基于靶向代謝組學(xué)研究環(huán)形泰勒蟲(chóng)對(duì)宿主細(xì)胞能量代謝的影響

李 霞，李 志，曹天行，殷 宏,3，羅建勛，關(guān)貴全,劉軍龍，趙洪喜*

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省動(dòng)物寄生蟲(chóng)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046)

環(huán)形泰勒蟲(chóng)(Theileriaannulata)是由硬蜱傳播的、能夠感染牛科動(dòng)物引發(fā)泰勒蟲(chóng)病的一種血液原蟲(chóng)，其裂殖體感染的宿主細(xì)胞可獲得類(lèi)似腫瘤細(xì)胞樣的無(wú)限增殖能力，即細(xì)胞的永生化狀態(tài)[1-2]?？固├障x(chóng)藥物布帕伐醌(BW720c)作用于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞時(shí)，可終止細(xì)胞的永生化狀態(tài)并使細(xì)胞重新進(jìn)入正常的凋亡程序。環(huán)形泰勒蟲(chóng)通過(guò)劫持宿主信號(hào)通路、調(diào)節(jié)表觀(guān)遺傳因子和轉(zhuǎn)錄程序來(lái)誘導(dǎo)白細(xì)胞的Warburg效應(yīng)幫助細(xì)胞轉(zhuǎn)化，但宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制仍不清楚。Warburg效應(yīng)主要與宿主的能量代謝相關(guān)。因此，研究BW720c對(duì)環(huán)形泰勒蟲(chóng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞能量代謝的影響，對(duì)于揭示細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制具有顯著意義。能量代謝與生物體的存活息息相關(guān)，通過(guò)基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)頂復(fù)門(mén)寄生蟲(chóng)缺少參與三羧酸循環(huán)和β-氧化代途徑所需酶的基因序列[3]。因?yàn)槿鄙龠@些代謝酶，頂復(fù)門(mén)寄生蟲(chóng)的能量代謝主要來(lái)源于糖酵解，在至少10個(gè)酶的作用下寄生蟲(chóng)將從宿主獲得的己糖催化成丙酮酸。丙酮酸在后續(xù)的酶促反應(yīng)下生成乙酰輔酶A或乳酸，脂肪酸的合成需要乙酰輔酶A作為原料。頂復(fù)門(mén)寄生蟲(chóng)不但利用宿主細(xì)胞的脂肪酸，自身也存在脂肪酸的合成，但是不同種屬之間存在差異[4]。除了糖酵解外，頂質(zhì)體也是頂復(fù)門(mén)寄生蟲(chóng)能量來(lái)源的途徑。頂質(zhì)體是除隱孢子蟲(chóng)外的頂復(fù)門(mén)寄生蟲(chóng)特有細(xì)胞器，參與蟲(chóng)體新陳代謝[5]。目前的研究證明，頂質(zhì)體是合成代謝的中樞，參與3條重要代謝途徑：2C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑、脂肪酸從頭合成途徑(FAS2)和血紅素合成途徑[7]。在瘧原蟲(chóng)的研究中發(fā)現(xiàn)，膦胺霉素靶向MEP途徑的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)可使瘧原蟲(chóng)死亡[6]。在剛地弓形蟲(chóng)中，頂質(zhì)體存在磷酸甘油酸酯變位酶(PGAM)、丙酮酸脫氫酶復(fù)合體[7]。在剛地弓形蟲(chóng)入侵宿主時(shí)，其能量獲得依賴(lài)于糖酵解過(guò)程并且葡萄糖異生和糖酵解過(guò)程中PGAM是重要的催化酶，該酶也在弓形蟲(chóng)能量代謝中參與碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)、新陳代謝調(diào)節(jié)[8]。靶向代謝組學(xué)通過(guò)對(duì)小分子代謝物的絕對(duì)定量，直觀(guān)反映藥物處理后細(xì)胞的能量代謝，有利于鑒定特征性代謝物，判斷感染細(xì)胞在藥物處理下的代謝狀態(tài)，闡明轉(zhuǎn)化發(fā)生的機(jī)制。本研究擬從靶向代謝組學(xué)的角度出發(fā)，以環(huán)形泰勒蟲(chóng)感染細(xì)胞為模型，研究轉(zhuǎn)化細(xì)胞在BW720c處理下的代謝產(chǎn)物的變化，尋找環(huán)形泰勒蟲(chóng)與宿主細(xì)胞相互作用的分子及其能量代謝變化，闡明環(huán)形泰勒蟲(chóng)引起宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的機(jī)制，為預(yù)防環(huán)形泰勒蟲(chóng)感染提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料 第17代環(huán)形泰勒蟲(chóng)裂殖體感染的牛淋巴細(xì)胞系(由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所平臺(tái)-TDRC-22資助提供)。

1.1.2 主要試劑 BW720c和DMSO由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供。rI1640(Biological Industries)、硫酸慶大霉素注射液(8萬(wàn)單位)、dimethyl sulfoxide(SIGMA)、Phosphate Buffered Saline(Biological Industries)、Foetal Bovine Serum(Biological Industries)、甲醇(Merck)、乙醇(Merck)、乙腈(Merck)、蒸餾水、牛谷氨酰胺(Gln)定量檢測(cè)試劑盒、乳酸(LA)含量檢測(cè)試劑盒及丙酮酸(PA)含量檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自河南寶格生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)、湘儀離心機(jī)(Xiangyi Yi Centrifuge Instrument Co.,Ltd)、高速離心機(jī)(Eppendorf)、-80 ℃冰箱、可調(diào)式移液器、烘箱、酶標(biāo)儀、Countstar自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(上海睿鈺生物科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的復(fù)蘇和培養(yǎng) 將第17代環(huán)形泰勒蟲(chóng)感染淋巴細(xì)胞放入37 ℃水中，1 000 r·min-1離心5 min。沉淀轉(zhuǎn)入10%胎牛血清、16 ng·μL-1慶大霉素的RPMI1640培養(yǎng)瓶，置于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 BW720c作用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)的繪制及細(xì)胞處理[9-10]將培養(yǎng)好的轉(zhuǎn)化細(xì)胞設(shè)為DMSO對(duì)照組、處理組及空白對(duì)照組。細(xì)胞濃度設(shè)為1×105cells·mL-1,處理組加入DMSO配制的200 ng·mL-1的BW720c;在DMSO對(duì)照組中加入相同體積的DMSO;空白對(duì)照組加入相同體積的RPMI1640完全培養(yǎng)基。細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，在12、24、36、48、60、72 h收集細(xì)胞，利用CountStar IC 1000軟件計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的活細(xì)胞數(shù)，繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。在72 h收集DMSO對(duì)照組與藥物組細(xì)胞樣品，每組均有6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。收集細(xì)胞之前進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，保證細(xì)胞數(shù)量在1×107個(gè)細(xì)胞左右(數(shù)量相差控制在±2倍內(nèi))。從培養(yǎng)瓶中取出細(xì)胞懸液，裝入50 mL離心管；1 200 r·min-14 ℃離心5 min，去除上清；向細(xì)胞沉淀中加入1 mL PBS洗滌去除殘余培養(yǎng)液成分，混勻后轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，900 r·min-14 ℃離心3 min，離心后去除上清，重復(fù)3遍；將細(xì)胞沉淀立即放入液氮中浸泡，淬滅24 h后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。代謝組學(xué)檢測(cè)：-80 ℃冰箱中取出細(xì)胞樣本，冰上解凍后加入500 μL預(yù)冷的提取劑(80%的甲醇水溶液，含內(nèi)標(biāo))，渦旋2 min；放入液氮中速凍5 min，冰上解凍5 min，渦旋2 min混勻，循環(huán)3次；12 000 r·min-14 ℃離心20 min；取上清液進(jìn)行LC-MS/MS分析。

1.2.3 代謝物分析 利用軟件Analyst 1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)，通過(guò)三重四極桿篩選特征離子得到離子信號(hào)強(qiáng)度(CPS)，MuLtiQuant軟件進(jìn)行積分和校正，area代表物質(zhì)相對(duì)含量。

1.2.4 多元統(tǒng)計(jì)分析及差異代謝物篩選及驗(yàn)證 將歸一化后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入R軟件(https://www.r-project.org/)，先采用無(wú)監(jiān)督的主成分分析(principal component analysis，PCA)然后采用有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析使組間區(qū)分最大化，尋找差異代謝物。選取fold change≥2和fold change≤0.5，VIP≥1的代謝物為差異代謝物。

1.2.5 部分差異代謝物的驗(yàn)證 應(yīng)用購(gòu)自河南寶格生物技術(shù)有限公司的試劑盒進(jìn)行代謝物檢測(cè)。首先制備試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和吸光度制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并將細(xì)胞含量調(diào)到1×106個(gè)，后按照試劑盒操作步驟測(cè)量吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方式計(jì)算相應(yīng)的含量。并用PraghPad Prism 8軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及含量。

2 結(jié) 果

2.1 BW720c處理后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)的繪制

CountStar IC 1000軟件計(jì)算活細(xì)胞數(shù)獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)(圖1)；發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，24 h內(nèi)細(xì)胞數(shù)沒(méi)有明顯差異，36 h以后試驗(yàn)組的細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯低于對(duì)照組，72 h組間的差異最大。表明BW720c對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖有顯著抑制，這為后續(xù)能量代謝檢測(cè)提供了依據(jù)。

圖1 BW720c作用后環(huán)形泰勒蟲(chóng)(TA)轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.1 Growth curve of T. annulta (TA)transformed cells treated with BW720c

2.2 代謝物總離子圖分析與代謝物鑒定

對(duì)兩組細(xì)胞樣品的總離子流圖(TIC圖)進(jìn)行可視化檢查(圖2)，樣品儀器分析信號(hào)強(qiáng)、峰容積大且保留時(shí)間重復(fù)性好。將檢測(cè)到的質(zhì)譜結(jié)果與MWDB(metware database)對(duì)比，共鑒定出49種代謝物。為了進(jìn)一步篩選2組間的差異代謝物，采用多元統(tǒng)計(jì)方法獲得能量代謝的特征性代謝物。

A.MRM代謝物檢測(cè)多峰圖；B.混樣樣品質(zhì)譜分析總離子流圖A.MRM metabolite detection multi-peak diagram；B.Total ion flow diagram of mixed sample quality spectrum analysis圖2 基于MRM分析獲得的細(xì)胞總離子流圖Fig.2 A total ion chromatograms(TIC)of cells analyzed by MRM

2.3 多元統(tǒng)計(jì)分析

2.3.1 PCA分析 本研究通過(guò)對(duì)2種細(xì)胞樣品進(jìn)行PCA分析，獲得擬合較好的PCA模型。兩個(gè)主成分占總方差的80.79%，其中第一主成分(PC1)的解釋率為61.91%；第二主成分(PC2)的解釋率為18.88%。控制組細(xì)胞(Tacon)6個(gè)樣品均在第一主成分原點(diǎn)的左側(cè)，處理組細(xì)胞(BW720c)6個(gè)樣品在第一主成分原點(diǎn)的右側(cè)，說(shuō)明2種細(xì)胞樣品在能量代謝方面的代謝物組成上有明顯差異(圖3)。

Tacon.控制組；BW720c.藥物處理組；PC1.第一主成分；PC2.第一主成分；百分比表示所占的解釋率Tacon.Control group;BW720c.Treatment group;PC1.The first principal component；PC2.The second principal component;Percentage represents explained rate圖3 2組樣品PCA得分Fig.3 PCA score plot of the two groups

2.3.2 OPLS-DA分析 為了消除不相關(guān)的噪音信息，建立了OPLS-DA模型進(jìn)一步分析空白對(duì)照組與處理細(xì)胞代謝模式的變化。OPLS-DA模型中BW720c組主要分布在原點(diǎn)的左邊部分，Tacon組分布在原點(diǎn)的右側(cè)部分，2組樣品在坐標(biāo)軸上離散度較好(圖4)。

圖4 2組樣品OPLS-DA得分圖Fig.4 OPLS-DA scores plot for two groups

置換檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖5)，OPLS-DA模型有兩個(gè)主成分，其中R2X=0.837，R2Y=0.998,Q2=0.994，R2X表示變量X的總變異，目的是為了分析模型的優(yōu)化程度；R2Y和Q2分別表示模型的解釋率和預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度，值越是接近1表明該模型越理想，對(duì)樣本具有很好的解釋率和預(yù)測(cè)率。參數(shù)>0.5顯示模型擬合較好，Q2和R2Y的P值均<0.005，表明置換檢驗(yàn)(permutation test)中沒(méi)有隨機(jī)分組模型強(qiáng)于此次模型，因此本研究建立的OPLS-DA模型可以說(shuō)明對(duì)照組與處理組之間差異變化。

圖5 2組樣品的OPLS-DA驗(yàn)證Fig.5 Permutation test of OPLS-DA model for two groups

2.3.3 差異代謝物篩選 以“1.2.4”的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異代謝物。2組樣品共篩出21種差異代謝物(表1)，選出的差異代謝物即是組間分離的標(biāo)志變量。處理組與對(duì)照組相比，有13個(gè)差異代謝物下調(diào)，8個(gè)上調(diào)(圖6)。主要包括氨基酸、核苷酸、有機(jī)酸以及酶類(lèi)等能量代謝物質(zhì)。BW720c處理可降低感染細(xì)胞L-乳酸、果糖1,6二磷酸、丙酮酸、異檸檬酸、乙酰輔酶A等成分的含量，并上調(diào)L-絲氨酸、L-天冬酰胺、谷氨酰胺、IMP、L-天冬氨酸等。糖酵解及三羧酸循環(huán)相關(guān)的差異代謝物見(jiàn)圖7。

Down.下調(diào)的代謝物；Up.上調(diào)的代謝物;Insignificant.沒(méi)有變化的代謝物Down.Down-regulated metabolites；Up:Up-regulated metabolites；Insignificant.Metabolites without change圖6 差異代謝物火山圖Fig.6 Volcano map of differential metabolites

1)己糖激酶或葡萄糖激酶；2)磷酸果糖激酶；3)磷酸甘油酸變位酶；4)丙酮酸激酶；5)丙酮酸脫氫酶系1)Hexokinase/glucokinase;2)Phosphofructokinase;3)Phosphoglyceromutase:4)Pyruvate kinase:5)Pyruvate dehydrogenase complex圖7 糖酵解及三羧酸循環(huán)的差異代謝物Fig.7 Differential metabolites in glycolysis and tricarboxylic acid cycle

表1 Tacon與BW720c組間的差異代謝物Table 1 Differential metabolites between Tacon group and BW720c group

2.3.4 部分差異代謝物的驗(yàn)證 對(duì)篩選到的谷氨酰胺、丙酮酸及乳酸進(jìn)行驗(yàn)證。首先收集藥物處理組細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，細(xì)胞的含量要達(dá)到1×106cells·mL-1。收集的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌3次，然后分別按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行代謝物的含量測(cè)定。依據(jù)檢測(cè)時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度及吸光度值(OD)，用Graphad Prim 8軟件，采用四參數(shù)Logistic曲線(xiàn)擬合(4-p1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程(圖8)。然后根據(jù)各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算對(duì)照組、藥物處理組細(xì)胞中谷氨酰胺、丙酮酸、乳酸的含量。谷氨酰胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=691.0X-192.3，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 5；丙酮酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y=0.019 60X+0.020 10，相關(guān)系數(shù)為R2為0.999 8；乳酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y=0.331 9X+0.014 41，相關(guān)系數(shù)為0.997 2。所建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，表明線(xiàn)性關(guān)系良好。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及試劑盒的含量計(jì)算公式可知每1×104個(gè)處理組細(xì)胞的谷氨酰胺含量為66.85 μmol·L-1，對(duì)照組中的含量為4.36 μmol·L-1；每1×106個(gè)處理組細(xì)胞的乳酸含量為0.4 μmol·mL-1，對(duì)照組中的含量為1.2 μmol·mL-1；處理組細(xì)胞的丙酮酸含量為44 μg·104cells-1，對(duì)照組的丙酮酸含量為74 μg·104cells-1。驗(yàn)證的代謝物含量處理組與對(duì)照細(xì)組的變化趨勢(shì)與靶向代謝組學(xué)檢測(cè)是一致的。

圖8 差異代謝物含量及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.8 Differential metabolites content and standard curve

3 討 論

3.1 BW720c處理對(duì)感染細(xì)胞氨基酸代謝的影響

環(huán)形泰勒蟲(chóng)感染可造成細(xì)胞的無(wú)限增殖，代謝重編程是其重要特征。腫瘤細(xì)胞發(fā)生代謝重編程是細(xì)胞無(wú)限增殖和侵襲的先決條件[11]。代謝重編程可滿(mǎn)足細(xì)胞異常增殖和高能量需求。甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝以及天冬氨酸和谷氨酸代謝通路在感染細(xì)胞中是異常的，藥物處理組(BW720c)L-絲氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、谷氨酰胺及賴(lài)氨酸是上調(diào)的。谷氨酰胺與葡萄糖都是癌細(xì)胞使用的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[12]，谷氨酰胺作為氮供體是核苷酸生物合成所必需的。此外谷氨酰胺作為碳源支持癌細(xì)胞能量代謝，一旦缺乏會(huì)造成癌細(xì)胞的死亡，在各類(lèi)癌癥中均觀(guān)察到此現(xiàn)象[13,16]。環(huán)形泰勒蟲(chóng)感染細(xì)胞的代謝模式類(lèi)似于腫瘤細(xì)胞，根據(jù)代謝組數(shù)據(jù)分析結(jié)果，環(huán)形泰勒蟲(chóng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞也是以谷氨酰胺作為能量來(lái)源的，轉(zhuǎn)化細(xì)胞的代謝重編程實(shí)現(xiàn)了對(duì)谷氨酰胺的有效利用。谷氨酰胺酶是癌癥治療的有效靶點(diǎn)[17-18]，谷氨酰胺酶將谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸，谷氨酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)棣?酮戊二酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)，在藥物處理后三羧酸循環(huán)受到抑制谷氨酰胺消耗減少，相對(duì)于對(duì)照組(Tacon)其含量上升，因此懷疑BW720c的有效靶點(diǎn)之一是谷氨酰胺酶。并用谷氨酰胺試劑盒檢測(cè)時(shí)也發(fā)現(xiàn)在藥物處理組中谷氨酰胺也是上調(diào)的，因此也驗(yàn)證了把谷氨酰胺酶作為進(jìn)一步的研究對(duì)象的猜想。Zhang等[19]發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中天冬酰胺的生成途徑可以挽救谷氨酰胺缺乏下的細(xì)胞生存。天冬酰胺在藥物處理之后上調(diào)，也說(shuō)明感染細(xì)胞中天冬酰胺可能因谷氨酰胺減少而加速自身合成速度來(lái)挽救細(xì)胞凋亡。癌細(xì)胞中的谷氨酰胺還可以維持氧化還原狀態(tài)，調(diào)控糖脂代謝。谷氨酰胺通過(guò)谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，LAT2是溶質(zhì)載體家族成員，F(xiàn)eng等[20]發(fā)現(xiàn)，LAT2能調(diào)節(jié)谷氨酰胺依賴(lài)的回補(bǔ)調(diào)節(jié)，因此說(shuō)明LAT2參與轉(zhuǎn)化細(xì)胞的能量代謝，可以作為研究轉(zhuǎn)化機(jī)制的新靶點(diǎn)。

3.2 BW720c處理對(duì)感染細(xì)胞糖酵解代謝的影響

Warburg[21]指出腫瘤細(xì)胞的能量代謝來(lái)源是糖酵解，糖酵解產(chǎn)生大量的乳酸。糖酵解途徑的異?；钴S使得葡萄糖代謝改變以及利用率增加，與正常細(xì)胞相比，有氧條件下腫瘤細(xì)胞的糖酵解途徑可提供的ATP占總量的50%～60%[22]。核酸、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)的合成與葡萄糖代謝有關(guān)，葡萄糖的攝取依靠細(xì)胞膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。Duan等[23]研究表明，葡萄糖向天冬氨酸轉(zhuǎn)化是腫瘤生長(zhǎng)的限制性代謝途徑。天冬氨酸是線(xiàn)粒體呼吸的關(guān)鍵產(chǎn)物，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的失活或抑制可阻止天冬氨酸的產(chǎn)生。在藥物處理組中天冬氨酸是上調(diào)的，推測(cè)環(huán)形泰勒蟲(chóng)感染細(xì)胞可能有額外的調(diào)控機(jī)制控制天冬氨酸的生成，如果BW720c的作用也是抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或使其失活，那么天冬氨酸在藥物處理組中應(yīng)該是下調(diào)的，而不是上升，這與研究結(jié)果不相符合。糖酵解途徑的最后一步磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶的催化下生成丙酮酸，Marsolier等[24]研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)形泰勒蟲(chóng)分泌的Pin1異構(gòu)酶可以穩(wěn)定宿主的2型丙酮酸激酶(PKM2)，使宿主細(xì)胞代謝重編程。PKM2在哺乳動(dòng)物中高度保守，與細(xì)胞合成代謝相關(guān)，在腫瘤細(xì)胞中有表達(dá)[25]，表達(dá)PKM2的腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)和作為異種移植物在小鼠中具備更快的增殖速度[26]。本研究中，丙酮酸與乳酸是下調(diào)的，而磷酸烯醇式丙酮酸沒(méi)有變化，因此推測(cè)PKM2的活性被抑制，這也與Marsolier的研究結(jié)果一致。在用試劑盒驗(yàn)證時(shí)發(fā)現(xiàn)在藥物處理組中丙酮酸也是下調(diào)的，但是Pin1異構(gòu)酶怎樣引起宿主細(xì)胞代謝通路改變尚不清楚。Luo等[27]發(fā)現(xiàn)PKM2通過(guò)結(jié)合癌細(xì)胞和活化的巨噬細(xì)胞中的HIF-1α轉(zhuǎn)錄因子，從而反式激活基因表達(dá)。HIF-1α、PKM2及脯氨酰羥化酶結(jié)構(gòu)域3(PHD3)結(jié)合可以使PKM2正向調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT1)、PHD3和LDHA等HIF-1α的靶基因表達(dá)。Metheni等[28]提出HIF-1α誘導(dǎo)促進(jìn)了泰勒蟲(chóng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的致瘤特性。本研究中如果GLUT1活性抑制，藥物處理細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用率降低，轉(zhuǎn)化細(xì)胞失去能量來(lái)源細(xì)胞凋亡。宿主細(xì)胞中PKM2的變化仍然不清楚，上下游通路中分子機(jī)制也不清楚,還有待進(jìn)一步的研究來(lái)闡明作用機(jī)制。

3.3 BW720c處理對(duì)感染細(xì)胞三羧酸代謝的影響

Warburg[21]認(rèn)為腫瘤細(xì)胞從線(xiàn)粒體呼吸到有氧糖酵解的改變，可能是線(xiàn)粒體受損的結(jié)果。然而，Weinhouse[29]通過(guò)同位素標(biāo)記發(fā)現(xiàn)線(xiàn)粒體氧化磷酸化產(chǎn)生的二氧化碳的數(shù)量在癌細(xì)胞中與正常細(xì)胞的一樣，現(xiàn)在人們也發(fā)現(xiàn)Warburg效應(yīng)伴隨葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸含量增加碳進(jìn)入三羧酸循環(huán)速度減慢。本研究中，藥物處理組三羧酸循環(huán)中的蘋(píng)果酸、異檸檬酸和延胡索酸是下調(diào)的，但這些代謝物是在藥物作用下通過(guò)何種途徑下調(diào)，機(jī)制還不清楚。SIRT3參與線(xiàn)粒體參與氧化應(yīng)激與能量代謝并調(diào)節(jié)癌癥發(fā)病過(guò)程，通過(guò)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)防止細(xì)胞轉(zhuǎn)化和細(xì)胞衰老[30]。在各種惡性腫瘤中SIRT3是低表達(dá)的，其作為腫瘤抑制基因發(fā)揮作用。延胡索酸可參與SIRT3對(duì)HIF-1α信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。因此，作者推測(cè)BW720c與隱丹參酮一樣使SIRT3的表達(dá)降低。在藥物處理轉(zhuǎn)化細(xì)胞中低表達(dá)量的延胡索酸影響SIRT3的表達(dá)量，最終使HIF-1α信號(hào)通路抑制，但是延胡索酸與SIRT3是如何協(xié)調(diào)發(fā)揮作用的還有待進(jìn)一步研究。馮儉等[31]也報(bào)道了丹參能增加缺氧細(xì)胞的氧分壓從而抑制HIF-1α表達(dá)以阻止腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞的增殖，因此，可以設(shè)計(jì)靶向SIRT3的分子，探索轉(zhuǎn)化發(fā)生機(jī)制。

4 結(jié) 論

環(huán)形泰勒蟲(chóng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞在BW720C藥物處理下代謝狀態(tài)發(fā)生顯著變化，基于LC-MS/MS代謝組學(xué)方法可以全面地篩選出藥物處理后影響轉(zhuǎn)化的差異代謝；通過(guò)分析這些差異代謝物的代謝途徑，可以初步分析轉(zhuǎn)化發(fā)生的機(jī)制，同時(shí)也為人類(lèi)癌癥的治療提供新方法。