胃息肉患者胃液微生態(tài)分析與功能預(yù)測(cè)

張冉 李蘭，2 夏華向，2 謝文瑞，2 何興祥，2

1廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科（廣州510000）；2廣東省微生態(tài)治療工程技術(shù)研究中心（廣州510000）

胃息肉是胃黏膜上皮細(xì)胞增生并凸入胃內(nèi)形成的隆起性病變，近年來(lái)胃息肉發(fā)病率有上升趨勢(shì)［1］。胃息肉被認(rèn)為有一定的癌變風(fēng)險(xiǎn)，但具體病因尚未明確。既往認(rèn)為胃內(nèi)是無(wú)菌狀態(tài)，近年來(lái)的國(guó)內(nèi)外大量研究表明，胃有獨(dú)立的微生態(tài)體系［2］。正常人群胃內(nèi)有多種微生物定植，幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）陰性人群胃內(nèi)細(xì)菌總量可達(dá)（1.38±0.72）×103CFU/g［3］，正常胃腸道菌群包括了厭氧菌、需氧菌、兼性厭氧菌，它們通過(guò)穩(wěn)定菌群結(jié)構(gòu)及多種調(diào)控系統(tǒng)去維護(hù)胃腸微環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定和平衡，抑制致病菌的生長(zhǎng)［4］。胃微生態(tài)的改變可能是胃息肉發(fā)生的一個(gè)潛在致病因素。

既往對(duì)胃微生態(tài)的研究大多停留在分析生物多樣性、物種組成等方面，無(wú)法從微生物互作網(wǎng)絡(luò)的角度解析菌群-菌群之間的關(guān)系［5］。而且多數(shù)研究針對(duì)胃癌、胃潰瘍或者腸上皮化生等人群，對(duì)胃息肉患者菌群的研究較少，不同地區(qū)人群的胃微生態(tài)亦存在差異。此外，胃液具有獨(dú)特的菌群結(jié)構(gòu)，與唾液菌群、胃黏膜菌群不同。

本研究通過(guò)觀察胃息肉患者胃液微生物多樣性、物種組成、門、屬水平差異分析、菌群分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，探討Hp 感染對(duì)胃息肉患者微生態(tài)的影響，以及菌群關(guān)系和功能基因之間的差異。

1 資料與方法

1.1 一般資料連續(xù)納入2019年4月1日至2020年9月30日于廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)鏡中心接受胃鏡檢查并診斷為胃息肉患者，根據(jù)Hp 感染情況分為息肉Hp（+）組與息肉Hp（-）組。胃鏡下胃黏膜未見(jiàn)異常且Hp 陰性者為健康組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡20 ～80歲，性別不限；（2）1個(gè)月內(nèi)未使用抗生素且未進(jìn)行過(guò)Hp根除治療的患者；（3）自愿簽署知情同意的受檢者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）明確胃癌、胃潰瘍、既往有胃切除手術(shù)史的患者；（2）6 個(gè)月內(nèi)服用大劑量益生菌者。胃息肉診斷標(biāo)準(zhǔn)：胃鏡下診斷為胃息肉并經(jīng)病理活檢證實(shí)為非癌性息肉。

1.2 組織病理檢查及Hp感染情況判斷病理診斷由我院病理科完成。通過(guò)快速尿素酶試驗(yàn)、硼酸美藍(lán)組織染色、C13 呼氣試驗(yàn)判斷Hp 感染情況，三種檢查方式有一種為陽(yáng)性則定義為Hp感染陽(yáng)性。

1.3 胃液樣本收集及處理胃鏡消毒滅菌干燥后進(jìn)入胃底部黏液湖，通過(guò)一次性醫(yī)用20 mL 注射器連接活檢孔道，抽取5 mL 胃液于15 mL 無(wú)菌離心管中，以6 000 RCF/min 離心10 min，分裝后凍存于-80 ℃冰箱。提取DNA 后，使用通用引物341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和806R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）及高保真DNA 聚合酶對(duì)選定的V3-V4 可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。使用KAPA Illumina Library Quantification Kit 建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，文庫(kù)質(zhì)檢合格后使用Illumina NovaSeq System 上機(jī)測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析基于R4.0.3、Rstudio 1.3.1093、Vsearch v2.15.1、Usearch v10.0.240 搭建測(cè)序平臺(tái)。測(cè)序得到的PE reads，對(duì)經(jīng)過(guò)Vsearch 拼接、Deblur 去噪、Usearch 聚類后形成擴(kuò)增序列變異體（amplicon sequence variant，ASV）進(jìn)行物種注釋，得到對(duì)應(yīng)的物種信息和物種的豐度分布情況。通過(guò)R 包、STAMP2.1.3 進(jìn)行α、β 多樣性，物種組成差異分析；Co-currence 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析；BUGBASE 進(jìn)行表型預(yù)測(cè)、PICRUSt 功能預(yù)測(cè)，分析健康組、息肉Hp（-）組、息肉Hp（+）組功能差異。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SPSS 23.0 和R 包，STAMP進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。采用描述性分析研究對(duì)象資料。通過(guò)vegan 包進(jìn)行α 多樣性分析；β 多樣性基于Jaccard 距離通過(guò)限制性主坐標(biāo)軸分析；通過(guò)Welch′sttest 評(píng)估不同分組間物種門、屬水平的差異。BUGBASE 表型組間差異通過(guò)Mann-Whitney 檢驗(yàn)?；贠UT與物種信息，通過(guò)igraph、WGCNA包，獲得基礎(chǔ)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)，計(jì)算網(wǎng)絡(luò)相關(guān)性質(zhì)。PICRUSt功能預(yù)測(cè)，利用STAMP 進(jìn)行KEGGL3 級(jí)別的組間Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，并通過(guò)Story FDR 校正，進(jìn)行差異分析比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象資料成功收集81 例胃液標(biāo)本，健康組28 例、息肉HP（-）組40 例和息肉HP（+）組13 例，年齡20 ～80 歲，見(jiàn)表1。

表1 研究對(duì)象資料Tab.1 Clinical characteristic of the study cohort

2.2 胃液α、β 多樣性分析如圖1A 所示，健康組、息肉Hp（+）組、息肉Hp（-）組的共有ASV 數(shù)為90 個(gè)，特異性ASV 數(shù)為分別為33、32、27 個(gè)。Richness、shannon 指數(shù)可分別反映微生物群落組成的豐富度和均勻度，而由圖1B、1C 可知三者α 多樣性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。β 多樣性可以描述不同樣品微生物群落構(gòu)成差異。通過(guò)CPCoA 顯示空間水平上三組間最大差異。β 多樣性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.045，圖1D）。

圖1 胃液菌群生物多樣性分析Fig.1 Analysis of the bacterial diversity in gastric juice

2.3 胃液菌群的組成通過(guò)ASV 特征表與物種注釋，進(jìn)行樹(shù)圖maptree分析，篩選豐度前100的ASV，用以表達(dá)多層物種關(guān)系（圖2A）；同時(shí)用柱狀圖表示各組門屬水平優(yōu)勢(shì)菌。胃液中有六種高豐度菌門匯聚，依次為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、梭桿菌門、Candidatus_Saccharibacteria（圖2B）。胃液中優(yōu)勢(shì)菌屬為鏈球菌、普雷沃氏菌、嗜鹽單胞菌、羅斯氏菌、韋榮球菌、奈瑟氏球菌、梭桿菌、放線菌、牙齦卟啉單胞、嗜血桿菌（圖2C）。

圖2 胃液菌群門、屬水平優(yōu)勢(shì)菌群構(gòu)成Fig.2 Composition of dominant microflora at phylum and genus level in gastric juice

2.4 STAMP 差異物種分析

2.4.1 門水平差異分析在門水平上，息肉Hp（-）組較健康組梭桿菌門豐度下降（P= 0.045）；息肉Hp（+）組較息肉Hp（-）組放線菌門豐度下降（P=0.003）。

2.4.2 屬水平差異分析在屬水平上，息肉Hp（-）組較健康組Catonella、Granulicatella 豐度降低，Novosphingobium、Caulobacter、Dietzia、Bradyrhizobium 豐度升高（P＜0.005）；息肉Hp（+）組較健康組Lachnoanaerobaculum 豐度升高，Achromobacter、Curvibacter、Glycocaulis、Sphingomonas、Nesterenkonia、Mesorhizobium、Halomonas豐度下降（P＜0.005）；息肉Hp（+）組較息肉Hp（-）組Lachnoanaerobaculum、Oribacterium 豐度升高（P＜0.005）。

2.5 Bugbase 表型分析對(duì)需氧菌、厭氧菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、生物膜形成、致病潛力、移動(dòng)元件含量、氧的利用、氧化脅迫耐受九種表型進(jìn)行分析。息肉Hp（-）組與息肉Hp（+）組在需氧菌上存在差異（P= 0.03），息肉Hp（-）組的物種豐度高于息肉Hp（+）組（40＞28），而在其他表型上未見(jiàn)顯著差異。利用OTUs 分析了需氧菌占主要貢獻(xiàn)的菌門，息肉Hp（-）組較息肉Hp（+）組Proteobacteria、Firmicutes 均升高。

2.6 胃液菌群Co-occurrence 網(wǎng)絡(luò)圖基于ASV和物種注釋，用R 包進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本參數(shù)分析，見(jiàn)表2。健康組的邊數(shù)為314，正向關(guān)系邊數(shù)為223，負(fù)向關(guān)系邊數(shù)為91，健康組與息肉Hp（-）組的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浠緟?shù)均大于息肉Hp（+）組。而健康組的負(fù)向邊數(shù)、節(jié)點(diǎn)數(shù)、緊密中心性、介數(shù)中心性大于息肉Hp（-）組。同時(shí)分別繪制三組Co-occurrence 網(wǎng)絡(luò)圖，反應(yīng)主要網(wǎng)絡(luò)菌屬關(guān)系。通過(guò)屬水平的物種分類為節(jié)點(diǎn)配色，著色點(diǎn)大小反應(yīng)物種在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的作用，不同顏色表示不同的物種；連線的顏色表示正負(fù)相關(guān)性，紅色表示正相關(guān)，藍(lán)色表示負(fù)相關(guān)；線的粗細(xì)表示相關(guān)性系數(shù)的大小，線越粗，表示物種之間的相關(guān)性越高；線越多，表示該物種與其他物種之間的聯(lián)系越密切，A 為健康組、B 為息肉Hp（+）組、C 為息肉Hp（-）組，見(jiàn)圖3。

圖3 三組菌群Co-occurrence 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系Fig.3 Co-occurrence network of three groups of bacteria

表2 三組菌屬網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本參數(shù)Tab.2 Basic parameters of topological structure of three groups of bacteria

健康組的胃液菌群之間的菌屬關(guān)系更為復(fù)雜，Streptococcus、Prevotella、Rare_groups、Unassigned、Veillonella 存在正相關(guān)關(guān)系，同時(shí)Prevotella、Streptococcus、Unassigned 之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系；息肉Hp（+）組Unassigned、Rare_groups、Prevotella 存在正相關(guān)關(guān)系；息肉Hp（-）組中Streptococcus、Unassigned、Prevotella、Rare_groups 呈正相關(guān)與負(fù)相關(guān)關(guān)系，同時(shí)Streptococcus、Rare_groups、Rothia 呈正相關(guān)關(guān)系，見(jiàn)圖2。

2.7 PICRUSt 功能預(yù)測(cè)與差異分析息肉Hp（+）組較息肉Hp（-）組在糖基轉(zhuǎn)移酶、維生素B6 代謝、幽門螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、核糖體合成等代謝通路上調(diào)（P＜0.05）。

3 討論

胃腸道內(nèi)棲息的微生物之間保持互生或拮抗關(guān)系，與人類的健康及疾病密切相關(guān)［6］。而胃微生態(tài)學(xué)的研究仍處于起步階段，雖然研究者對(duì)Hp感染如何影響胃微生態(tài)較為重視，但結(jié)論尚不明確。有研究表明Hp 感染可以顯著影響胃部菌群［7］，也有研究報(bào)道Hp 陰性、陽(yáng)性患者之間的微生物組成無(wú)顯著差異［8］。既往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)急性、慢性感染Hp 均不會(huì)顯著改變鼠胃微生物的生態(tài)系統(tǒng)［9］，而HEIMESAAT 等［10］的研究表明感染了Hp 的小鼠盲腸中大腸桿菌豐度上升，說(shuō)明Hp 陰性和陽(yáng)性個(gè)體的細(xì)菌群落分布仍高度復(fù)雜，不同疾病狀態(tài)下的菌群關(guān)系有差異性。

本研究引入微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)體系，描述生物群落結(jié)構(gòu)，通過(guò)比較三者間的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)參數(shù)可知，三組間生物多樣性不同。相較于息肉Hp（-）組及健康組，息肉Hp（+）組胃微生態(tài)網(wǎng)絡(luò)間的連線減少，分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)平均連接度與平均聚集系數(shù)下降，微生物群落結(jié)構(gòu)趨向多樣化且聯(lián)系程度減弱，從而導(dǎo)致物種間的信息、能量和物質(zhì)的傳遞效率下降。

微生物通過(guò)建立更多的相互作用關(guān)系以抵抗不良環(huán)境所帶來(lái)的壓力，健康人群的上消化道主要菌為需氧菌，息肉Hp（-）組需氧菌的物種豐度高于息肉Hp（+）組，說(shuō)明需氧菌在維持胃微生態(tài)穩(wěn)態(tài)中起到重要作用［11］。正常人體的需氧菌如葡萄球菌、鏈球菌和乳酸桿菌，可以合成維生素、泛酸等營(yíng)養(yǎng)素，參與糖類和蛋白質(zhì)代謝，促進(jìn)鐵、鎂、鋅等礦物質(zhì)的吸收。同時(shí)保持相對(duì)穩(wěn)定比例狀態(tài)，有利于及時(shí)清除胃內(nèi)的致病菌及其產(chǎn)生的毒性物質(zhì)，充分發(fā)揮生物拮抗和生物屏障功能。因此胃息肉者感染Hp 后需要注意需氧菌含量，及時(shí)調(diào)整胃微生態(tài)。

本次研究中，息肉Hp（+）組致病菌豐度上升，非致病菌豐度下降，與息肉Hp（-）組相比，息肉Hp（+）組Oribacterium、Lachnoanaerobaculum 豐度上升，其與早期大腸癌、反流性食管炎等消化系統(tǒng)疾病密切相關(guān)［12-14］。與健康組相比，息肉Hp（+）組非致病菌豐度下降，如Achromobacter、Glycocaulis、Nesterenkoni 等豐度下降，其常在健康者體內(nèi)作為常駐菌被檢出。通過(guò)PICRUST 功能預(yù)測(cè)可知息肉Hp（+）組與息肉Hp（-）組菌群代謝通路差異明顯。主要表現(xiàn)在息肉Hp（+）組與幽門螺桿菌相關(guān)的致病代謝與炎癥通路明顯上調(diào)，如非同源端接上調(diào)，該機(jī)制受感染調(diào)節(jié)，幽門螺桿菌感染引起過(guò)多的DNA 損傷，為了維持基因組完整性，胃上皮細(xì)胞通過(guò)該通路進(jìn)行完整的DNA 損傷修復(fù)（DDR）［15］；同時(shí)，維生素B6 生物合成酶被認(rèn)為是細(xì)菌中的新型毒力因子，維生素B6 代謝上調(diào)加速幽門螺桿菌的糖基化鞭毛合成和鞭毛運(yùn)動(dòng)［16］。綜上可知，幽門螺桿菌感染使胃息肉患者致病菌豐度上升，常駐菌豐度下降，同時(shí)影響胃息肉患者胃部菌群的代謝，加劇了炎癥反應(yīng)，因此胃息肉患者需進(jìn)行Hp 檢測(cè)，若為陽(yáng)性，需要積極治療。

與息肉Hp（-）組相比，健康組菌群之間存在更多的正向邊與負(fù)向邊關(guān)系，菌群之間的相關(guān)性節(jié)點(diǎn)更多，說(shuō)明菌群之間的競(jìng)爭(zhēng)與協(xié)作的關(guān)系更加復(fù)雜，微生態(tài)穩(wěn)定性更高。而胃息肉者的菌群之間的相關(guān)性節(jié)點(diǎn)變少，菌群作用關(guān)系減弱。在感染幽門螺旋桿菌后，菌群群落之間的聯(lián)系進(jìn)一步下降，競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系減少，復(fù)雜程度降低。組間進(jìn)行差異結(jié)果表明：息肉Hp（-）組Catonella、Granulicatella 屬豐度下降，他們通常在人體口腔、胃腸道黏膜上共生［17］；而Novosphingobium、Caulobacter、Dietzia、Bradyrhizobium 等與疾病相關(guān)的優(yōu)勢(shì)菌屬升高，如Novosphingobium 與胃腸道疾病有關(guān)［18］，Dietzia 牙髓感染密切相關(guān)［4］。本研究表明胃息肉患者微生態(tài)紊亂后，致病菌豐度升高，常駐菌豐度下降。

本次研究發(fā)現(xiàn)，Lachnoanaerobaculum 在健康組、息肉Hp（-）組、息肉Hp（+）組相對(duì)豐度依次升高。而檢測(cè)到的優(yōu)勢(shì)菌門、菌屬與既往的研究中的優(yōu)勢(shì)菌并不相同，如嗜鹽單胞菌屬既往的研究少有報(bào)道。從胃液菌群門水平的研究表明，胃息肉患者的菌群豐度發(fā)生改變，與既往的門水平無(wú)變化的結(jié)果不同［19］，原因可能與本次研究主要針對(duì)南方人群有關(guān)，與先前針對(duì)的北方人群不同［20］，提示在研究胃微生態(tài)時(shí)主要注意地域差異。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析，表明胃息肉患者胃液微生態(tài)發(fā)生了紊亂，生物多樣性受到影響，菌-菌的作用關(guān)系趨向簡(jiǎn)單，抵御致病菌群的能力下降，同時(shí)幽門螺桿菌作為一個(gè)致病因素會(huì)進(jìn)一步加重胃息肉患者的微生態(tài)紊亂。

本研究有以下局限性：本研究樣本量有限，分配給亞組的樣本數(shù)量相對(duì)較少，研究結(jié)論有待更大樣本量的研究進(jìn)一步驗(yàn)證；此外，本研究只分析了胃細(xì)菌，真菌或病毒及其變化的影響需要進(jìn)一步研究。