新疆牛、羊和駱駝源產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌的系統(tǒng)進(jìn)化分群、血清群與毒力基因及耐藥性分析

佟盼盼，張萌萌，陳文霞，劉璐瑤，張 凌，唐雪林，蘇戰(zhàn)強(qiáng)，謝金鑫

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌(Shiga toxin-producingE.coli，STEC)是全球公認(rèn)的食源性致病菌，人類(lèi)感染后可引起無(wú)血性腹瀉、出血性結(jié)腸炎(hemorrhagic colitis，HC)、溶血性尿毒癥綜合征(hemolytic uremic syndrome，HUS)及血小板減少性紫癜(thrombocytopenic purpura，TTP)等[1]，不同毒力基因的組合與致病力密切相關(guān)[2]。

STEC的主要毒力因子志賀毒素(Shiga toxin，Stx)由噬菌體上的stx編碼，可抑制宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，包括stx1和stx2，其中stx1基因由3個(gè)亞型(stx1a、stx1c和stx1d)組成，stx2基因由7個(gè)亞型(stx2a～stx2g)組成[3]。不同亞型或亞型組合可能與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)[3-4]。流行病學(xué)研究表明，產(chǎn)生stx2a-、stx2c-和stx2d-的STEC菌株往往比攜帶其他stx亞型的菌株更頻繁地從HC和HUS患者中分離出來(lái)[5]。另一個(gè)重要的毒力因子緊密黏附素由其毒力島LEE上的eae基因編碼，介導(dǎo)細(xì)菌定殖和黏附到宿主腸細(xì)胞上，在發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[6]。此外，溶血素基因(hlyA)也與STEC的致病性密切相關(guān)，常與腹瀉病和HUS相關(guān)[7-8]。這些毒力因子以單一或多種組合形式構(gòu)成一種特定病原體的毒力特征。

STEC主要通過(guò)糞-口途徑傳播，食用未經(jīng)煮熟的肉制品、未洗凈的蔬菜和未經(jīng)巴氏滅菌的乳制品是人類(lèi)感染STEC的最主要途徑[9-10]。2017年，歐盟報(bào)告了6 073例STEC感染病例，據(jù)分析，相較于O157非O157血清群感染比例有所增加[11]。牛是STEC的天然宿主，但研究發(fā)現(xiàn)羊、駱駝等反芻動(dòng)物也是STEC的攜帶者[12-13]。在國(guó)內(nèi)，有關(guān)非O157 STEC在牛、牦牛和綿羊上流行的報(bào)道較多，而關(guān)于駱駝源分離株的報(bào)道尚不多見(jiàn)[14-16]。本研究收集牛、羊和駱駝源非O157 STEC菌株，對(duì)其進(jìn)行大腸埃希菌系統(tǒng)進(jìn)化分群、血清群、毒力基因及耐藥性分析，評(píng)估這些STEC潛在的風(fēng)險(xiǎn)，為STEC監(jiān)測(cè)和分子流行病學(xué)研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株

2018—2019年，從新疆烏魯木齊、阿勒泰、伊犁、哈密、巴音郭楞蒙古自治州(巴州)、阿克蘇、喀什及和田的養(yǎng)殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)和市場(chǎng)收集牛、羊和駱駝糞便、肛拭子和胴體樣品共2 312份，經(jīng)分離鑒定獲得94株非O157 STEC(表1)，用含有終濃度15%甘油的生理鹽水保菌，并儲(chǔ)存于-80 ℃，從最初分離限次傳代以確保其遺傳穩(wěn)定性。

表1 94株牛、羊和駱駝源非O157 STEC分離株的背景信息Table 1 Background information of 94 non-O157 STEC isolates from cattle,sheep and camels

1.2 主要試劑

Thermo PCR反應(yīng)試劑(2×Taq PCR Green Mix)和Gelgreen(Biotium)購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；藥敏片購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限責(zé)任公司；EC肉湯、腦心浸液肉湯(BHI)、麥康凱培養(yǎng)基(MAC)、MH肉湯和MH瓊脂購(gòu)自青島海博生物科技有限公司；藥敏質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC 25922由本實(shí)驗(yàn)室保存。系統(tǒng)進(jìn)化分群、血清群及毒力基因引物均由上海生工生物工程科技服務(wù)有限公司合成。

1.3 系統(tǒng)進(jìn)化分群

將保存的STEC在BHI中復(fù)蘇，劃線(xiàn)接種MAC平板，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，取單菌落煮沸裂解制備DNA。按照Clermont等[17]報(bào)道的方法對(duì)非O157 STEC分離株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化群(A、B1、B2、C、D、E和F)。第一步是四重PCR擴(kuò)增chuA、yjaA、arpA、TSPE4.C2基因片段，根據(jù)結(jié)果分為A或C、D或E、B1、C、F、B2和E群。當(dāng)四重PCR不能區(qū)分A和C或D和E群時(shí)，通過(guò)第二步PCR擴(kuò)增trpAgpC或ArpAgpE基因片段進(jìn)一步確定C或E群。

四重PCR反應(yīng)體系：12.5 μL Taq Master Mix，1 μL細(xì)菌DNA模板，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，加入ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 10 s，57 ℃(E群)或59 ℃(四重組和C群)20 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.4 O血清群鑒定

參照文獻(xiàn)[18]采用多重PCR(E.coliO-genotyping PCR)篩選O血清群，用162對(duì)引物建立20個(gè)多重PCR組(6～9對(duì)引物/組)，擴(kuò)增條帶大小明顯不同。PCR混合物包含10 μL 5 × GoldStar PCR Buffer，1 μL 10 mmol·L-1dNTP Mix，2.5 U GoldStar Best DNA聚合酶，每條引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，3 μL 細(xì)菌DNA模板，加入ddH2O至50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.5 毒力基因檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[19]報(bào)道的序列和PCR條件，合成毒力基因eae和hlyA引物，以?xún)煞N基因各自測(cè)序菌株為陽(yáng)性對(duì)照，以大腸埃希菌ATCC 25922為陰性對(duì)照。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將eae和hlyA陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)BLAST分析測(cè)序結(jié)果并統(tǒng)計(jì)各菌株毒力基因的攜帶情況。

1.6 志賀毒素基因亞型檢測(cè)

采用Scheutz等[3]所述的PCR方法檢測(cè)stx1和stx2基因亞型，包括stx1a、stx1b、stx1c、stx2a、stx2b、stx2c、stx2d、stx2e、stx2f、stx2g。以10種基因各自測(cè)序菌株為陽(yáng)性對(duì)照，以大腸埃希菌ATCC 25922為陰性對(duì)照。三重PCR擴(kuò)增stx1亞型，反應(yīng)體系：12.5 μL Master mix，stx1a、stx1c和stx1d上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，1.5 μL細(xì)菌DNA模板，加入ddH2O至25 μL。多重PCR擴(kuò)增stx2亞型，包括10 μL 5×GoldStar PCR Buffer，1 μL 10 mmol·L-1dNTP Mix，2.5 U GoldStar Best DNA聚合酶，每條引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，2 μL細(xì)菌DNA模板，加入ddH2O至50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。為明確同時(shí)攜帶stx23個(gè)亞型的菌株，在66 ℃下進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.7 藥物敏感性試驗(yàn)

參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)[20]，以大腸埃希菌ATCC 25922為質(zhì)控菌株，采用K-B紙片法對(duì)94株STEC進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)。18種藥敏片：氨芐西林、哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林-他唑巴坦、氨芐西林-舒巴坦、慶大霉素、阿米卡星、復(fù)方新諾明、氯霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、鏈霉素、四環(huán)素和多黏菌素B。將菌株接種于MH平板，37 ℃，培養(yǎng)16～18 h。挑取單菌落接種于2 mL MH培養(yǎng)基中，37 ℃，培養(yǎng)4～5 h。無(wú)菌棉簽蘸取菌液均勻涂布在MH平板上，用滅菌鑷子夾取藥敏片貼于平板上，倒置，37 ℃，培養(yǎng)16～18 h，記錄結(jié)果。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，將對(duì)三類(lèi)(每類(lèi)中一種或以上)或三類(lèi)以上抗菌藥物同時(shí)耐藥的菌株判定為多重耐藥菌[21]。

1.8 ERIC-PCR基因分型

根據(jù)Versalovic等[22]報(bào)道的方法合成ERIC-PCR引物，對(duì)不同動(dòng)物相同O血清群STEC進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：12.5 μL Taq Master Mix，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，1 μL細(xì)菌DNA模板，加入ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，56.5 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.9 菌株同源性判斷

采用BioNumerics軟件進(jìn)行UPGMA(unweighted pair group method using arithmetic averages)聚類(lèi)分析，條帶位置差異容許度選擇1.5%。優(yōu)化值選擇1.5%。如果相似性指數(shù)≥85%，則認(rèn)為菌株具有遺傳相關(guān)性[23]。

1.10 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS Statistics 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。單因素分析采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 菌株的系統(tǒng)進(jìn)化分群

94株非O157 STEC系統(tǒng)進(jìn)化分群可分為3群，分別為B1群(83/94，88.3%)、E群(7/94，7.4%)和A群(4/94，4.3%)。牛、羊及駱駝源分離株均以B1群為主(牛源52/57，91.2%；羊源24/25，96.0%；駱駝源7/12，58.3%)，E群主要為駱駝源STEC(5/7，71.4%)，4株A群屬于牛源分離株。

2.2 菌株的O血清群鑒定

94株STEC中未檢測(cè)出O157血清群，其中37株 可確定O血清群，占分離株的39.4%，共檢出9個(gè)血清群，包括O146(n=14)、O22(n=7)、O3(n=4)、O168(n=4)、O8(n=3)、O167(n=2)、O88(n=1)、O112ab(n=1)和O147(n=1)。

2.3 菌株的毒力基因及志賀毒素基因亞型檢測(cè)

部分STEC的毒力基因及stx基因亞型檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。

在94株STEC分離株中，46.8%(44株)僅攜帶stx1，6.4%(6株)僅攜帶stx2，46.8%(44株)同時(shí)攜帶stx1+stx2；80.9%(76株)攜帶hlyA，9.6%(9株)攜帶eaeA(表2)。羊源和駱駝源STEC均以攜帶stx1+hlyA為主(分別為68.0%和25.0%)，牛源STEC以攜帶stx1+stx2+hlyA為主(57.9%)。毒力基因組合stx1+stx2+eaeA(1株)和stx2+eaeA+hlyA(1株)僅存在于駱駝源STEC。1株牛源和2株駱駝源STEC攜帶stx1+stx2+eaeA+hlyA(表3)。

表2 非O157 STEC毒力基因及亞型檢測(cè)結(jié)果Table 2 Virulence genes and subtypes of non-O157 STEC

stx基因亞型檢測(cè)結(jié)果顯示，牛、羊和駱駝攜帶的stx基因亞型包括stx1a、stx1c、stx2a和stx2d(圖1c～f)。stx1a主要分布在牛源STEC中，與駱駝源相比，差異顯著(P<0.05)。stx1c主要分布在羊源STEC中，駱駝源次之，牛源最少，三者之間相比，差異顯著(P<0.05)(表3)。

表3 非O157 STEC的毒力基因譜Table 3 Virulence gene profiles of non-O157 STEC

2.4 菌株的藥物敏感性測(cè)定

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，94株非O157 STEC中14株(14.9%)為耐藥菌(表4)。對(duì)頭孢他啶、四環(huán)素、頭孢噻肟、氨芐西林、氨曲南的耐藥率為3.2%～5.3%，對(duì)復(fù)方新諾明、頭孢吡肟、哌拉西林-他唑巴坦、氨芐西林-舒巴坦、阿莫西林-克拉維酸、多黏菌素B的耐藥率為1.1%～2.1%。未檢測(cè)出多重耐藥菌，但有2株對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的多個(gè)藥物耐藥。

表4 14株非O157 STEC的耐藥表型Table 4 Drug resistance phenotypes of 14 non-O157 STEC isolates

2.5 菌株的ERIC-PCR基因分型結(jié)果

對(duì)24株血清群為O8、O22和O146的牛、羊和駱駝源STEC進(jìn)行ERIC-PCR基因分型，可分為A、B和C3簇，以B簇為主，各簇之間相似性指數(shù)≥ 85%，親緣關(guān)系較近(圖2)。不同地區(qū)相同或不同動(dòng)物源的菌株存在相同的指紋圖譜，如YS10(羊)和TS12(羊)，AC10(駱駝)、UB18(牛)和YS10(羊)。同一地區(qū)從牛場(chǎng)糞便、肛拭子到胴體拭子來(lái)源的菌株也存在相同的指紋圖譜。如UB8(糞便)、UB40(肛拭子)和UB12(胴體拭子)。

a.hlyA；b.eaeA；c.stx1a；d.stx1c；e.stx2a；f.stx2d；1～3.STEC分離株；4.陽(yáng)性對(duì)照；M.DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；N.陰性對(duì)照a.hlyA;b.eaeA;c.stx1a;d.stx1c;e.stx2a;f.stx2d;1-3.STEC isolates;4.Positive control;M.DNA marker;N.Negative control圖1 hlyA、eaeA、stx1a、stx1c、stx2a和stx2d基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR products of hlyA,eaeA,stx1a,stx1c,stx2a and stx2d genes

3 討 論

本研究對(duì)新疆牛、羊和駱駝源非O157 STEC進(jìn)行了相對(duì)全面的分析。系統(tǒng)進(jìn)化分群顯示牛、羊和駱駝源非O157 STEC均以B1群為主，這與國(guó)外報(bào)道的牛、羊和駱駝源非O157 STEC的分群結(jié)果一致[21-23]。本研究共鑒定出9個(gè)血清群，其中5個(gè)血清群O8、O22、O88、O147和O167分布于駱駝源STEC，表明駱駝源STEC攜帶的O血清群更多樣化。在牛上經(jīng)常發(fā)現(xiàn)O血清群未知的STEC[24]，本研究中O血清群未知的STEC也主要集中于牛源分離株(71.9%，41/57)。據(jù)2017年歐盟的報(bào)告顯示，在羊源STEC中O157、O146和O38血清群最為常見(jiàn)，其中O157、O146可引起人類(lèi)感染[11]，本研究中羊源STEC以O(shè)146血清群為主，應(yīng)引起足夠的重視。薛濤等[14]在江蘇某牛場(chǎng)發(fā)現(xiàn)STEC分離株的優(yōu)勢(shì)血清型為O4、O26和O93，顧叢叢等[16]在江蘇某羊場(chǎng)發(fā)現(xiàn)STEC分離株的優(yōu)勢(shì)血清型為O93，表明不同省份動(dòng)物源STEC攜帶優(yōu)勢(shì)O血清型不同。

TET.Tetracycline;AMP.Ampicillin;TZP.Piperacillin-Tazobactam;CAZ.Ceftazidime;AZM.Ammonia-tronan;STX.Cotrimoxazole;CTX.Cefotaxime;PB.Polymyxin B;A/C.Amoxicillin-Clavulanate;FEP.Cefepime;SAM.Ampicillin-Sulbactam圖2 非O157 STEC的ERIC-PCR 基因分型及UPGMA聚類(lèi)分析Fig.2 Results of ERIC-PCR genotyping and UPGMA clustering of non-O157 STEC

STEC的致病性及其導(dǎo)致的臨床癥狀與毒力基因密切相關(guān)[25]。臨床上經(jīng)常從腹瀉或HUS患者中分離到同時(shí)攜帶eae和stx2基因的STEC，eae基因與引起人類(lèi)HUS疾病的STEC菌株關(guān)系密切[24]。本研究中1株駱駝源STEC同時(shí)攜帶eae和stx2基因，且eae基因在駱駝源STEC中的檢出率最高(P<0.05)，然而關(guān)于駱駝源STEC毒力和致病性的研究相對(duì)較少。本研究中羊源STEC均未攜帶eae基因，在江蘇羊源STEC分離株中也很少出現(xiàn)eae基因[16]。作者發(fā)現(xiàn)牛源STEC的毒力基因譜最為多樣化(占所有毒力組合的80%)，且以攜帶stx1+stx2+hlyA(57.9%)為主(表2)，表明stx編碼的噬菌體在牛上廣泛傳播。本研究中，stx1a主要分布于牛源STEC，stx1c主要分布于羊源STEC，表明不同stx基因亞型可能與宿主動(dòng)物種類(lèi)相關(guān)。stx2基因是從HUS患者分離的STEC中發(fā)現(xiàn)的最普遍的毒素基因型，但攜帶不同stx2亞型的STEC與HUS的相關(guān)性存在顯著差異[5]，其中stx2a和stx2d與HC、HUS關(guān)系密切[26-27]。本研究中，stx2a主要分布于牛源分離株，stx2d常見(jiàn)于牛、羊源STEC[28]，41.7%駱駝源STEC攜帶stx2d(5/12)，表明駱駝也是stx2d的儲(chǔ)存庫(kù)。

近年來(lái)，動(dòng)物源非O157 STEC的耐藥性逐漸增強(qiáng)，本研究中STEC耐藥株集中在牛源分離株上，其耐藥率(17.5%，10/57)高于先前新疆牛源非O157 STEC的耐藥率(11.5%)[29]，且50%的牛源STEC對(duì)四環(huán)素耐藥，這與Dong等[30]的研究結(jié)果一致。本研究中的STEC多對(duì)1～2種抗生素耐藥，總體上耐藥率不高，多重耐藥不嚴(yán)重(14.9%，14/94)，但這些菌株中存在對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)的多個(gè)藥物耐藥的現(xiàn)象，甚至出現(xiàn)對(duì)多黏菌素耐藥的菌株，提示在臨床上需謹(jǐn)慎用藥。ERIC-PCR技術(shù)因操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確而得到了廣泛應(yīng)用，擴(kuò)增的目的條帶為腸桿菌基因間ERIC序列，這些序列具有高度的同源性。鄭曉風(fēng)等[31]采用ERIC-PCR方法分析牛源和羊源的非O157 STEC之間的親緣關(guān)系較近。本研究利用ERIC-PCR分型結(jié)果顯示，不同地區(qū)的牛、羊和駱駝源的非O157 STEC之間親緣關(guān)系較近，預(yù)示著STEC的傳播不局限于同一地區(qū)，也可能通過(guò)動(dòng)物的轉(zhuǎn)場(chǎng)在不同地區(qū)不同物種間交叉?zhèn)鞑ァ?/p>

4 結(jié) 論

從牛、羊、駱駝的糞便、肛拭子和胴體上分離的非O157 STEC血清群豐富，毒力基因譜多樣化，且具有一定的耐藥性，這些菌株潛在感染人類(lèi)的風(fēng)險(xiǎn)，因此，不僅需要持續(xù)監(jiān)測(cè)，而且要制定干預(yù)這些菌株污染肉品的方案，從而最大限度地降低非O157 STEC感染人類(lèi)的風(fēng)險(xiǎn)。