射血分?jǐn)?shù)保留型心力衰竭動物模型的研究進(jìn)展

李慧穎，繆 榮，肖湖南，白永懌，劉宏斌

1 解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心 心血管內(nèi)科，國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100853；2 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；3 北京衛(wèi)戍區(qū)朝陽第六離職干部休養(yǎng)所 門診部，北京 100027

自2016 年美國心臟病學(xué)會和歐洲心臟病學(xué)會將心力衰竭(以下簡稱心衰)分為射血分?jǐn)?shù)減低型心 衰(heart failure with reduced ejection fraction，HFrEF)、射血分?jǐn)?shù)中間值的心衰(heart failure with mid-range ejection fraction，HFmrEF)和射血分?jǐn)?shù)保留型心衰(heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF)以來，HFpEF 的發(fā)生率逐年增加，已發(fā)展成為心衰的最主要類型，臨床上半數(shù)以上的心衰為HFpEF[1]。起初人們認(rèn)為HFpEF 是以高血壓、心肌肥厚和舒張功能障礙為特征的循環(huán)功能障礙，而目前來看，HFpEF 綜合了心、肺、血管、腎、脂肪組織、骨骼肌、免疫和炎癥等多系統(tǒng)功能紊亂[2-3]，有高血壓、心肌缺血、肥胖、糖尿病、血脂異常和衰老等方面的病因[4]。由于復(fù)雜的病理生理學(xué)特點(diǎn)、表型異質(zhì)性和自然發(fā)病史，HFpEF 的治療一直無較大突破[5]，而建立符合人類HFpEF 發(fā)病機(jī)制的動物模型成為揭示新的信號通路和潛在治療靶點(diǎn)的關(guān)鍵。本文將從壓力負(fù)荷相關(guān)動物模型、缺血模型和代謝功能障礙模型方面對HFpEF 實(shí)驗(yàn)動物模型的建立進(jìn)行綜述，為實(shí)驗(yàn)動物模型的選擇提供參考。

1 壓力負(fù)荷相關(guān)HFpEF 動物模型

早期的HFpEF 模型多模擬壓力負(fù)荷機(jī)制，這類模型動物的收縮壓升高，心臟后負(fù)荷增加，心肌肥厚且纖維化，心室舒張功能降低，心肌血流儲備受損，其早期左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)基本在正常范圍，雖然壓力負(fù)荷模型后期難免轉(zhuǎn)為HFrEF，但此類模型體現(xiàn)了HFpEF 的基本病因，再聯(lián)合其他要素則更貼合實(shí)際的HFpEF。常見的壓力負(fù)荷模型有Dahl 鹽敏感(Dahl salt-sensitive，Dahl/SS)大鼠模型、自發(fā)高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)模型、主動脈縮窄(transverse aortic coarctation，TAC)模型、腎性高血壓模型、激素相關(guān)的壓力負(fù)荷模型等。

1.1 Dahl/SS 大鼠 Dahl/SS 大鼠由SD 大鼠近親繁殖而來[6]，是遺傳性高血壓大鼠，同時(shí)也是常用的心衰動物模型。糖酵解代謝增強(qiáng)、氧化解偶聯(lián)異常、細(xì)胞外基質(zhì)的改變、動脈內(nèi)皮功能和心肌血流儲備受損、細(xì)胞凋亡增強(qiáng)是其發(fā)生HFpEF 的機(jī)制[7]。該方式無須手術(shù)，主要優(yōu)點(diǎn)是能夠模擬HFpEF 患者壓力負(fù)荷下發(fā)病的慢性進(jìn)程，缺點(diǎn)是容易轉(zhuǎn)為HFrEF[8-9]，需要經(jīng)胸超聲或介入手段監(jiān)測心臟功能障礙的變化。建模方法簡單，正常飲食(0.3%氯化鈉)喂養(yǎng)Dahl/SS 大鼠至7 周齡，而后轉(zhuǎn)用高鹽飼料(8%氯化鈉)喂養(yǎng)至13～14 周齡可建立HFpEF 模型[10-11]，此時(shí)心臟超聲證實(shí)其心肌肥大，舒張功能障礙，而左心室容量、LVEF未發(fā)生變化。此類模型適于HFpEF 心肌纖維化、室性心律失常、內(nèi)皮功能障礙、炎癥等方面的研究[11-15]。

1.2 SHR SHR 是Wistar-Kyoto(WKY)高血壓大鼠的近交系，高血壓自發(fā)率100%，是常用的原發(fā)性高血壓及心衰的嚙齒類實(shí)驗(yàn)動物[16]。從4～6 周齡開始，SHR 血壓逐漸升高，最高可達(dá)180～220mmHg (1mmHg=0.133)，16 周以后高血壓的相關(guān)并發(fā)癥形成，并且出現(xiàn)HFpEF 的心臟結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[17]，28～51周齡的衰老SHR 大鼠的舒張功能障礙發(fā)生進(jìn)展性改變，而左心室收縮功能保留，52～53 周齡的SHR 大鼠其心內(nèi)膜下膠原合成和沉積明顯增加，心電圖體現(xiàn)心肌缺血[18]。Holjak等[16]對SHR 種群建立近60 年來的表型改變進(jìn)行了系統(tǒng)評價(jià)，認(rèn)為目前的SHR 品系較以往世代能更好地模擬HFpEF 向心性肥厚的特點(diǎn)，適于相關(guān)的藥理學(xué)研究。但該模型對溫度、濕度、清潔度、光照等飼養(yǎng)環(huán)境要求嚴(yán)格，最初4～6 周不應(yīng)給予任何應(yīng)激刺激，乳鼠可飼喂用雞蛋和奶粉做成的蛋糕，后續(xù)飼養(yǎng)過程中也要防止肺部感染。

1.3 TAC 相關(guān)模型 TAC 誘發(fā)高血壓心肌肥厚和心衰的方法始于1991 年，通過在主動脈弓部用線結(jié)扎法形成精確的定量縮窄，達(dá)到限制血流、增加室內(nèi)壓的目的。成模過程以小鼠為例，選用9～10 周齡雄性小鼠，重度縮窄(28 G)后2～3周即可發(fā)展為心衰，中度縮窄(27 G)后4～6 周也可以發(fā)展為心衰[19]；縮窄部位也可選用腹主動脈等部位[20]。目前TAC 與醋酸去氧皮質(zhì)酮(deoxycorticosterone acetate，DOCA)慢性刺激共同誘導(dǎo)的小鼠模型較多地用于基礎(chǔ)研究[21-23]。此類模型早期呈現(xiàn)向心性肥厚和舒張功能障礙，心肌血流儲備減少、冠狀動脈內(nèi)皮功能減弱、能量代謝異常，后期亦會發(fā)生心室擴(kuò)大、室壁變薄和射血分?jǐn)?shù)減低，故術(shù)后應(yīng)及時(shí)、定期地進(jìn)行心臟超聲等監(jiān)測。Wallner 等[24-25]對2 月齡雄性美國短毛貓的主動脈進(jìn)行部分結(jié)扎，持續(xù)壓力負(fù)荷4 個(gè)月后呈現(xiàn)HFpEF 特點(diǎn)，并有NT-proBNP 水平升高、肺動脈高壓和肺功能受損，更好地體現(xiàn)了HFpEF 的心肺功能特征。該方法也可用于建立小型豬等大型動物的HFpEF 模型。

1.4 腎性高血壓模型 由Page[26]最早提出的腎外包繞是常用的腎性高血壓建模方式，建模方法為手術(shù)準(zhǔn)備并鈍性分離動物腎以后，用玻璃紙、乳膠薄膜、絲綢、火棉膠等材料繞腎門將腎交叉包繞。腎外包繞引起腎周圍炎，在腎外逐漸形成一層纖維素鞘膜，壓迫腎實(shí)質(zhì)，造成腎缺血，激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)，進(jìn)而引起血壓升高和舒張功能障礙。建模時(shí)可對模型動物進(jìn)行單側(cè)或雙側(cè)腎包繞，模型動物可選用鼠、豬、犬甚至靈長類動物等[27]。Munagala 等[28]率先用此模型進(jìn)行了針對HFpEF 的大動物研究，研究表明雙側(cè)腎包繞導(dǎo)致老年犬的動脈僵硬度增加，并且與左心室質(zhì)量增加和纖維化有關(guān)。此類模型進(jìn)展較慢，適合長時(shí)間深入的以及衰老相關(guān)因素的研究。此外有單側(cè)腎全部或部分切除的造模方式，如Primessnig等[29]切除雄性Wistar 大鼠單側(cè)腎大部(5/6)建立慢性腎功能不全和HFpEF 模型，此外也有造成腎動脈狹窄的腎性高血壓建模方式[30]。該類模型左心室肥大，左心室松弛時(shí)間常數(shù)延長，左心室舒張末期壓力增加，肺質(zhì)量增加(肺淤血)，NT-proBNP 增加，左心室收縮功能保留，符合HFpEF 的臨床特點(diǎn)，但手術(shù)操作相對復(fù)雜。

1.5 激素相關(guān)的壓力負(fù)荷模型

1.5.1 單純激素誘導(dǎo)的壓力負(fù)荷模型目前較少應(yīng)用 腎上腺素對心臟β 腎上腺素能受體的長期慢性刺激以及血管緊張素/鹽皮質(zhì)激素對血管平滑肌、水鈉平衡的長期影響是此類模型的建模機(jī)制。早期Mori 等[31]通過皮下埋植微量滲透泵釋放血管緊張素Ⅱ[1.5 mg/(kg·d)]或苯腎上腺素[40 mg/(kg·d)]的方式，使得9 周齡雄性C57BL/6 小鼠出現(xiàn)向心性肥厚和舒張功能障礙，而其收縮功能正常；其研究表明激素通過cyclin-CDK/Rb/E2F 信號通路引起丙酮酸脫氫酶激酶4 上調(diào)進(jìn)而抑制葡萄糖氧化可能是HFpEF 的發(fā)病機(jī)制之一。另有研究采用皮下釋放低劑量AngⅡ[0.2 mg/(kg·d)]的方法來建立前臨床階段的HFpEF 小鼠模型[32]。

1.5.2 激素聯(lián)合其他壓力因素可加速誘導(dǎo)HFpEF模型 激素聯(lián)合其他因素可加快成模時(shí)間，如上文提到的DOCA 與TAC 共同誘導(dǎo)的動物模型，又如DOCA 聯(lián)合單側(cè)腎切除并給予等滲鹽水加速壓力負(fù)荷的嚙齒類動物模型等[27]。鹽皮質(zhì)激素DOCA通常通過皮下埋植微量滲透泵的方式給藥，聯(lián)合其他壓力負(fù)荷因素可使模型動物加速呈現(xiàn)心臟肥厚和纖維化、E/E’升高、等容松弛時(shí)間常數(shù)增加等舒張功能障礙。

1.5.3 激素聯(lián)合代謝因素可更好地模擬HFpEF 的臨床特征 給予長白豬DOCA(100 mg/kg) 90 d，同時(shí)給予其“西方飲食”(高鹽、高脂肪、高膽固醇、高糖)，可誘導(dǎo)建立HFpEF 大動物模型[33-34]。后續(xù)又有DOCA 和西方飲食基礎(chǔ)上聯(lián)合Ang Ⅱ(0.015 mg/h，微量泵)建立的成年雌性長白豬模型[35-36]以及DOCA 和西方飲食誘導(dǎo)的雌性哥根廷小型豬模型[37]等。這種激素聯(lián)合其他因素誘導(dǎo)的方式可在壓力負(fù)荷的基礎(chǔ)上模擬代謝綜合征因素，與臨床上HFpEF 多器官疾病共存的特點(diǎn)更相符，對嚙齒類動物同樣適用。

2 缺血模型

通過各種方式造成心肌缺血的動物模型可在一定程度上模擬HFpEF 的病理特征。上文提及的腎上腺素誘導(dǎo)法即可導(dǎo)致心肌耗氧增加和心肌相對缺血[38]，激素誘導(dǎo)的缺血模型可操作性強(qiáng)，周期短，大小型動物均適用，但不能精確定位梗死區(qū)域，與臨床心肌缺血有一定差異。冠狀動脈結(jié)扎法可模擬大鼠等動物的心肌缺血。中大型動物可利用Ameroid 縮窄環(huán)套于其冠狀動脈外、冠狀動脈左前降支內(nèi)注入微栓塞球、左心室內(nèi)注射月桂酸鈉等方式來構(gòu)建缺血模型[39]。上述動物模型操作復(fù)雜、造價(jià)高、死亡率高，且常發(fā)展為HFrEF，可用于HFpEF 心肌缺血亞型的建模。

3 代謝綜合征模型

糖尿病、高血壓、肥胖、高脂血癥以及肺、腎等器官的功能不全常同時(shí)存在，在此基礎(chǔ)上發(fā)展而成的HFpEF 一定是多種因素促成的，近年來HFpEF 動物模型逐漸向代謝綜合征方向發(fā)展。

3.1 高脂血癥、肥胖和糖尿病模型能夠體現(xiàn)HFpEF 的代謝特點(diǎn)

3.1.1 高脂血癥和肥胖模型 脂質(zhì)堆積和肥胖與高血壓、心肌缺血、心肌代謝紊亂密切相關(guān)。薛禮美等[40]嘗試?yán)肏FD 喂養(yǎng)新西蘭白兔3 個(gè)月建立HFpEF 模型，此造模方法簡單，但歷時(shí)長，且病理變化程度不易控制，故有研究先用HFD 引起高脂血癥，而后聯(lián)合其他方式誘導(dǎo)HFpEF。如HFD 喂養(yǎng)SHR 大鼠構(gòu)建高血脂合并高血壓的HFpEF 模型，又如HFD 聯(lián)合鏈脲佐菌素腹腔注射破壞胰腺構(gòu)建高血脂合并糖尿病HFpEF 模型。事實(shí)上，HFD 引起的脂代謝紊亂和胰島素抵抗是HFpEF 的基礎(chǔ)病理特點(diǎn)，單純高脂血癥模型應(yīng)用較少。

3.1.2 肥胖和糖尿病模型 糖尿病和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)會增加氧化應(yīng)激、促進(jìn)微血管功能障礙以及炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變，此為HFpEF 發(fā)生的重要機(jī)制[41-42]。一些基因敲除小鼠，如瘦素缺陷型ob/ob 小鼠以及瘦素受體缺陷的db/db 小鼠，既存在攝食過量、肥胖、高血糖、高胰島素血癥和胰島素抵抗的特征，又存在HFpEF 的病生理特點(diǎn)。db/db 小鼠9 周齡開始呈現(xiàn)出左心質(zhì)量和室壁厚度增加的特點(diǎn)，同時(shí)伴有活性氧產(chǎn)生增加、心肌間質(zhì)纖維化，類似于糖尿病心肌??；5 月齡呈現(xiàn)出左心室舒張壓最大下降速率下降的特點(diǎn)，此時(shí)經(jīng)胸心臟超聲可以證實(shí)其心臟收縮功能保留，而等容舒張時(shí)間延長，E/A 下降，與舒張性心衰的特征一致[43]。Monma 等[44]發(fā)現(xiàn)20 周齡的db/db 小鼠e’、E/e’、舒張末期壓力容量關(guān)系、左心室松弛時(shí)間常數(shù)等舒張功能相關(guān)指標(biāo)皆較同窩出生的對照組仔鼠(db/+)惡化，但其射血分?jǐn)?shù)保留。ob/ob 小鼠也是一種肥胖和糖尿病動物模型，其左心室舒張功能發(fā)生障礙，E/A 下降，但可能發(fā)展為糖尿病心肌病。Zucker 大鼠是肥胖和高血壓的遺傳模型，包括瘦型和肥胖型兩個(gè)亞系，其中肥胖型Zucker 大鼠(不能表達(dá)瘦素受體)的特點(diǎn)類似于人類肥胖和2 型糖尿病早期階段，且其左心室質(zhì)量和舒張功能障礙持續(xù)加重，左心室等容舒張時(shí)間延長，類似HFpEF 的特點(diǎn)。另外Zucker 肥胖糖尿病(Zucker diabetic fatty，ZDF)大鼠是肥胖型Zucker 大鼠中能夠發(fā)展為嚴(yán)重Ⅱ型糖尿病的大鼠，常合并輕度高血壓，左心室質(zhì)量增加不甚顯著，但存在舒張功能障礙；日本大冢黃褐鼠德島肥胖(Otsuka long-evans tokushina fatty，OLETF)大鼠等糖尿病模型[45-46]亦與HFpEF 特征相似。

3.2 ZSF1 大鼠是常用的HFpEF 代謝綜合征模型ZSF1 動物模型建立在上述Zucker 糖尿病大鼠之上，為目前流行的HFpEF 動物模型[47-49]。它由Zucker 糖尿病肥胖大鼠與自發(fā)高血壓心衰大鼠(由SHR 與瘦素受體基因突變的肥胖型SHR)交配而來。5 月齡的ZSF1 大鼠綜合了肥胖、高血壓、高脂血癥、左心室肥厚和舒張功能障礙、左心房擴(kuò)張、心肌纖維化、腎功能障礙、NO 信號通路減弱、大動脈硬化、運(yùn)動不耐受、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)升高等與人類頗為相似的特點(diǎn)，且其LVEF 保留[49-50]。雄性與雌性ZSF1 大鼠均可呈現(xiàn)類似HFpEF 的心臟功能障礙[51]，Goto 等[52]研究發(fā)現(xiàn)，雌性ZSF1大鼠、雌性Dahl/SS 大鼠以及雄性TAC/DOCA 誘導(dǎo)的小鼠都能體現(xiàn)LVEF 相對“保留”、左心室舒張末期內(nèi)徑增大和E/e’增大等特點(diǎn)，但32 周齡的雌性ZSF1 大鼠與人類HFpEF 重合度更高，體現(xiàn)在其骨骼肌組織與人類HFpEF 患者在肌萎縮相關(guān)蛋白標(biāo)志物表達(dá)(泛素蛋白酶體系統(tǒng)中的肌肉特異性環(huán)指蛋白1 以及自噬信號通路中的蛋白LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值)、線粒體代謝(琥珀酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、孔蛋白表達(dá))方面特征類似，而另外兩類模型動物則不能呈現(xiàn)出這些人類組織相似點(diǎn)。Franssen 等[53]的研究發(fā)現(xiàn)，ZSF1 肥胖大鼠與人類HFpEF 都存在冠狀動脈微血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活和氧化應(yīng)激。因此在研究HFpEF 運(yùn)動不耐受特征的骨骼肌表現(xiàn)、心臟微循環(huán)代謝、線粒體代謝等生理機(jī)制時(shí)更傾向于用此模型。

3.3 HFD 與NOS 抑制劑共同誘導(dǎo)的“雙重打擊”模型迅速流行 2019 年Schiattarella 等[54]闡述了一種新的HFpEF 造模方法，他們利用HFD(60%脂肪功能)和充足的Nω-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽(Nω-nitro-L-arginine methylester hydrochloride，L-NAME)飲水(0.5 g/L)，使得C57BL/6N 小鼠模擬了HFpEF 的眾多代謝特征：HFD 導(dǎo)致體質(zhì)量增加、糖耐量下降；L-NAME 為NOS 抑制劑，會引起內(nèi)皮功能障礙性血壓升高、動脈僵硬度增加、冠狀動脈內(nèi)皮功能受損、冠狀動脈血流儲備減少。HFD + L-NAME 組模型小鼠有心肌肥大、心肌纖維化、心臟舒張功能惡化并伴有肺充血，甚至運(yùn)動耐量下降的特點(diǎn)，非常接近真實(shí)的HFpEF。事實(shí)上，L-NAME 更多地抑制了模型動物 的 內(nèi) 皮 型NOS(endothelial NOS，eNOS)，其iNOS 的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平反而有所上升，而HFpEF 患者和ZSF1 肥胖大鼠也有心血管系統(tǒng)iNOS 水平的升高。Schiattarella 等[54]利用此模型揭示了iNOS 誘導(dǎo)的IRE1α-Xbp1s 通路失調(diào)可能是HFpEF 的發(fā)病機(jī)制。此造模方式簡單，成模時(shí)間短(5～15 周內(nèi)HFpEF 表型得到展現(xiàn))，模型穩(wěn)定(超聲心動圖顯示HFD + L-NAME 處理組的LVEF 保留時(shí)間長達(dá)1 年)。陳驍楠等[55]參照此方法建立了HFpEF 模型，他們給予8 周齡雄性和雌性C57BL/6J 小鼠60%高脂飲食以及0.5 g/L 的L-NAME 飲水，16 周齡模型小鼠組的E/A 比值、E/E'比值和左心室整體長軸應(yīng)變均較同性別對照組高，24 周齡模型組小鼠的LVEF 仍與對照組保持一致，且呈現(xiàn)出心肌細(xì)胞肥大、心肌間質(zhì)纖維化和左心室重構(gòu)的基本特征。此動物模型的缺點(diǎn)是不能模擬HFpEF 患者高容量和高鹽負(fù)荷的特點(diǎn)，進(jìn)行相關(guān)機(jī)制研究時(shí)應(yīng)注意NOS 抑制劑在促進(jìn)內(nèi)皮功能障礙和炎癥因素的同時(shí)打破了氧化與亞硝基化的平衡。

3.4 HFD 聯(lián)合衰老和壓力因素的“多重打擊”模型可更好地模擬HFpEF 的慢性發(fā)病機(jī)制 Deng 等[56]高脂飲食喂養(yǎng)3 月齡小鼠13 個(gè)月，并在最后1 個(gè)月時(shí)向其腹腔內(nèi)注入去氧皮質(zhì)酮新戊酸酯(DOCP，75 mg/kg)來加速高血壓和系統(tǒng)炎癥，從而建立高脂、衰老和鹽皮質(zhì)激素“三重打擊”HFpEF 模型。此模型呈現(xiàn)病理性心肌肥厚、舒張功能不全、高血壓、內(nèi)皮依賴性血管舒張功能減弱、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)增加、運(yùn)動耐量下降、膠原沉積增加、間質(zhì)纖維化增加、肺質(zhì)量增加、回心血量下降、心排血量下降等特點(diǎn)，但其LVEF 維持不變；該團(tuán)隊(duì)利用此模型證實(shí)β 羥基丁酸能夠減少NLPR3 炎性小體的生成、減輕線粒體高度乙?；?、改善HFpEF 心肌纖維化。Withaar等[57]于2021 年建立了高脂-衰老-血管緊張素Ⅱ“三重打擊”模型，即給予18～22 月齡的老年C57BL/6J 小鼠HFD 3 個(gè)月，同時(shí)在給予HFD 的最后1 個(gè)月經(jīng)皮下微量滲透泵給予血管緊張素Ⅱ[1.25 mg/(kg·d)]，從而使小鼠表現(xiàn)出HFpEF 的特點(diǎn)；該團(tuán)隊(duì)利用此模型探究了利拉魯肽和達(dá)格列凈對HFpEF 的藥用價(jià)值。融合了衰老因素的模型喂養(yǎng)時(shí)間長，但適合血管內(nèi)皮和微循環(huán)、炎癥、心肌重塑和衰老相關(guān)病理機(jī)制的研究。

4 結(jié)語

壓力負(fù)荷是經(jīng)典的HFpEF 造模方式，但單純高血壓心肌肥厚不再是最常見的HFpEF 表型，壓力負(fù)荷聯(lián)合肥胖、糖尿病等代謝因素的復(fù)合模型更優(yōu)；代謝功能障礙模型更貼近HFpEF 的特征，是目前主要發(fā)展方向。不同階段的HFpEF 生物學(xué)表現(xiàn)差異顯著，目前沒有任何一種模型能夠完美模擬人類HFpEF 的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程，研究者應(yīng)結(jié)合研究目標(biāo)選用相應(yīng)的誘導(dǎo)方式以得到合適表型。HFpEF 治療相關(guān)的研究應(yīng)在不同的動物模型中均有效，包括一些與人類更貼近的大動物模型。