中PXR、CAR蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。分別與上述3組相比，姜黃素各劑量組肝臟組織中2種蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；且隨著姜黃素劑量的增加，PXR表達(dá)水平逐漸升高（P＜0.05），而姜黃素中、高劑量組CAR表達(dá)水平高于姜黃素低劑量組（P＜0.05），但姜黃素中、高劑量組CAR表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2、表3。

Tab.3 Comparison of PXR,CAR,CYP3A25 mRNA and PXR,CAR protein levels in liver tissues between the six groups of rats表3各組大鼠肝臟組織中PXR、CAR、CYP3A25 mRNA及PXR、CAR蛋白水平比較 （n=12，±s）

Tab.3 Comparison of PXR,CAR,CYP3A25 mRNA and PXR,CAR protein levels in liver tissues between the six groups of rats表3各組大鼠肝臟組織中PXR、CAR、CYP3A25 mRNA及PXR、CAR蛋白水平比較 （n=12，±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，c與姜黃素低劑量組比較，d與姜黃素中劑量組比較，e與姜黃素高劑量組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組模型組姜黃素低劑量組姜黃素中劑量組姜黃素高劑量組陽(yáng)性對(duì)照組F mRNA PXR 1.02±0.13 1.13±0.13 3.46±0.45ab 4.15±0.56abc 6.46±0.43abcd 1.43±0.12cde 449.135＊＊CAR 1.01±0.08 0.96±0.08 1.83±0.12ab 2.36±0.20abc 3.17±0.41abcd 1.12±0.14cde 223.885＊＊CYP3A25 0.99±0.08 0.86±0.12 1.58±0.15ab 2.57±0.34abc 5.61±0.43abcd 0.97±0.08cde 693.187＊＊組別對(duì)照組模型組姜黃素低劑量組姜黃素中劑量組姜黃素高劑量組陽(yáng)性對(duì)照組F蛋白PXR 0.12±0.03 0.09±0.01 0.34±0.04ab 0.59±0.06abc 0.79±0.06abcd 0.08±0.01cde 644.873＊＊CAR 0.34±0.03 0.29±0.03 0.56±0.04ab 0.65±0.05abc 0.68±0.06abc 0.31±0.04cde 206.898＊＊

Fig.2 The expression levels of PXR and CAR protein in kidney tissues of rats in each group圖2 各組大鼠腎臟組織中PXR、CAR蛋白表達(dá)水平

2.6 乙醇和姜黃素對(duì)細(xì)胞增殖的影響 0、100、200、300、400、500 mmol/L乙醇處理細(xì)胞的增殖抑制率 分 別 為0、（21.85±3.18）%、（36.19±3.82）%、（48.46±3.94）%、（64.15±4.75）%、（76.16±6.16）%（n=6，F(xiàn)=278.171，P＜0.01），隨著乙醇濃度的升高，細(xì)胞增殖抑制率依次升高（均P＜0.05）。當(dāng)300 mmol/L乙醇處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率約為50%。0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μmol/L姜黃素處理細(xì)胞的增 殖 抑 制 率 分 別 為0、（45.16±4.52）%、（42.02±6.48）%、（31.42±4.36）%、（15.84±3.48）%、（26.46±3.41）%、（31.45±2.85）%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，F(xiàn)=89.404，P＜0.01）。與0μmol/L姜黃素組相比，0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μmol/L姜黃素組細(xì)胞增殖抑制率均升高（P＜0.05）；其他組間比較顯示，4.0μmol/L姜黃素組細(xì)胞增殖抑制率最低（P＜0.05）。因此，選擇300 mmol/L乙醇、4.0μmol/L姜黃素進(jìn)行后續(xù)研究。

2.7 干擾CYP3A25對(duì)姜黃素處理細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組相比，乙醇組細(xì)胞增殖抑制率升高（P＜0.05）；與乙醇組相比，姜黃素組細(xì)胞增殖抑制率降低（P＜0.05）；與姜黃素組相比，姜黃素+siRNA-NC組細(xì)胞增殖抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而姜黃素+siRNA-CYP3A25組細(xì)胞增殖抑制率升高（P＜0.05），見表4。

Tab.4 Comparison of cell proliferation rate,CYP3A25 mRNA,PXR and CAR protein levels between the five groups of cells表4各組細(xì)胞中細(xì)胞增殖率、CYP3A25 mRNA及PXR、CAR蛋白水平比較 （n=6，±s）

Tab.4 Comparison of cell proliferation rate,CYP3A25 mRNA,PXR and CAR protein levels between the five groups of cells表4各組細(xì)胞中細(xì)胞增殖率、CYP3A25 mRNA及PXR、CAR蛋白水平比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與乙醇組比較，c與姜黃素組比較，d與姜黃素+siRNA-NC組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組乙醇組姜黃素組姜黃素+siRNANC組姜黃素+siRNACYP3A25組F增殖抑制率（%）0.00±0.00 43.16±4.71a 14.58±3.46ab 15.03±3.76ab 34.49±4.17abcd 135.868＊＊CYP3A25 mRNA 1.01±0.18 0.76±0.15 3.78±0.32ab 3.84±0.55ab 1.26±0.18acd 145.289＊＊PXR蛋白0.53±0.06 0.09±0.01a 0.56±0.06b 0.58±0.08b 0.21±0.02abcd 110.064＊＊CAR蛋白0.34±0.04 0.11±0.02a 0.86±0.05ab 0.89±0.09ab 0.38±0.04bcd 249.570＊＊

2.8 干擾CYP3A25對(duì)姜黃素處理細(xì)胞中CYP3A25mRNA水平的影響 對(duì)照組與乙醇組細(xì)胞中CYP3A25mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與乙醇組相比，姜黃素組細(xì)胞中CYP3A25mRNA水平升高（P＜0.05）；與姜黃素組相比，姜黃素+siRNA-NC組細(xì)胞中CYP3A25mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而姜黃素+siRNA-CYP3A25組細(xì)胞中CYP3A25mRNA水平降低（P＜0.05），見表4。

2.9 干擾CYP3A25對(duì)姜黃素處理細(xì)胞中PXR、CAR蛋白水平的影響 與對(duì)照組相比，乙醇組細(xì)胞中PXR、CAR蛋白水平降低（P＜0.05）；與乙醇組相比，姜黃素組細(xì)胞中PXR、CAR蛋白水平升高（P＜0.05）；與姜黃素組相比，姜黃素+siRNA-NC組細(xì)胞中PXR、CAR蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而姜黃素+siRNA-CYP3A25組細(xì)胞中PXR、CAR蛋白水平降低（P＜0.05），見表4、圖3。

Fig.3 PXR and CAR protein expression levels in each group of cells圖3 各組細(xì)胞中PXR、CAR蛋白表達(dá)水平

3 討論

3.1 姜黃素對(duì)ALD的改善作用 過(guò)量飲酒會(huì)引起中毒性肝損傷，乙醇及其代謝產(chǎn)物進(jìn)入體內(nèi)，80%～90%在肝內(nèi)代謝，乙醇與細(xì)胞膜直接結(jié)合可以改變細(xì)胞膜的通透性和流動(dòng)性，干擾氨基酸的代謝過(guò)程，改變肝細(xì)胞氧化還原過(guò)程，影響肝臟微循環(huán)系統(tǒng)，危害嚴(yán)重［8］。目前尚缺乏有效治療ALD的藥物，糖皮質(zhì)激素、己酮可可堿、秋水仙素、中藥等雖有一定療效，但其作用機(jī)制尚不明確。中藥及其有效成分具有療效好、價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)，這為ALD的治療提供了方向［9］。姜黃素是姜黃制品中具有活性的有效成分，在肝病中具有抗氧化、抗炎、清除自由基等多方面功效［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠出現(xiàn)四肢癱軟、精神狀態(tài)差、食欲減退等癥狀，肝臟大體形態(tài)改變并存在明顯的組織病理?yè)p傷，提示ALD大鼠模型構(gòu)建成功；而經(jīng)不同劑量姜黃素灌胃后，ALD大鼠精神狀態(tài)、肝臟大體形態(tài)和組織病理?yè)p傷出現(xiàn)不同程度的改善，提示姜黃素可以改善ALD大鼠的精神狀態(tài)和肝損傷。

3.2 CYP3A在藥物代謝中的機(jī)制 CYP3A作為藥物代謝酶，可能改變藥物代謝而影響藥效。CYP3A被藥物誘導(dǎo)后表達(dá)量發(fā)生變化，但受個(gè)體差異的影響，藥物的生物利用度亦不同［11］。NRs可影響脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)等，在許多代謝類疾病、炎癥相關(guān)疾病治療和預(yù)防中發(fā)揮重要作用，改變NRs水平可能改變藥物對(duì)ALD的療效［12］。PXR和CAR均是NRs家族的非固醇類受體，PXR表達(dá)于肝臟，在結(jié)腸和小腸中少量表達(dá)，可以通過(guò)DNA反應(yīng)元件與視黃酸X受體α（PXRα）結(jié)合成二聚體來(lái)活化靶基因，且PXR是CYP3A的外源性誘導(dǎo)關(guān)鍵介質(zhì)［13］。CAR存在于肝細(xì)胞胞漿中，當(dāng)細(xì)胞接觸誘導(dǎo)劑后移至細(xì)胞核中，與PXR反應(yīng)元件起作用，直接調(diào)控CYP3A的表達(dá)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組與模型組中CYP3A25mRNA及PXR、CAR蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示乙醇本身對(duì)PXR-CAR-CYP3A25這一藥物代謝途徑的作用可能較小。隨著姜黃素劑量的升高，肝臟組織中PXR、CAR mRNA和蛋白水平、CYP3A25mRNA水平升高，提示姜黃素可能通過(guò)上調(diào)ALD大鼠肝臟組織中PXR、CAR表達(dá)誘導(dǎo)CYP3A25水平升高，進(jìn)而提高藥物的生物利用度。陽(yáng)性藥物腺苷蛋氨酸雖然也可以緩解ALD大鼠肝損傷，但卻不是通過(guò)PXR、CAR誘導(dǎo)CYP3A25水平升高這一途徑發(fā)揮作用。

本研究進(jìn)一步在細(xì)胞中驗(yàn)證姜黃素功能，發(fā)現(xiàn)不同濃度乙醇處理后，肝細(xì)胞均出現(xiàn)增殖抑制率升高現(xiàn)象，以增殖抑制率約50%時(shí)的乙醇濃度進(jìn)行后續(xù)研究；不同濃度姜黃素處理肝細(xì)胞后，在4.0μmol/L時(shí)對(duì)肝細(xì)胞影響較小，因此本研究以300 mmol/L乙醇、4.0μmol/L姜黃素進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示乙醇可促進(jìn)細(xì)胞增殖抑制率升高，而姜黃素可緩解該種情況，提示姜黃素可緩解乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷。此外，本研究結(jié)果顯示，乙醇對(duì)肝細(xì)胞中CYP3A25表達(dá)的影響較?。ㄅc對(duì)照組比較P＞0.05），而姜黃素能夠促進(jìn)乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞中CYP3A25表達(dá)，并且促進(jìn)PXR、CAR表達(dá)；且在姜黃素干預(yù)基礎(chǔ)上添加siRNA-CYP3A25后，姜黃素對(duì)上述指標(biāo)的作用減弱，提示姜黃素通過(guò)上調(diào)CYP3A25表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)，且PXR、CAR表達(dá)水平升高也可能參與了此過(guò)程。

綜上所述，姜黃素通過(guò)上調(diào)CYP3A25的表達(dá)提升藥效，進(jìn)而提高治療ALD藥物的生物利用度，且這一過(guò)程可能與上調(diào)PXR、CAR表達(dá)有關(guān)。