熒光重組酶介導(dǎo)等溫擴(kuò)增快速檢測食品中沙門氏菌

黃新新，何宇平*，樊彥莉，趙勇，曾靜，鄭秋月

1. 上海海關(guān)動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心（上海 200135）；2. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院（上海 201306）；3. 中國海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心（北京 100026）；4. 大連民族大學(xué)（大連 116600）

沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌，據(jù)統(tǒng)計，在世界各國的細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。沙門氏菌引起的食物中毒主要表現(xiàn)為惡心、痙攣性腹痛、嘔吐腹瀉、全身發(fā)熱等癥狀[1]。在進(jìn)出口食品及魚粉等飼料中，沙門氏菌也是必檢項目，因此沙門氏菌作為一項重要的食品檢測指標(biāo)在公共衛(wèi)生領(lǐng)域被重點關(guān)注。與傳統(tǒng)檢測方法費時費力不同，分子檢測技術(shù)正受到越來越多的應(yīng)用和研究。然而普通PCR、熒光PCR存在需要電泳或是設(shè)備較大，只能在實驗室使用，無法進(jìn)行現(xiàn)場檢測；LAMP技術(shù)具有特異性不高，容易污染等缺點。

重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增技術(shù)（recombinaseaided amplification，RAA），是一種可使微量核酸在體外高效快速擴(kuò)增的新技術(shù)。重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列，并使其退火解鏈。單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）與單鏈結(jié)合形成D型結(jié)構(gòu)，DNA聚合酶啟動DNA合成，對模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。與傳統(tǒng)PCR及等溫擴(kuò)增技術(shù)相比較，其最顯著的優(yōu)勢是在25～43 ℃條件下，5～20 min內(nèi)觀察到檢測結(jié)果，且操作簡單、設(shè)備成本低廉。目前重組酶等溫擴(kuò)增技術(shù)已取得長足的發(fā)展，并被應(yīng)用在病毒、細(xì)菌、轉(zhuǎn)基因、食品安全等多個檢測領(lǐng)域[2-6]。研究開發(fā)一種用于檢測沙門氏菌的RAA技術(shù)，旨在滿足口岸實驗室及現(xiàn)場檢測的靈敏、簡便、快速和低成本的要求。

1 材料與方法

1.1 菌株

特異性測試包括包含性測試和排外性測試。包含性測試所用菌株為鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、副傷寒沙門氏菌A T C C 9 1 5 0、豬霍亂沙門氏菌ATCC7001、腸炎沙門氏菌ATCC17036、腸炎沙門氏菌ATCC49216、傷寒沙門氏菌CMCC50071；排外性測試所用菌株包括單增李斯特菌ATCC7644、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯氏ATCC13883、產(chǎn)氣腸桿菌ATCC13048、大腸埃希氏菌ATCC29522、金黃色葡萄球菌ATCC6538、糞腸球菌ATCC49452、溶血性鏈球菌ATCC21059、阪崎腸桿菌ATCC29544。除傷寒沙門氏菌CMCC50071購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心，其余均購自美國ATCC菌株保藏中心。8株沙門氏菌分離株S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7和S9從實驗室食品中分離鑒定，所有菌株-80 ℃保存于10%甘油肉湯中。

1.2 儀器與試劑

RAA-1620熒光RAA檢測儀（江蘇奇天基因生物科技有限公司）；高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）。熒光RAA擴(kuò)增試劑盒（江蘇奇天基因生物科技有限公司）；細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；緩沖蛋白胨水（BPW）、營養(yǎng)肉湯、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株復(fù)蘇

從甘油凍存管中取100 μL菌液接種到5 mL腦心浸液培養(yǎng)肉湯中，在37 ℃條件下，按150 r/min振蕩過夜。

1.3.2 細(xì)菌DNA制備

取1 mL細(xì)菌培養(yǎng)物至1.5 mL EP離心管，按12 000 r/min離心10 min，收集菌液，棄上清液。按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒方法提取細(xì)菌DNA。于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 引物設(shè)計

從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得沙門氏菌invA序列，根據(jù)RAA引物、探針設(shè)計原則設(shè)計熒光RAA引物和探針序列。引物、探針由上海生工生物工程有限公司合成，具體序列見表1。

表1 沙門氏菌RAA擴(kuò)增的引物探針

1.3.4 引物的篩選

將兩條正向引物與兩條反向引物互相組合，與探針形成四個組合，對引物和探針的濃度進(jìn)行最佳配比篩選，通過熒光信號值的大小以及反應(yīng)時間篩選最佳引物、探針組合。

1.3.5 反應(yīng)溫度的優(yōu)化

RAA反應(yīng)液包括正反向引物各2.1 μL（10 μmol/L）、探針0.6 μL（10 μmol/L），2×反應(yīng)緩沖液25 μL，ddH2O及DNA模板17.7 μL，最后加入2.5 μL乙酸鎂，充分混勻。將RAA反應(yīng)液在不同溫度（30，35，39和42 ℃）中進(jìn)行反應(yīng)，確定最佳擴(kuò)增溫度。

1.3.6 引物探針濃度的優(yōu)化

在探針終濃度為120 nmol/L時，將引物終濃度分別稀釋為100，200，300和400 nmol/L；引物終濃度為200和400 nmol/L時，對應(yīng)的探針終濃度分別稀釋為100，200，300和400 nmol/L進(jìn)行擴(kuò)增，比較最佳擴(kuò)增效果時引物探針濃度。

1.3.7 特異性檢測

鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028以及其余的5株沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株：副傷寒沙門氏菌ATCC9150、豬霍亂沙門氏菌ATCC7001、腸炎沙門氏菌ATCC17036、腸炎沙門氏菌ATCC49216、傷寒沙門氏菌CMCC50071；以及8株沙門氏菌分離株S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7和S9；另外包括單增李斯特菌ATCC7644、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯氏ATCC13883、產(chǎn)氣腸桿菌ATCC13048、大腸埃希氏菌ATCC29522 、金黃色葡萄球菌ATCC6538、糞腸球菌ATCC49452、溶血性鏈球菌ATCC21059、阪崎腸桿菌ATCC29544等菌株純培養(yǎng)物按1.3.2小節(jié)提取DNA模板后進(jìn)行熒光RAA檢測，驗證方法特異性。

1.3.8 靈敏度檢測

挑取營養(yǎng)瓊脂平板上新鮮生長的沙門氏菌ATCC14028單菌落接種于LB肉湯中，24 h后依次吸取1 mL菌懸液于9 mL LB肉湯中，制成10倍梯度稀釋液。分別取100 μL菌液涂布于平板上，于37±1 ℃培養(yǎng)24～48 h，對不同梯度菌液進(jìn)行計數(shù)。從每個稀釋度管子中取1 mL菌懸液提取DNA，進(jìn)行RAA反應(yīng)。

1.3.9 基質(zhì)中檢測限檢測

收集按照GB 4789.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏氏菌檢驗》檢測為無沙門氏菌污染的牛肉樣品。以比濁法確定最初的菌液濃度為3×108CFU/mL，進(jìn)行10-1～10-10稀釋。稱取25 g上述樣品，向其中添加不同稀釋度的沙門氏菌純菌液。取1 mL提取DNA做增菌前熒光RAA擴(kuò)增檢測。將人工污染的樣品加到225 mL BPW預(yù)增菌培養(yǎng)基中，置36 ℃條件下培養(yǎng)18 h，取1 mL預(yù)增菌液加入到10 mL四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液中。42 ℃條件下分別培養(yǎng)2和24 h后，采集1 mL培養(yǎng)液，提取DNA模板，用熒光RAA法擴(kuò)增觀察結(jié)果。所有做熒光RAA檢測的樣品同時利用GB 4789.4—2016標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行檢測。

1.3.10 實際樣品檢測

按照GB 4789.4—2016對上海市售的肉類、冰鮮等50份進(jìn)行增菌后，提取基因組DNA，采用建立的熒光RAA方法進(jìn)行檢測，同時采用GB 4789.4—2016中推薦的傳統(tǒng)劃線培養(yǎng)方法進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門氏菌熒光RAA方法建立及優(yōu)化

2.1.1 擴(kuò)增溫度優(yōu)化

分別選擇30，35，39和42 ℃作為擴(kuò)增溫度，測試沙門氏菌RAA擴(kuò)增效果差異。結(jié)果表明，39 ℃時擴(kuò)增熒光度最高，故最佳擴(kuò)增溫度為39 ℃。

2.1.2 RAA不同引物探針濃度優(yōu)化

經(jīng)過優(yōu)化，探針終濃度120 nmol/L時，引物濃度為200 nmol/L時擴(kuò)增信號最好；而在引物濃度不變的情況下，隨著探針濃度的升高，擴(kuò)增信號也隨之上升，故選擇最佳引物終濃度為200 nmol/L、探針終濃度為400 nmol/L。

2.1.3 不同引物探針組合篩選測試

由圖1～圖4可見，F(xiàn)3R4P3（圖1）引物探針對擴(kuò)增的熒光度最高，在3×102CFU/mL時熒光度依舊有13 500 mV，因而選擇F3R4P3組合。

圖1 引物探針F3R3P3 RAA測試結(jié)果

圖2 引物探針F3R4P3 RAA測試結(jié)果

圖3 引物探針F4R3P3 RAA測試結(jié)果

圖4 引物探針F4R4P3 RAA測試結(jié)果

綜上所述，最后確定的熒光RAA最佳反應(yīng)條件為：緩沖液25 μL、上下游引物（10 μM）各1 μL、探針（10 μM）2 μL、乙酸鎂2.5 μL、DNA模板2 μL、純化水16.5 μL，混勻離心分裝至熒光基礎(chǔ)反應(yīng)單元中，輕柔手彈使凍干粉充分重溶均勻，短暫離心。向每個反應(yīng)單元的管蓋上加入2.5 μL乙酸鎂，然后向各反應(yīng)單元加入DNA模板，充分混勻并離心，將反應(yīng)管放入熒光檢測儀中39 ℃，反應(yīng)30 min。

2.2 特異性測試

圖5為引物探針F3R4P3對不同菌株擴(kuò)增的效果圖。利用該引物探針組合對所有沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028；副傷寒沙門氏菌ATCC9150；豬霍亂沙門氏菌ATCC7001；傷寒沙門氏菌CMCC50071；腸炎沙門氏菌ATCC17036；腸炎沙門氏菌ATCC49216）均能擴(kuò)增出熒光信號，其余非沙門氏菌的9株細(xì)菌及無菌水均沒有擴(kuò)增出信號，表明引物探針F3R4P3特異性很好（圖5）。利用該引物探針對8株試驗分離沙門氏菌株進(jìn)行擴(kuò)增，也均能擴(kuò)增出熒光信號（結(jié)果未顯示），表明該引物探針可適用于沙門氏菌的檢測。

圖5 沙門氏菌RAA特異性反應(yīng)結(jié)果

2.3 靈敏度測試

圖6表明，沙門氏菌以引物探針組合F3R4P3進(jìn)行RAA擴(kuò)增，靈敏度可達(dá)3×101CFU/mL。

圖6 沙門氏菌以引物探針F3R4P3進(jìn)行RAA靈敏度測試

2.4 基質(zhì)中檢出限測試

牛肉樣品中人工污染不同濃度的沙門氏菌BPW增菌18 h后，再接種TTB二次增菌。BPW增菌前RAA擴(kuò)增檢測限為3×103CFU/mL（結(jié)果未顯示），但經(jīng)過TTB第2次增菌只需2 h后，RAA對牛肉中沙門氏菌的檢出限即可達(dá)到原始添加濃度的3×10-2CFU/mL（圖7），傳統(tǒng)劃線培養(yǎng)法檢出限為3 CFU/mL；TTB增菌24 h后，RAA對牛肉中沙門氏菌的檢出限為3×10-2CFU/mL，擴(kuò)增值比TTB增菌2 h更高（圖8），傳統(tǒng)劃線培養(yǎng)法檢出限才達(dá)到3×10-1CFU/mL。由此可見，RAA靈敏度明顯高于傳統(tǒng)劃線培養(yǎng)法。而且相較于傳統(tǒng)培養(yǎng)法需要24 h后才能觀察結(jié)果，RAA反應(yīng)時間只需10～30 min，因而檢測更為快速簡便。

圖7 牛肉TTB增菌2 h后RAA擴(kuò)增結(jié)果

圖8 牛肉TTB增菌24 h后RAA擴(kuò)增結(jié)果

2.5 樣品中沙門氏菌的實際檢測

按照GB 4789.4—2016對市售的牛肉（15份）、雞肉（15份）、三文魚（10份）和巴沙魚（10份）共50份進(jìn)行前處理增菌后，提取基因組DNA，采用建立的RAA方法進(jìn)行檢測，同時采用GB 4789.4—2016中推薦的傳統(tǒng)劃線培養(yǎng)方法進(jìn)行檢測，結(jié)果表明1份牛肉和2份雞肉RAA方法檢測結(jié)果陽性，與國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4—2016檢測結(jié)果一致。

3 討論與結(jié)論

RAA技術(shù)發(fā)展至今，在微生物領(lǐng)域得以廣泛應(yīng)用。有學(xué)者應(yīng)用RT-RAA法檢測甲型流感病毒、中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV），檢測甲型流感病毒靈敏度100拷貝/mL、MERS-CoV假病毒顆粒陽性標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度10拷貝/mL，高于實時熒光RT-PCR方法（102拷貝/mL）；檢測時間（20 min）大大低于實時熒光RT-PCR（90 min）[7-8]，此外也有應(yīng)用于沙門氏菌、乙型溶血性鏈球菌檢測等的報道[6,9]。

引物組合的篩選對確定最佳RAA反應(yīng)條件至關(guān)重要，研究對沙門氏菌的2條上游引物F3、F4和2條下游引物R3、R4進(jìn)行了兩兩組合篩選，四組結(jié)果差異明顯，最終確定引物F3R4結(jié)合探針P3為最佳組合。此外RAA引物探針濃度尤其是探針濃度對擴(kuò)增靈敏度影響非常大，使用普通濃度的探針，靈敏度通常只有103～104CFU/m；而每50 μL反應(yīng)體系含2 μL（10 μmol/L）以上探針，即探針終濃度提高到400 nmol/L時，靈敏度可達(dá)到101～102CFU/mL，能很好地滿足檢測的需求。研究使用該探針濃度，對沙門氏菌純菌的檢測靈敏度達(dá)到3 CFU/mL。相比于Hong等[6]應(yīng)用RPA方法檢測沙門氏菌，靈敏度高出2個數(shù)量級。

實際檢測食品樣品時，沙門氏菌不僅含量少，而且通常情況下受消毒、熱加工及輻射等處理影響，常處于受損狀態(tài)，另外食品基質(zhì)也會影響檢測的靈敏度。在研究中，沙門氏菌純菌的靈敏度達(dá)3×101CFU/mL，但在牛肉、巴沙魚等食品基質(zhì)中則只有3×103CFU/mL，因而需要預(yù)增菌。經(jīng)TTB增菌2 h后熒光RAA的檢測靈敏度即達(dá)到原始菌添加濃度的3×10-2CFU/mL。相比于國標(biāo)法需TTB增菌24 h后再觀察結(jié)果，其速度及靈敏度顯著勝出。

重組酶等溫擴(kuò)增技術(shù)填補了傳統(tǒng)培養(yǎng)和依賴溫度設(shè)備技術(shù)以外的空缺，為現(xiàn)場或低資源環(huán)境中檢測沙門氏菌等食源性微生物提供了一種簡便、快速、特異靈敏的方法。這種新技術(shù)對在現(xiàn)場和非實驗室環(huán)境實現(xiàn)即時檢測，具有潛在優(yōu)勢。