微管蛋白的甘氨酸化修飾及功能研究進展*

羅亨宇 楊旌鴻 候垚順 李志勇# 繆朝玉△

（海軍軍醫(yī)大學(xué)，1 藥理學(xué)教研室，2 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員16隊，3 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員11隊，上海 200433）

微管（microtubule）是真核細胞骨架的基本成分，是由alpha/beta微管蛋白（α/β-tubulin）二聚體組成的中空管狀結(jié)構(gòu)，該二聚體結(jié)構(gòu)在進化上高度保守，在不同物種間高度相似。微管在細胞中發(fā)揮著多種關(guān)鍵功能，是決定細胞極性、細胞形態(tài)及細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵，它們既能形成有絲分裂和減數(shù)分裂的紡錘體，還可以聚集形成一些特殊的結(jié)構(gòu)，如軸絲（纖毛和鞭毛的主干）、中心粒（中心體的核心結(jié)構(gòu)）以及血小板的邊緣帶等。

結(jié)構(gòu)保守的微管蛋白能承擔(dān)細胞多種功能，主要原因是其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)可受多種機制的調(diào)控。其中，微管蛋白翻譯后修飾是一種重要的調(diào)控方式[1]，包括alpha微管蛋白的去酪氨酸化、40位賴氨酸的乙?；端的谷氨酸化和甘氨酸化等，這些修飾可以選擇性地調(diào)控微管的功能，主要機制包括直接控制微管的力學(xué)性質(zhì)和穩(wěn)定性以及調(diào)節(jié)與微管相關(guān)蛋白（MAPs）的相互作用，這些發(fā)現(xiàn)推動了“微管蛋白編碼”觀點的提出[2]。1994 年，在草履蟲的微管蛋白中發(fā)現(xiàn)了多聚甘氨酸化修飾[3]，自此以后甘氨酸化修飾的研究方法日臻成熟，實驗研究取得新的進展，特別是發(fā)現(xiàn)了負責(zé)調(diào)控甘氨酸化的酶，使人們對甘氨酸化的調(diào)控機制有了更深入的了解。此外，隨著遺傳修飾、顯微鏡方法等技術(shù)的發(fā)展[4]，甘氨酸化與疾病的聯(lián)系也在逐步顯現(xiàn)。現(xiàn)就微管蛋白甘氨酸化修飾的研究進行回顧梳理和展望。

1 微管蛋白甘氨酸化修飾

在哺乳動物中，微管蛋白甘氨酸化主要是由與谷氨酸化修飾酶同家族的微管蛋白酪氨酸連接酶類似酶系（tubulin tyrosin ligase-like，TTLL）催化[5]。甘氨酸化的起始分支和延伸由不同的酶催化：其起始分支，即第一個甘氨酸通過異肽鍵與微管蛋白C端的谷氨酸位點相連，由TTLL3[6]和TTLL8催化；延伸，即后續(xù)的甘氨酸通過與上一個甘氨酸殘基的γ羧基形成肽鍵或異肽鍵逐個加入，由TTLL10催化[5]。人TTLL10中心結(jié)構(gòu)的2個氨基酸突變導(dǎo)致其在人體沒有活性[5]，目前這一改變僅在人類發(fā)現(xiàn)[7]。直接催化去甘氨酸化的酶至今還未被發(fā)現(xiàn)，盡管有研究表明胞質(zhì)羧肽酶家族部分成員可能具有去甘氨酸化的功能[8]，但需要進一步實驗來驗證。

微管蛋白甘氨酸化的檢測常通過特異性抗體進行。過去常用2種單克隆抗體，分別為TAP952和AXO49[9]，其中，TAP952專用于檢測微管蛋白的單甘氨酸化[10]，而AXO49用于檢測含3個及以上甘氨酸殘基的微管蛋白多聚甘氨酸化。另一種多克隆抗體polyG也可檢測4個或更多甘氨酸殘基的微管蛋白多聚甘氨酸化[11-12]。以上抗體都只能檢測運動纖毛的微管蛋白甘氨酸化[13]，而gly-pep1抗體可以檢測初級纖毛中微管蛋白翻譯后的甘氨酸化[14]。

2 微管蛋白甘氨酸化功能

2.1 微管蛋白甘氨酸化與微管穩(wěn)定性的關(guān)系

微管甘氨酸化可以通過調(diào)控纖毛的穩(wěn)定性發(fā)揮生物學(xué)功能，這種翻譯后修飾調(diào)控微管穩(wěn)定性的機制，是通過改變微管蛋白C端的空間構(gòu)像和理化性質(zhì)，進而改變C端的旋轉(zhuǎn)半徑和結(jié)合結(jié)構(gòu)，以此穩(wěn)定微管與纖毛，從而維持纖毛正常功能。

事實上微管蛋白C端的空間構(gòu)像和理化性質(zhì)對于微管的功能和穩(wěn)定具有重要的意義。微管蛋白二聚體由一個緊密折疊的“身體”和無序的帶負電的C端構(gòu)成[16]，C端的變化可在不干擾微管二聚體之間的聚合界面的情況下，調(diào)整微管的生物物理特性及其與細胞效應(yīng)器的相互作用[17]。C端的柔韌性和大回轉(zhuǎn)半徑有可能增加與其他分子在各種方向上發(fā)生接觸的概率，從而增加關(guān)聯(lián)率[18]。微管通過改變微管蛋白二聚體C端，表現(xiàn)出的“動態(tài)不穩(wěn)定性”，賦予它們生長和收縮的特性[15]，令微管在細胞分裂、分化和運動等過程中發(fā)揮功能。

而微管蛋白翻譯后的甘氨酸化修飾就發(fā)生在C端的尾部，具有穩(wěn)定微管的作用。甘氨酸化通過穩(wěn)定微管來參與控制纖毛長度的現(xiàn)象，在運動纖毛的軸絲[6，9]、精子鞭毛[5]和光感受器的連接纖毛[19]中都曾被發(fā)現(xiàn)。微管的甘氨酸化水平通過下列機制引起纖毛長度的改變[14]：甘氨酸是中性氨基酸，可使微管蛋白的凈負電荷保持穩(wěn)定，減少帶正電的MAPs與微管的相互作用，下調(diào)帶正電的微管相關(guān)蛋白spastin等對微管的切割，增加微管穩(wěn)定性，維持纖毛長度。

2.2 微管蛋白甘氨酸化與谷氨酸化的關(guān)系

微管蛋白甘氨酸化對谷氨酸化具有抑制作用，抑制作用的主要機制是它與谷氨酸化修飾的位點相同，可以通過與谷氨酸化競爭相同的修飾位點抑制谷氨酸化。

谷氨酸化主要作用是增加微管蛋白局部凈負電荷，促進C端與馬達蛋白和MAPs相互反應(yīng)。因此谷氨酸化是介導(dǎo)微管分離的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素，它通過為C端增加凈負電荷的方式調(diào)節(jié)帶正電荷的微管相關(guān)蛋白spastin切斷微管，具體作用取決于微管蛋白二聚體中谷氨酸化修飾添加的谷氨酸的數(shù)量：未超過8個谷氨酸時，它會增強spastin的活性，降解微管；反之，會對spastin發(fā)揮抑制作用[21]。有研究顯示中心體微管蛋白高度谷氨酸化，且spastin和katanin含量較高[22]，因此這種機制可能在中心體起關(guān)鍵作用。

3 微管蛋白甘氨酸化與疾病

在人體中，纖毛異?？蓪?dǎo)致廣泛的病理學(xué)改變，通常稱為纖毛病[23]。微管蛋白翻譯后修飾在維持纖毛結(jié)構(gòu)和功能中具有重要作用[24]。由于甘氨酸化[25]對微管與纖毛結(jié)構(gòu)具有重要調(diào)節(jié)作用，其缺乏也是纖毛病的危險因素之一。微管甘氨酸化在小鼠實驗中顯示有利于運動纖毛的完整性[7]和初級纖毛長度的控制[14]，在人類細胞中可能亦有類似作用。

3.1 微管蛋白甘氨酸化與中樞神經(jīng)退行性變

在中樞神經(jīng)中，微管多聚谷氨酸化水平異常增高，可導(dǎo)致神經(jīng)退行性改變。甘氨酸化通過競爭性抑制微管蛋白的谷氨酸化，使得多聚谷氨酸化反應(yīng)過度積聚的情況得以緩解或避免，進而在中樞神經(jīng)的退行性改變中起到保護作用[27]。

去甲?；窩CP1的基因突變可導(dǎo)致小鼠Purkinje細胞退行性變（pcd）[26]，這種小鼠的微管蛋白多聚谷氨酸化過度積聚，特別是在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生變性的區(qū)域[27]。其機制可能是通過調(diào)節(jié)微管切斷酶spastin的活性影響微管穩(wěn)定[28]。甘氨酸化由于可以通過減少谷氨酸化為微管C端增加的凈負電荷，進而下調(diào)微管切斷酶spastin的活性，從而起到保護作用。此外，多聚谷氨酸化可以通過促進微管相關(guān)蛋白與微管的結(jié)合降低微管的穩(wěn)定性[28-29]，但目前關(guān)于神經(jīng)元內(nèi)多聚谷氨酸化的分子機制尚不明確，與之相關(guān)的甘氨酸化的分子機制也尚待闡明。

3.2 微管蛋白甘氨酸化與視網(wǎng)膜退行性變

在視網(wǎng)膜中，甘氨酸化酶TTLL3的缺失會導(dǎo)致視網(wǎng)膜微管蛋白甘氨酸化的缺失，使得連接纖毛數(shù)量下降，感光細胞谷氨酸化水平升高，連接纖毛中谷氨酸化-甘氨酸化失衡，進而導(dǎo)致視網(wǎng)膜退行性改變。

光感受器中微管的谷氨酸化首先發(fā)生在基底體內(nèi)，而后伴隨著連接纖毛的組裝完成，而甘氨酸化隨著連接纖毛的組裝而逐漸產(chǎn)生，并且在感光細胞2外節(jié)快速生長后完成[19]。甘氨酸化酶TTLL3基因敲除小鼠模型顯示，甘氨酸化水平下降而谷氨酸化水平升高，光感受器進行性退化，這與人類的視網(wǎng)膜緩慢退化的過程類似[30]。另有研究表明，甘氨酸酶TTLL3基因的突變足以誘導(dǎo)感光細胞緩慢退化，連接纖毛縮短[31]，Müller膠質(zhì)細胞大量活化，視網(wǎng)膜應(yīng)激[32-33]以及光感受器細胞凋亡增加。

視網(wǎng)膜中的甘氨酸化與谷氨酸化相互抑制。這在pcd小鼠模型發(fā)生的視網(wǎng)膜變性中得以發(fā)現(xiàn)[34]：pcd小鼠的甘氨酸化酶TTLL3水平正常，但其感光細胞中的高谷氨酸化也會減少甘氨酸化，進而導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性。關(guān)于兩者平衡影響視網(wǎng)膜的具體機制，多個研究認為可能與連接纖毛中的鞭毛內(nèi)轉(zhuǎn)運部分功能障礙有關(guān)[34-38]，而這其中的酶機制還有待進一步研究。

3.3 微管蛋白甘氨酸化與結(jié)直腸癌

在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中，TTLL3減少導(dǎo)致的結(jié)直腸上皮組織中微管蛋白甘氨酸化缺乏，會減少初級纖毛的數(shù)量，降低初級纖毛對Wnt信號通路的抑制作用，增加結(jié)腸上皮細胞的增殖，從而增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險。

TTLL3是結(jié)腸中催化微管甘氨酸化的唯一酶，也是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中重要的調(diào)節(jié)因素[39]。有實驗顯示原發(fā)性結(jié)直腸癌和其轉(zhuǎn)移瘤中TTLL3的表達顯著下調(diào)，而良性結(jié)直腸腫瘤中TTLL3的表達水平與正常結(jié)腸組織相似。這個結(jié)果表明，人類結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展與TTLL3表達水平下調(diào)有關(guān)[40]。具體原因在于，TTLL3的下調(diào)、丟失或失活會導(dǎo)致結(jié)腸細胞微管甘氨酸化的降低或缺失，并直接導(dǎo)致初級纖毛的減少或丟失；而初級纖毛的數(shù)量與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有直接關(guān)聯(lián)：初級纖毛對Wnt信號的傳遞具有抑制作用，其數(shù)量的減少可以促進Wnt信號的傳遞[40]，Wnt信號越強則結(jié)腸上皮細胞的增殖能力越強，結(jié)腸癌易感性越高[41-42]。

隨著微管蛋白甘氨酸化在結(jié)直腸癌中作用的發(fā)現(xiàn)與證實，以及機制的逐漸闡明，提出了微管蛋白甘氨酸化、初級纖毛相關(guān)的新治療策略。有研究顯示將腫瘤細胞中初級纖毛的恢復(fù)作為一種治療策略[43]，這種策略是未來關(guān)于微管蛋白甘氨酸化研究的方向之一，其臨床應(yīng)用還需要進一步探索。此外，甘氨酸化酶TTLL3也是結(jié)直腸癌治療的潛在靶點之一。

3.4 微管蛋白甘氨酸化與精子運動障礙

在精子中，微管蛋白甘氨酸化水平的降低，可導(dǎo)致精子軸絲內(nèi)動力蛋白臂的構(gòu)象異常，使得精子的鞭毛擺動活動異常，精子無法直線游動，進而可導(dǎo)致雄性生育力下降。微管蛋白甘氨酸化修飾對保持精子的正常結(jié)構(gòu)和功能是必需的。

最近的一項研究表明[44]，在微管蛋白甘氨酸化2種關(guān)鍵酶TTLL3和TTLL8均被敲除的小鼠中，微管蛋白甘氨酸化完全消失。盡管這種小鼠沒有重大缺陷，呼吸道等部位的運動纖毛以及精子的鞭毛依然存在，但隨后發(fā)現(xiàn)雄鼠生育力下降，且精子主要沿環(huán)形路線游動，無法正常直線游動。采用計算機輔助精子分析，顯示原因主要在于精子鞭毛運動的紊亂。利用低溫電子斷層掃描進一步探究機制，顯示微管蛋白甘氨酸化缺失導(dǎo)致精子鞭毛的外運動蛋白臂（outer dynein arm，ODA）和內(nèi)運動蛋白臂（inner dynein arm，IDA）超微結(jié)構(gòu)受到擾亂。ODA和IDA是精子軸向動力蛋白，是鞭毛運動的必要結(jié)構(gòu)，其中ODA主要控制鞭毛擺動的幅度和頻率，而IDA控制波形[45]。ODA和IDA超微結(jié)構(gòu)的擾亂導(dǎo)致鞭毛擺動的幅度減小，而頻率增加，波形也發(fā)生扭曲，進而導(dǎo)致了精子活動的異常。

事實上人類的精子數(shù)量相對于小鼠往往更少[46]，而直線游動又是精子在女性生殖道中到達卵母細胞的關(guān)鍵條件，因此微管蛋白甘氨酸化的缺乏可能導(dǎo)致男性的不育。這一發(fā)現(xiàn)表明微管蛋白甘氨酸化對維持正常精子運動功能至關(guān)重要，也為后續(xù)針對男性不育的研究提供了新的角度。

3.5 微管蛋白甘氨酸化與其他疾病

目前的研究表明，微管蛋白甘氨酸化可能與其他疾病有潛在的關(guān)聯(lián)。例如最近的一項研究表明[47]，微管蛋白甘氨酸化在運動纖毛中可以增強基底體對細胞的附著，從而促進運動纖毛的規(guī)律擺動，這可以增強呼吸道對粘液的清除，因此微管蛋白甘氨酸化的缺乏可能與呼吸道疾病的發(fā)生相關(guān)。

盡管目前關(guān)于微管蛋白甘氨酸化的研究還主要集中于運動纖毛中的甘氨酸化，但隨著gly-pep1抗體被發(fā)現(xiàn)可以用來檢測初級纖毛存在的翻譯后甘氨酸化修飾[21]，未來會逐漸深入關(guān)于初級纖毛中甘氨酸化的研究。因此，在其他富含微管以及微管蛋白翻譯后修飾的組織或生命活動中，如血小板、肌細胞、細胞有絲分裂等[48-51]，關(guān)于微管蛋白甘氨酸化的功能及其調(diào)控機制將被進一步闡明。

目前，對于微管蛋白甘氨酸化的酶、體內(nèi)相關(guān)功能有了較為詳細的研究，而其在體內(nèi)作用的具體機制也隨著免疫標(biāo)記等技術(shù)的發(fā)展逐步得以闡明，研究也表明了這種翻譯后修飾與一些疾病的關(guān)聯(lián)。但是，對于微管蛋白去甘氨酸化的酶至今沒有得到證實，因此微管蛋白甘氨酸化水平的調(diào)控機制仍有待進一步研究[52-53]。這種修飾與疾病的關(guān)聯(lián)為相關(guān)研究提供了新的方向，關(guān)聯(lián)的具體機制可以通過進一步的研究加以證實，這些關(guān)聯(lián)機制中的特殊結(jié)構(gòu)可以作為新的靶點，用來研發(fā)治療相關(guān)疾病的新方法新策略，例如，初級纖毛有望成為癌癥治療新靶點[39]。此外，微管蛋白甘氨酸化因其明確的酶和重要的功能，也可能作為關(guān)聯(lián)疾病檢測標(biāo)志物，得以轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用。在轉(zhuǎn)化過程中，多學(xué)科交叉的、精確結(jié)構(gòu)的研究和分析不可或缺，這也為以后的研究提出了新的挑戰(zhàn)。