APETx2及糞菌移植對(duì)母嬰分離誘導(dǎo)腸易激綜合征大鼠內(nèi)臟敏感性的影響及機(jī)制

李歡，閆波，王金坤，袁麗萍，3△

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種常見(jiàn)的功能性胃腸道疾病，主要表現(xiàn)為持續(xù)性或陣發(fā)性腹痛、腹脹，以及排便習(xí)慣和（或）大便性狀改變。研究發(fā)現(xiàn)，IBS可能與腦-腸軸、黏膜屏障、精神心理因素、遺傳因素、腸道微生物改變、飲食、感染等有關(guān)［1］。越來(lái)越多的研究證實(shí)腸道微生物改變?cè)贗BS的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。IBS腸道微生物改變可引起炎癥和疼痛，進(jìn)一步導(dǎo)致內(nèi)臟高敏感性和腸道動(dòng)力異常［2-3］，但腸道微生物改變參與IBS發(fā)生的機(jī)制至今尚未完全明確。

酸敏感離子通道（acid sensing ion channels，ASICs）是一類(lèi)廣泛存在于細(xì)胞膜上，由細(xì)胞外酸化激活的陽(yáng)離子通道。ASICs在椎間盤(pán)退行性疾病、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用已被廣泛研究。在椎間盤(pán)退變中，ASICs通過(guò)乳酸介導(dǎo)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3（NLRP3）炎性小體調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞炎癥和細(xì)胞焦亡［4］。在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，ASIC3感應(yīng)細(xì)胞外pH值變化調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)和痛覺(jué)敏感性［5］。另有研究發(fā)現(xiàn)ASICs在胃腸道內(nèi)廣泛存在，并作為酸感受器對(duì)胃腸道酸性環(huán)境的改變作出反應(yīng)，對(duì)維持胃腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著重要作用［6］。在炎性腸病、胃排空障礙等胃腸道疾病中，腸道ASIC3表達(dá)增加，參與胃腸道慢性炎癥和胃腸道動(dòng)力功能紊亂［7］。本研究旨在探討母嬰分離誘導(dǎo)的IBS模型鼠腸道微生物對(duì)腸道ASIC3表達(dá)的影響，觀察給予ASIC3阻斷劑APETx2后內(nèi)臟敏感性的變化并分析其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康SD孕鼠10只，孕齡16～18 d，SPF級(jí)健康雄性SD大鼠36只，平均體質(zhì)量（220±10）g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2試劑 ASIC3抑制劑APETx2（上海信裕生物科技有限公司），以生理鹽水溶解至所需濃度；ASIC3、c-kit一抗（Affinity）；兔二抗、DAB（Dako Denmark）；戊巴比妥鈉、EDTA抗原修復(fù)液（福州邁新）；含抗生素的雞尾酒（氨芐西林、新霉素、甲硝唑）、無(wú)水乙醇、二甲苯、中性樹(shù)膠（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基、M199培養(yǎng)基（Hyclone）；Ⅱ型膠原酶（南京生興）。

1.2研究方法

1.2.1母嬰分離模型的制備 每只孕鼠約產(chǎn)下11只新生仔鼠，所有新生仔鼠在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)，進(jìn)行12 h的明/暗循環(huán)，室溫為（23±1）℃，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為母嬰分離組和未分離組。母嬰分離組仔鼠在出生后2～22 d，每天從母鼠籠中取出3 h，分離期結(jié)束后，仔鼠被放回各自的母鼠籠。未分離組仔鼠不進(jìn)行干預(yù)。仔鼠第22天時(shí)斷奶，單獨(dú)飼養(yǎng)。當(dāng)仔鼠8周齡時(shí)，在20、40、60、80 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）壓力下行結(jié)直腸擴(kuò)張（colorectal balloon distention，CRD）刺激，引起大鼠的疼痛，表現(xiàn)為不同程度內(nèi)臟痛引起的行為學(xué)反應(yīng)，稱為腹部回撤反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）。根據(jù)AWR評(píng)分結(jié)果評(píng)估內(nèi)臟敏感性，判斷造模是否成功。AWR評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無(wú)行為學(xué)反應(yīng)；1分，大鼠有動(dòng)作停頓后出現(xiàn)短暫的頭部運(yùn)動(dòng)行為；2分，可見(jiàn)腹部肌肉收縮；3分，有腹部抬起行為；4分，身體拱起，并抬起盆腔和陰囊。在充氣壓力為60 mmHg和80 mmHg時(shí)，與未分離組相比，母嬰分離鼠腹部回撤反射評(píng)分明顯升高，即為造模成功［8］。收集造模成功鼠的糞便，制備成糞菌液。

1.2.2糞菌液的制備 母嬰分離鼠糞便混合，置于無(wú)菌攪拌器內(nèi)，加入PBS（糞便與PBS質(zhì)量比為1∶10）攪拌，依次通過(guò)孔徑為2.0、1.0、0.5和0.25 mm的濾網(wǎng)過(guò)濾，勻漿并3 500 r/min離心20 min后分離純化得到糞菌液沉淀，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3無(wú)菌鼠模型制備及糞菌移植 18只健康雄性SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照（Con）組、母嬰分離（NMS）組、NMS+APETx2組，每組6只。NMS組、NMS+APETx2組均予以含有抗生素的雞尾酒（ABX-water）連續(xù)灌胃5 d，構(gòu)建偽無(wú)菌鼠模型［9］，之后給予NMS大鼠糞菌液（1.6 mL/kg）灌胃；Con組給予等體積生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃5 d。灌胃結(jié)束后，NMS+APETx2組給予100μg/kg APETx2連續(xù)腹腔注射7 d，每天1次。Con組和NMS組則給予等體積生理鹽水連續(xù)腹腔注射7 d，每天1次。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分別進(jìn)行內(nèi)臟敏感性和腸道動(dòng)力評(píng)估，取結(jié)腸組織行免疫組化檢測(cè)。

1.2.4內(nèi)臟敏感性檢測(cè) 大鼠放于特定的透明固定器，使之能自由活動(dòng)，但不能轉(zhuǎn)身、掉頭，以便于觀察。參照1.2.1進(jìn)行CRD刺激，觀察并記錄AWR評(píng)分。

1.2.5腸道傳輸速率測(cè)定 大鼠禁食24 h，禁水12 h，經(jīng)口灌入印度墨汁0.5 mL。30 min后處死，剖腹，取出賁門(mén)至回腸末段的小腸，快速測(cè)量墨汁在腸道的推進(jìn)距離及小腸全長(zhǎng)，計(jì)算腸道推進(jìn)率。腸道推進(jìn)率=墨汁推進(jìn)長(zhǎng)度（cm）/小腸全長(zhǎng)（cm）×100%。

1.2.6免疫組化染色檢測(cè)結(jié)腸中ASIC3和c-kit蛋白的表達(dá) 每組6只大鼠取結(jié)腸組織，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定，常規(guī)包埋、切片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)，滴加相應(yīng)一抗，37℃過(guò)夜。滴加相應(yīng)種屬二抗后，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，脫水封片，顯微鏡下觀察。每張切片隨機(jī)讀取400倍視野進(jìn)行拍照。拍照時(shí)盡量使組織布滿整個(gè)視野，保證每張照片背景光一致。應(yīng)用Image Pro Plus軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽(yáng)性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，分析得出每張照片陽(yáng)性的累積光密度值（integrated optical density，IOD），IOD值越大表明陽(yáng)性表達(dá)水平越高。

1.2.7結(jié)腸cajal間質(zhì)細(xì)胞（ICC）的分離 另取SPF級(jí)18只健康雄性SD大鼠，分組及處理方法同1.2.3。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠禁食8 h，固定在操作臺(tái)上頸椎脫臼處死。在無(wú)菌條件下，取大鼠結(jié)腸組織，放入預(yù)先裝有D-Hank's液的培養(yǎng)皿中浸泡30 min，仔細(xì)剝?nèi)ハ的ず脱?。參照文獻(xiàn)［10］分離細(xì)胞，用含有Ⅱ型膠原酶（1.3 g/L）的消化液處理組織塊。離心、用DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，200目篩網(wǎng)去除大塊組織，將細(xì)胞加入等體積的密度梯度分離液，離心獲得細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用M199培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至1×105/mL，接種至6孔培養(yǎng)板。在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，觀察ICC形態(tài)并計(jì)數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠糞菌移植及藥物干預(yù)后腸道動(dòng)力變化 與Con組相比，NMS組大鼠小腸腸道推進(jìn)率明顯減慢（P＜0.05）；與NMS組大鼠相比，NMS+APETx2組大鼠小腸腸道推進(jìn)率明顯增加（P＜0.05），見(jiàn)圖1、2。

Fig.1 Ink movement state of small intestine in the three groups of rats圖1 3組大鼠小腸墨汁推進(jìn)狀態(tài)

Fig.2 Comparison of intestinal transit rate between the three groups of rats圖2 3組大鼠小腸腸道推進(jìn)率比較

2.2 各組大鼠糞菌移植及藥物干預(yù)后內(nèi)臟敏感性的變化 當(dāng)充氣壓力為20 mmHg時(shí)，3組大鼠AWR評(píng)分均為0。當(dāng)充氣壓力為40、60和80 mmHg時(shí)，與Con組相比，NMS組腹部疼痛加重，AWR評(píng)分顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與NMS組相比，NMS+APETx2組腹部疼痛減輕，AWR評(píng)分下降（P＜0.05），見(jiàn)表1。

Tab.1 Comparison of the AWR scores of the three groups of rats under different pressures表1 3組大鼠在不同壓力下的AWR評(píng)分比較（n=6，分，±s）

Tab.1 Comparison of the AWR scores of the three groups of rats under different pressures表1 3組大鼠在不同壓力下的AWR評(píng)分比較（n=6，分，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與Con組比較，b與NMS組比較，P＜0.05

組別Con組NMS組NMS+APETx2組F 40 mmHg 0.00±0.00 0.67±0.18a 0.00±0.00b 10.000＊＊60 mmHg 0.33±0.18 1.33±0.18a 0.67±0.18b 5.833＊80 mmHg 1.00±0.22 2.00±0.22a 1.33±0.18b 4.375＊

2.3 各組大鼠糞菌移植及藥物干預(yù)后其結(jié)腸中ASIC3、c-kit蛋白表達(dá)水平變化 ASIC3主要表達(dá)于結(jié)腸黏膜層和黏膜下層的細(xì)胞胞漿中，呈暗黃色。c-kit主要表達(dá)于縱行肌和環(huán)形肌之間細(xì)胞的胞漿中，呈黃褐色，見(jiàn)圖3。與Con組相比，NMS組結(jié)腸組織中ASIC3、c-kit蛋白表達(dá)水平均上調(diào)（P＜0.05）；與NMS組相比，NMS+APETx2組ASIC3、c-kit蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.4 各組大鼠糞菌移植及藥物干預(yù)后結(jié)腸中ICC形態(tài)和數(shù)量變化 光鏡下Con組ICC胞體呈菱形或三角形，細(xì)胞核大，核周胞質(zhì)較少，細(xì)胞胞體多見(jiàn)長(zhǎng)突起；NMS組ICC胞體變大呈橢圓形，細(xì)胞胞體突起變短減少；NMS+APETx2組ICC胞體逐漸恢復(fù)呈菱形或三角形，細(xì)胞胞體的突起和鄰近細(xì)胞間的聯(lián)系增加，形態(tài)趨于正常，見(jiàn)圖4。Con組、NMS組、NMS+APETx2組ICC數(shù)量（個(gè)/視野）分別為45.00±11.45、73.50±14.04、52.67±11.66，NMS組較Con組明顯增多，NMS+APETx2組較NMS組明顯減少（F=8.435，P＜0.05）。

Fig.3 Immunohistochemical observation of ASIC3 and c-kit expression in rat colon tissue(×400)圖3 免疫組化觀察大鼠結(jié)腸中ASIC3、c-kit蛋白表達(dá)（×400）

Tab.2 Comparison of the expression levels of ASIC3 and c-kit protein in colon between the three groups of rats表2 3組大鼠結(jié)腸ASIC3、c-kit蛋白的表達(dá)水平比較（n=6，IOD值，±s）

Tab.2 Comparison of the expression levels of ASIC3 and c-kit protein in colon between the three groups of rats表2 3組大鼠結(jié)腸ASIC3、c-kit蛋白的表達(dá)水平比較（n=6，IOD值，±s）

＊＊P＜0.01；a與Con組比較，b與NMS組比較，P＜0.05

組別Con組NMS組NMS+APETx2組F ASIC3 1 400±230 4 178±438a 1 894±309b 116.219＊＊c-kit 1 309±331 5 141±687a 1 736±261b 122.242＊＊

Fig.4 The morphology of interstitial cells of Cajal in rat colon tissue(×100)圖4 大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)（×100）

3 討論

腸道微生物在維持腸道內(nèi)環(huán)境、腸道疾病的發(fā)生和自身穩(wěn)態(tài)過(guò)程中起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，將IBS大鼠糞菌移植到無(wú)菌鼠后，糞便內(nèi)的代謝物與內(nèi)臟高敏感性的發(fā)生密切相關(guān)［11］。IBS患者短鏈脂肪酸、硫化氫（H2S）較健康者明顯增多，且短鏈脂肪酸濃度越高，腹痛越嚴(yán)重［12］。另外，腸道微生物可能調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答，進(jìn)一步影響IBS。IBS患者肥大細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞數(shù)量增多，其產(chǎn)生的活性物質(zhì)可激活腸道的痛覺(jué)通路或增加腸道通透性［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，IBS腸道微生物可以誘導(dǎo)NMS大鼠內(nèi)臟敏感性增高及腸道動(dòng)力改變，且既往研究已證實(shí)IBS糞菌移植引起無(wú)菌鼠腸道動(dòng)力明顯異常［14］，但腸道微生物改變對(duì)腸道動(dòng)力作用的機(jī)制未明確。

ASICs是一類(lèi)由細(xì)胞外酸化直接激活的陽(yáng)離子通道，ASICs在胃腸道分布廣泛，參與胃腸道炎性痛覺(jué)反應(yīng)和機(jī)械傳導(dǎo)，對(duì)于維持胃腸道功能穩(wěn)態(tài)起著特殊作用［6］。IBS和功能性便秘患兒糞菌移植大鼠腸道中ASIC3蛋白表達(dá)與健康兒童存在差異［15-16］。研究發(fā)現(xiàn)，一定的酸性環(huán)境可激活A(yù)SICs，提示其可介導(dǎo)炎癥或損傷后組織酸中毒引起的疼痛，ASIC3的高表達(dá)加劇了慢性炎癥性疼痛下的內(nèi)臟超敏反應(yīng)［7］。腸道菌群失調(diào)的代謝產(chǎn)物膽汁酸、乳酸、H2S以及大量的短鏈脂肪酸可降低細(xì)胞外pH［17］。另外，腸道菌群失調(diào)通過(guò)破壞黏膜屏障和改變腸道通透性，產(chǎn)生大量促炎因子，從而導(dǎo)致慢性低級(jí)別炎癥，進(jìn)一步降低腸道的pH值［18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)，IBS大鼠腸道微生物可以激活腸道ASIC3表達(dá)，這可能與腸道微生物介導(dǎo)的腸道pH值降低有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ASIC3阻斷劑APETx2不僅能夠恢復(fù)IBS大鼠糞菌移植無(wú)菌鼠的腸道傳輸功能，且能降低內(nèi)臟敏感性。此外，與NMS組相比，NMS+APETx2組ASIC3蛋白的表達(dá)水平下調(diào)，表明腸道微生物參與了IBS的產(chǎn)生，而ASIC3在其中發(fā)揮一定的作用，阻斷ASIC3對(duì)IBS有保護(hù)作用。

ICC是胃腸道起搏細(xì)胞，產(chǎn)生、傳播慢波調(diào)節(jié)腸道蠕動(dòng)，并能傳導(dǎo)腸神經(jīng)系統(tǒng)信號(hào)至平滑肌細(xì)胞，在腸道運(yùn)動(dòng)中起基礎(chǔ)作用。ICC數(shù)量和形態(tài)學(xué)改變與胃腸動(dòng)力功能異常有密切關(guān)系，可誘發(fā)胃輕癱、慢性傳輸型功能性便秘、潰瘍性結(jié)腸炎［20-22］。SCF/c-kit系統(tǒng)是一個(gè)配體/受體酪氨酸激酶信號(hào)系統(tǒng)，介導(dǎo)平滑肌收縮和炎癥反應(yīng)。SCF/c-kit系統(tǒng)刺激5-羥色胺、神經(jīng)肽Y、降鈣素基因相關(guān)肽和組胺等相關(guān)介質(zhì)釋放，參與神經(jīng)內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)，引起IBS的內(nèi)臟高敏感性和胃腸動(dòng)力紊亂；另外，SCF/c-kit與ICC相互依賴，兩者共同調(diào)控ICC細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育，而ICC反之可上調(diào)神經(jīng)遞質(zhì)控制其信號(hào)［23］。有文獻(xiàn)報(bào)道，阻斷SCF/c-kit信號(hào)明顯抑制IBS大鼠內(nèi)臟超敏反應(yīng)，ICC的活化程度也明顯降低［24］。本實(shí)驗(yàn)中，APETx2能下調(diào)IBS大鼠糞菌移植無(wú)菌鼠結(jié)腸c-kit蛋白表達(dá)水平，使ICC胞體逐漸恢復(fù)呈菱形或三角形，增加細(xì)胞胞體的突起和鄰近細(xì)胞間的聯(lián)系，改善ICC形態(tài)和數(shù)量，提示ASIC3阻斷劑對(duì)IBS的保護(hù)作用可能與ICC相關(guān)的c-kit信號(hào)有關(guān)。

綜上所述，ASIC3在腸道微生物參與的IBS的發(fā)生中可能起著一定作用。阻斷體內(nèi)ASIC3激活可以改善IBS內(nèi)臟敏感性和腸道傳輸功能，其機(jī)制可能與ICC相關(guān)的c-kit信號(hào)有關(guān)。ASICs有可能成為IBS的潛在治療靶點(diǎn)。