犬弓首蛔蟲感染比格犬不同階段肝circRNAs表達(dá)模式的分析

鄒 揚(yáng)，鄭文斌，張金鵬，路義鑫*，朱興全2,*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江省動物源性人獸共患病重點(diǎn)實驗室，哈爾濱 150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，蘭州 730046；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

犬弓首蛔蟲是一種呈全球性分布的被嚴(yán)重忽視的人獸共患寄生線蟲，可引起包括人類在內(nèi)的多種動物的弓首蛔蟲病，尤其是在熱帶和亞熱帶地區(qū)較低社會經(jīng)濟(jì)階層的人群中[1]。據(jù)統(tǒng)計在2011—2015年我國東北和華北地區(qū)人感染弓首蛔蟲病的血清學(xué)陽性率為12.25%(351/2 866)～19.3%(281/1 458)[2-4]。寄生于終末宿主(犬科動物)腸道內(nèi)的犬弓首蛔蟲成蟲，可通過糞便將受精蟲卵排出體外，在適宜的土壤環(huán)境中，這些受精蟲卵可發(fā)育為感染性蟲卵，并存活數(shù)月至數(shù)年。當(dāng)被包括人類在內(nèi)的轉(zhuǎn)續(xù)宿主誤食后，犬弓首蛔蟲幼蟲雖不會發(fā)育為成蟲，但幼蟲會在宿主的多種組織器官中移行，造成嚴(yán)重的病理損傷[1]。如內(nèi)臟幼蟲移行癥(visceral larva migrans,VLM)、眼睛幼蟲移行癥(ocular larva migrans,OLM)和神經(jīng)型弓首蛔蟲病(neurotoxocariasis，NT)等[1，5-6]。截至目前，弓首蛔蟲病的確診比較困難[7]，且對其預(yù)防、治療和監(jiān)測的關(guān)注也十分有限，因此往往確診感染時，已經(jīng)出現(xiàn)了嚴(yán)重的不可逆的病理特征[8-9]。雖然用顯微鏡檢測病原是鑒定犬弓首蛔蟲病的金標(biāo)準(zhǔn)，但在實際操作上卻很難實現(xiàn)。而ELISA檢測雖然是當(dāng)前推薦的一種可行的方法，但是它的敏感性只接近80%[10]，因此開發(fā)一種更為精準(zhǔn)的檢測手段是十分必要的。通過對寄生蟲與宿主相互作用關(guān)鍵分子的鑒定，可以為開發(fā)寄生蟲病新的診斷方法提供潛在的生物標(biāo)志物。

作者前期研究發(fā)現(xiàn)，許多長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)和編碼RNAs(mRNAs)以及小RNAs(miRNAs)在犬弓首蛔蟲感染宿主的過程中發(fā)揮著重要的作用[11-12]。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)廣泛地存在于真核轉(zhuǎn)錄組中，且具有細(xì)胞和組織特異性，能通過吸附miRNAs而成為競爭性內(nèi)源RNA[13-14]，并通過與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合而參與生物體多種生理和病理學(xué)進(jìn)程。此外，由于分子量低的特性，環(huán)狀RNA能通過外泌體、納米微粒等胞外囊泡進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，被選作結(jié)核病等多種疾病的診斷靶標(biāo)和治療靶點(diǎn)。然而，在犬弓首蛔蟲感染宿主過程中，circRNAs的調(diào)控及其在宿主肝中的發(fā)病機(jī)制中所起的作用仍然未知。因此本研究通過對犬弓首蛔蟲感染比格犬肝的circRNAs進(jìn)行RNA測序,揭示宿主肝circRNAs在犬弓首蛔蟲感染過程中發(fā)揮的作用，為進(jìn)一步探究犬弓首蛔蟲與宿主之間的相互作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 感染蟲卵的制備

從雌性成蟲的子宮內(nèi)分離出犬弓首蛔蟲受精蟲卵，將收集到的受精蟲卵放置于含有高壓滅菌的濾紙和脫脂棉的培養(yǎng)皿中，置于0.5%的甲醛溶液中，28 ℃恒溫孵育28 d后，收集感染性蟲卵。用200目篩網(wǎng)除去雜質(zhì)，并將蟲卵浸泡在1%的甲醛溶液中，置于4 ℃冰箱保存[15]。

1.2 比格犬感染模型的建立

從國家犬類實驗動物資源庫購買18只6～7周齡的未進(jìn)行任何疫苗免疫的比格犬，所挑選的比格犬通過糞檢以確保無任何蠕蟲蟲卵，且采用間接ELISA法[16]檢測犬弓首蛔蟲抗體以確保所有的幼犬均無犬弓首蛔蟲感染，并飼養(yǎng)于廣州醫(yī)藥研究總院有限公司的大動物GLP實驗室中。這些幼犬被平均分成3組：感染后0.5 d組、感染后1 d組和感染后36 d組，每組包括試驗和對照各3只幼犬。試驗組的幼犬灌服300個感染性的蟲卵，來模擬自然感染，而對照組的幼犬灌服相同劑量的生理鹽水。感染后0.5、1及36 d，用EDTA-K2分別采集幼犬血液來檢查幼犬的嗜酸性粒細(xì)胞。使用Zoletil 50(Virbac，法國)將幼犬進(jìn)行全身麻醉，用KCl溶液注射入心臟內(nèi)進(jìn)行人道猝死。然后采集幼犬肝并用生理鹽水沖洗掉表面的血液，取10 g的肝組織剪碎，置于-80 ℃液氮中保存，用于提取組織總RNA。

1.3 比格犬肝組織總RNA的提取

用液氮將-80 ℃冷凍保存的18個幼犬肝組織研磨成粉末，用TRIzol(Life Technologies，美國)提取組織總RNA，然后用DNase I(NEB，美國)除去肝組織總RNA中的基因組DNA。采用1%的瓊脂糖凝膠法來檢測肝組織RNA的降解情況。使用NanoPhotometer?分光光度計(IMPLEN,CA,USA)檢測RNA純度。對于初篩合格的肝組織RNA樣品，分別使用Qubit?2.0 Flurometer(Life Technologies，美國)和Agilent生物分析儀2100系統(tǒng)(Agilent Technologies，美國)評估肝組織總RNA的濃度和完整性。之后，對RNA完整性(RNA integrity number,RIN)≥8的樣品進(jìn)行后續(xù)分析[17]。

1.4 circRNA文庫的構(gòu)建及鑒定

吸取5 μg每個肝樣品的總RNA用于構(gòu)建RNA測序文庫。使用Epicentre RibozeroTMrRNA Removal試劑盒(Epicentre,USA)去除核糖體RNA，用乙醇沉淀法清除rRNA殘留。然后用RNase R進(jìn)行線性RNA酶切(Epicentre，美國)。選擇150～200 bp的cDNA片段，用AMPure XP系統(tǒng)(Beckman Coulter,Beverly,USA)進(jìn)行純化。然后用3 μL USER Enzyme(NEB，美國)進(jìn)行片段大小的篩選，與選擇尺寸的接頭連接的cDNA在37 ℃ 下連接15 min，然后在95 ℃下連接5 min，用高保真DNA聚合酶、通用PCR引物和指數(shù)(X)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。最后對產(chǎn)物進(jìn)行純化(AMPure XP系統(tǒng))，并在安瑞倫生物分析儀2100系統(tǒng)上進(jìn)行文庫質(zhì)量評估。測序文庫由針對Illumina?(NEB，美國)的NEBNext?UltraTM定向RNA文庫準(zhǔn)備試劑盒并按照制造商的說明構(gòu)建，并利用HiSeq 4000測序平臺構(gòu)建18個肝樣品的circRNA測序文庫，生成150 bp的配對端序列[18]。高通量測序(illumina HiSeq 4000)測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識別(base calling)分析轉(zhuǎn)化為測序序列(raw reads)，結(jié)果以FASTQ(簡稱為fq)文件格式存儲。所獲序列去除帶有接頭、ploy-N和低質(zhì)量的reads (來自原始reads)，以獲得有效reads (clean reads)。然后從Ensembl數(shù)據(jù)庫中下載Canislupusfamiliaris基因組和注釋文件(CanFam3.1)。使用bowtie2 v2.2.8[19]建立參照基因組指數(shù)，并使用Bowtie將配對末端clean reads與參照基因組對齊。映射到的reads被刪除，未映射的reads包括拼接連接對齊的reads，由find_circ[20]和CIRI2[21]軟件進(jìn)一步處理。最后，識別出含有剪接位點(diǎn)對齊reads的circRNAs。選擇兩種算法的交集進(jìn)行circRNAs的預(yù)測。

1.5 circRNAs的定量、差異分析及差異circRNAs序列親緣關(guān)系進(jìn)化分析

通過每百萬條reads的轉(zhuǎn)錄本(transcripts per million reads,TPM)[22]的表達(dá)水平來評估circRNAs相對表達(dá)量。試驗組和對照組的肝circRNAs的差異表達(dá)量采用DESeq2軟件進(jìn)行分析，默認(rèn)以Pvalue值0.05為差異表達(dá)閾值。對差異的circRNAs序列進(jìn)行親緣關(guān)系的進(jìn)化樹比較，在Tamura-Nei模型的基礎(chǔ)上，利用極大似然法(maximum likelihood)對其演化歷史進(jìn)行了推斷[23]。利用雙參數(shù)遺傳距離模型在MEGA7軟件上構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[24]。使用引導(dǎo)分析(1 000次重復(fù))對系統(tǒng)發(fā)育樹的穩(wěn)健性進(jìn)行評估，以評價差異circRNAs親緣關(guān)系[25]。

1.6 實時熒光定量PCR (qRT-PCR)驗證分析

為了驗證RNA-seq結(jié)果的準(zhǔn)確性，隨機(jī)挑選9個差異性表達(dá)的circRNAs與1個管家基因進(jìn)行熒光定量PCR(qRT-PCR)的驗證。利用Hiscript II Q RT SuperMix cDNA試劑盒(Vazyme，中國南京)合成了circRNA的第一鏈cDNA。采用ChamQ SYBR qPCR Master Mix qRT-PCR試劑盒(Vazyme，中國南京)進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)條件包括95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃預(yù)變性10 s，60 ℃預(yù)變性30 s，40個循環(huán)，所有反應(yīng)都進(jìn)行了3次重復(fù)。此外進(jìn)行解離曲線分析，以保證每個反應(yīng)的特異性擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95 ℃10 s，65 ℃1 min，從65 ℃逐步升高到95 ℃。使用內(nèi)參基因GTI[26]對所有的circRNA表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理，用2-ΔΔCt方法[27]計算每個樣品中特定circRNAs的相對表達(dá)量。所有基因和引物見表1。

表1 用于環(huán)狀RNA的實時熒光定量PCR分析的引物Table 1 Primers used in circRNA specific quantitative real-time PCR (qRT-PCR)analysis

1.7 統(tǒng)計分析

使用 GraphPad Prism 8對qRT-PCR中基因表達(dá)的circRNAs差異結(jié)果進(jìn)行分析，并用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)表示。

1.8 circRNA親本基因的功能分析

根據(jù)circRNAs與其來源基因(source gene)間的對應(yīng)關(guān)系，對每組差異表達(dá)的circRNAs的來源基因進(jìn)行功能預(yù)測，使用R包中的GOseq進(jìn)行基因本體論(gene ontology，GO)的注釋分析[28]，并分析這些差異表達(dá)的circRNAs在犬弓首蛔蟲感染幼犬中的生物學(xué)功能，包括3個分類：生物進(jìn)程(biological process，BP)、細(xì)胞成分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)，Pvalue 小于0.05被認(rèn)為是顯著注釋。通過 KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)Pathway顯著性富集確定circRNAs的來源基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[29]。

1.9 倫理道德

本研究經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動物倫理委員會批準(zhǔn)(編號：2018-015)。試驗用比格犬按照國家和地方有關(guān)實驗動物福利倫理規(guī)定的要求進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1 比格犬感染犬弓首蛔蟲后血清中嗜酸性粒細(xì)胞的變化

在感染后0.5 d，試驗組中的犬血清嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量與對照組的犬相比顯著增加(P<0.05)(圖1)。

*.P<0.05圖1 感染組與對照組比格犬血清中的嗜酸性粒細(xì)胞的量Fig.1 Eosinophils level in serum of infected and control Beagle dogs

2.2 幼犬肝RNA數(shù)據(jù)及環(huán)狀RNA的差異表達(dá)

在本研究中從18只幼犬的肝樣本(3個感染階段：0.5、1、和36 d)中獲得了2 119 950 482個raw reads、2 068 104 062個clean reads和310.22 Gb clean reads。Clean reads中GC和Q30的平均值分別為52.47% 和93.73%。在感染后0.5 d，試驗組與對照組相比，共有94個差異的circRNAs，其中包括55個上調(diào)的circRNAs，39個下調(diào)的circRNAs(圖2A)；在感染后1 d，共鑒定到103個差異的circRNAs，其中包括61個上調(diào)的circRNAs，42個下調(diào)的circRNAs(圖2B)；在感染后36 d，共鑒定到84個差異的circRNAs，其中包括47個上調(diào)的circRNAs，37個下調(diào)的circRNAs(圖2C)。但是在3個感染階段，沒有發(fā)現(xiàn)共同的差異circRNAs(圖3)。此外在3個感染階段隨機(jī)篩選出10個差異的circRNAs構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，來評估各階段犬肝的差異circRNAs親緣關(guān)系(圖4)。

圖2 差異表達(dá)環(huán)狀RNA的火山圖Fig.2 Volcano plot of the differentially expressed (DE)circRNAs

圖3 差異表達(dá)環(huán)狀RNA的維恩圖Fig.3 Venn diagram of the differentially expressed (DE)circRNAs

進(jìn)化樹系按比例繪制，用每個位點(diǎn)的替換次數(shù)來衡量分支長度。分析涉及30個核苷酸序列。密碼子定位為1+、2+、3+及非編碼。消除所有包含間隙和缺失數(shù)據(jù)的定位。最終的數(shù)據(jù)集中共有111個定位The tree is drawn to scale,with branch lengths measured in the number of substitutions per site.The analysis involved 30 nucleotide sequences.Codon positions included were 1 st+2nd+3rd+Noncoding.All positions containing gaps and missing data were eliminated.There were a total of 111 positions in the final dataset圖4 3個感染階段部分差異表達(dá)環(huán)狀RNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of partial differential expression of circRNAs at three stages of infection

2.3 實時熒光定量PCR驗證

隨機(jī)挑選了9個差異的circRNAs進(jìn)行表達(dá)趨勢驗證，如圖5。其中轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果為4個上調(diào)和3個下調(diào)的circRNAs，與qRT-PCR檢測表達(dá)趨勢一致，進(jìn)一步驗證了轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性。

y軸表示環(huán)狀RNA與管家基因GTI表達(dá)水平的相對變化,x軸顯示用于表達(dá)分析交叉驗證的9個環(huán)狀RNAs的名稱The y-axis shows the relative change of circRNA levels expressed compared with the control GTI gene.The x-axis shows the name of the nine circRNAs used in the cross-validation of expression analysis圖5 差異表達(dá)環(huán)狀RNA的實時熒光定量PCR驗證Fig.5 qRT-PCR validation of the differentially expressed (DE)circRNAs

2.4 差異性表達(dá)的環(huán)狀RNAs的GO注釋和KEGG富集分析

通過GO注釋分析發(fā)現(xiàn)，在犬弓首蛔蟲感染后0.5 d，共有415個GO條目中被顯著富集(P<0.05)。差異的circRNAs主要與“化合物代謝生物過程”“細(xì)胞器組成相關(guān)”(見OSID開放科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖1A)；在感染后1 d，共涉及768顯著富集的條目。差異的circRNAs主要與“調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞介導(dǎo)生物過程”“連接酶的活動分子功能”相關(guān)(見OSID開放科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖1B)；在感染后36 d，有344個GO條目被顯著富集。差異的circRNAs主要與“胞內(nèi)部分細(xì)胞組成”相關(guān)(見OSID開放科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖1C)。另外，作者篩選出一些與免疫或炎癥相關(guān)的GO條目(P<0.05)，而這些條目大部分富集在感染后1 d(圖6)。并主要與“固有免疫”“中性粒細(xì)胞介導(dǎo)”和“細(xì)胞因子的產(chǎn)生”進(jìn)程相關(guān)(圖6)。在犬弓首蛔蟲感染后0.5 d，novel_circ_0016108、novel_circ_0016184和novel_circ_0027468參與固有免疫進(jìn)程；在感染后1 d，novel_circ_0002212與中性粒細(xì)胞介導(dǎo)作用過程相關(guān)；在感染后36 d，novel_circ_0002091、novel_circ_0014164、novel_circ_0019985、novel_circ_0023071和novel_circ_0023218主要參與細(xì)胞因子的產(chǎn)生進(jìn)程。

KEGG富集分析表明，在感染后0.5 d，2條KEGG信號通路被顯著富集，如“促性腺激素釋放激素信號通路”“丙型肝炎通路”(圖7A)。其中novel_circ_0025586、novel_circ_0016800和novel_circ_0024378與“丙型肝炎通路”相關(guān)；在感染后1 d，有4條通路被顯著富集(P<0.05)，如“丙酮酸代謝”“精氨酸和脯氨酸代謝”“核糖體在真核細(xì)胞中生物合成作用”和“脂肪酸的生物合成”通路(圖7B)。其中novel_circ_0002212和novel_circ_0019907涉及“精氨酸和脯氨酸代謝”通路；在犬弓首蛔蟲感染后36 d，有6條通路被顯著富集，如“泛醌及其他萜醌類生物合成”“軍團(tuán)桿菌病”“血小板激活”“泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用”“抗壞血酸和醛酸代謝”和“類固醇生物合成”通路(圖7C)。其中novel_circ_0019985和novel_circ_0001521與軍團(tuán)桿菌病通路相關(guān)。

A、B和C.代表靶基因在感染后0.5、1和36 d顯著富集的與免疫或炎癥相關(guān)的基因本體(GO)術(shù)語。y軸左側(cè)代表靶基因個數(shù)，右側(cè)代表P value值。x軸表示基因本體(GO)術(shù)語A,B and C.Represent the significantly enriched immunity-or inflammation-related differential GO terms at 0.5 dpi,1 dpi and 36 dpi.The left y-axis shows the numbers of target genes,and the right y-axis shows the P value.The x-axis shows the Gene Ontology (GO)terms of the source gene圖6 與免疫或炎癥相關(guān)的差異環(huán)狀RNA的GO條目Fig.6 The enriched immunity-or inflammation-related differential GO terms of the differentially expressed (DE)circRNAs

A、B和C.代表靶基因在感染后0.5、1和36 d的差異環(huán)狀RNA親本基因富集的信號通路。y軸左側(cè)代表信號通路，右側(cè)矩形代表-lg P value 值,黑色圓圈表示靶基因數(shù)目，x軸表示靶基因比率A,B and C.Represent the signaling pathways enriched by the source genes of differentially expressed (DE)circRNAs at 0.5 dpi,1 dpi and 36 dpi.The left y-axis shows the signaling pathways,and the right rectangle shows the -lg P value,and the black circle shows gene numbers.The x-axis shows the Gene Ontology (GO)terms of the source gene圖7 前20個差異環(huán)狀RNA親本基因富集的信號通路Fig.7 The top 20 signaling pathways enriched by the source genes of differentially expressed (DE)circRNAs

3 討 論

犬弓首蛔蟲是一種被忽視的寄生性蠕蟲，它可以導(dǎo)致人體弓蛔蟲病，如內(nèi)臟和眼睛幼蟲移行癥以及明顯的免疫病理反應(yīng)等。目前的治療手段主要是藥物，而對犬弓首蛔蟲病疫苗研究仍十分有限[30]。circRNAs是一類新興的內(nèi)源性非編碼RNA，因其不具有5′端帽子和3′端poly(A)尾結(jié)構(gòu)，所以能夠穩(wěn)定地存在于各種類型的真核細(xì)胞中[31]。circRNAs能夠吸附miRNAs發(fā)揮海綿(sponge)作用，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[14]。研究表明，circRNAs在生物的生長發(fā)育、脅迫應(yīng)答、疾病發(fā)生和發(fā)展等方面發(fā)揮重要作用，并顯示出其在疾病診斷標(biāo)記物等方面的應(yīng)用潛力[31]。因此本研究對犬弓首蛔蟲不同感染階段的比格犬肝的circRNAs轉(zhuǎn)錄本變化進(jìn)行研究，分析其差異表達(dá)的circRNA，預(yù)測其來源基因的生物功能，從而為闡明犬弓首蛔蟲與終宿主之間相互作用的機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

本研究中，在犬弓首蛔蟲感染的過程中大部分差異的circRNAs被上調(diào)。這表明，在犬弓首蛔蟲感染比格犬期間，犬肝的circRNAs受到正向調(diào)控，從而參與犬弓首蛔蟲的感染過程。通過對差異的circRNAs序列親緣關(guān)系的進(jìn)化樹比較，發(fā)現(xiàn)在犬弓首蛔蟲感染的不同階段，肝差異的circRNAs的親緣關(guān)系不強(qiáng)。另外隨著犬弓首蛔蟲感染的不同階段，犬肝的生物學(xué)進(jìn)程也發(fā)生了改變，這說明犬弓首蛔蟲感染比格犬后肝的生物學(xué)功能發(fā)生改變可能與circRNAs表達(dá)量的改變有關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報道，大部分犬弓首蛔蟲幼蟲在終末宿主(犬)體內(nèi)，在24 h移行到肝，可引起肝劇烈的免疫反應(yīng)[32]。這也進(jìn)一步解釋了為什么大部分與炎癥或免疫相關(guān)的GO條目被顯著富集在感染后1 d。此外，在感染后0.5 d，與免疫或炎癥相關(guān)的GO條目主要與固有免疫相關(guān)，這說明犬弓首蛔蟲在感染后0.5 d時可引起宿主肝的天然免疫反應(yīng)。而作者推測novel_circ_0016108、novel_circ_0016184和novel_circ_0027468可能參與了犬弓首蛔蟲引起的宿主肝的天然免疫反應(yīng)相關(guān)，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。中性粒細(xì)胞是免疫防御所必需的多功能先天效應(yīng)細(xì)胞，在防御的同時也會引起炎癥反應(yīng)。有試驗證明在缺乏中性粒細(xì)胞或中性粒細(xì)胞遷移或功能受損的小鼠中，實驗性誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎沒有發(fā)生[33-34]。類似的研究表明，中性粒細(xì)胞是介導(dǎo)多種免疫疾病如神經(jīng)炎癥和結(jié)腸炎中關(guān)鍵的效應(yīng)因子[35-36]，是一種重要的藥物靶點(diǎn)。而在本研究中，在感染后1 d，大部分與免疫或炎癥相關(guān)的通路是與中性粒細(xì)胞介導(dǎo)相關(guān)，這也說明中性粒細(xì)胞在犬弓首蛔蟲感染的過程中發(fā)揮著重要作用。并且novel_circ_0002212可能參與了犬弓首蛔蟲引起的肝炎癥反應(yīng)，并可能成為治療該炎癥的潛在藥物靶點(diǎn)。細(xì)胞因子一般通過與相應(yīng)的細(xì)胞表面受體結(jié)合發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、激活先天和獲得性免疫應(yīng)答，參與促炎和抗炎反應(yīng)機(jī)制等。而本研究中，在感染后36 d，novel_circ_0002091、novel_circ_0014164、novel_circ_0019985、novel_circ_0023071和novel_circ_0023218參與細(xì)胞因子的產(chǎn)生過程。這說明在犬弓首蛔蟲感染比格犬后期，這幾種新鑒定到的環(huán)狀RNA在肝的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。

丙型肝炎可以觸發(fā)多種信號通路誘導(dǎo)宿主先天免疫應(yīng)答，并可以利用自噬抑制先天免疫反應(yīng)[37]。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)在感染后0.5 d，環(huán)狀RNA novel_circ_0025586、novel_circ_001680和novel_circ_0024378與“丙型肝炎通路”顯著相關(guān)。這說明這三種circRNAs，可能與犬弓蛔蟲感染引起宿主肝的先天免疫反應(yīng)有一定的聯(lián)系。在利什曼原蟲感染過程中，L-精氨酸代謝可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)[38-39]。精氨酸代謝在宿主防御以及生長和分化中發(fā)揮作用。精氨酸代謝可以使機(jī)體在受傷后24～72 h內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)達(dá)到高峰，并產(chǎn)生瓜氨酸和一氧化氮(NO)。一氧化氮對微生物和寄生蟲是有毒的，可以抵抗寄生蟲的增殖[40]。因此我們猜測，在感染后1 d，大部分移行到肝處的幼蟲[32]導(dǎo)致肝損傷，從而促使精氨酸代謝上調(diào)，釋放NO來抵抗犬弓首蛔蟲侵襲。但這仍需要后續(xù)試驗進(jìn)一步驗證。然而，在本研究中，novel_circ_0002212和novel_circ_0019907與“精氨酸和脯氨酸的代謝”通路有密切聯(lián)系。這說明這兩種環(huán)狀RNA可能在宿主肝抵抗犬弓首蛔蟲侵襲的過程中發(fā)揮著重要作用。在軍團(tuán)桿菌病通路中，有一種半胱氨酸蛋白酶Caspase-3(Casp3)，它在細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用，在Casp3敲除的小鼠中，炎癥基因表達(dá)被上調(diào)，出現(xiàn)輕度脾腫大和腎炎癥[41]。作者之前的研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-3在犬弓首蛔蟲感染宿主的肺后被上調(diào)了15.6倍，在犬弓首蛔蟲感染的過程中發(fā)揮抗炎的作用[11]。這些研究表明，軍團(tuán)桿菌病通路可能與犬肝抵抗犬弓首蛔蟲的感染有關(guān)。在感染后36 d，novel_circ_0019985和novel_circ_0001521參與“軍團(tuán)桿菌病”通路，提示這兩種circRNAs可能與犬肝抵抗犬弓首蛔蟲的感染的抗炎作用有關(guān)。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，犬弓首蛔蟲感染會引起比格犬肝的circRNAs表達(dá)譜的改變，這些差異的circRNAs參與宿主肝的免疫或者炎癥反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)也為后續(xù)研究circRNAs在犬弓首蛔蟲致病機(jī)制中的作用提供了參考。