藏羊HSP27基因過表達和沉默載體構(gòu)建及對卵泡發(fā)育的功能初步分析

張春梅，賈建磊*，謝 雯，任 昊，張懷霞，張瑩瑩，陳 倩

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016；2.青海大學(xué)實驗室管理處，西寧 810016)

熱休克蛋白27(heat shock protein 27，HSP27)是細胞或生物體在應(yīng)激情況下由熱激基因所編碼合成的具有高度保守性的一組小分子蛋白質(zhì)，具有多種生物學(xué)功能[1]。先前的研究表明，HSP27最主要的特征就是具有分子伴侶功能，比如在響應(yīng)熱和氧化應(yīng)激時，誘導(dǎo)型的HSP27表達增加并激活PKB/Akt/RAC信號通路，HSP27的分子伴侶活性不斷增強從而保護細胞功能[2]。HSP27具有抗細胞凋亡作用，HSP27的磷酸化二聚體結(jié)合DAXX可以在Fas-Fas L介導(dǎo)凋亡，阻止其與ASK1和Fas的相互作用，從而阻斷DAXX介導(dǎo)的凋亡[3-4]。HSP27具有抗氧化應(yīng)激作用，在細胞受到氧化應(yīng)激時HSP27通過提高谷胱甘肽的水平和降低鐵的含量來提升細胞的抗氧化能力[5]。此外，HSP27在哺乳動物的繁殖過程中發(fā)揮著重要的功能且與卵泡發(fā)育密切相關(guān)[6]。Wang等[7]發(fā)現(xiàn)，HSP27基因在培養(yǎng)后的小鼠卵泡中廣泛表達于卵母細胞、顆粒細胞、卵泡膜細胞。Khan等[8]發(fā)現(xiàn)，在卵泡發(fā)育過程中HSP27蛋白與轉(zhuǎn)膠蛋白起分子伴侶的作用，它的表達和膠原Ⅰ、膠原Ⅱ具有時空相關(guān)性。馬紅梅和劉嘉茵[9]發(fā)現(xiàn)，HSP27基因在哺乳動物體內(nèi)除了作為分子伴侶保護蛋白質(zhì)免受損傷外，還廣泛地參與了卵子的發(fā)生和形成過程，與哺乳動物的繁殖功能密切相關(guān)。Sreekanth等[10]發(fā)現(xiàn)，在卵泡發(fā)育過程中，磷酸化的HSP27增強細胞對應(yīng)激的耐受性，并增加活細胞數(shù)量，激活 p38-MAPK 通路使得孕酮、雌二醇和類固醇蛋白水平上升從而促進卵泡發(fā)育成熟。

藏羊在青海省內(nèi)主要分布在青南和環(huán)湖牧區(qū)，其生活能力強、耐粗、耐寒且具有獨特的生物學(xué)特性和經(jīng)濟特性。藏羊以“一年一胎、一胎一羔”的繁殖方式為主，繁殖效率低下，不能夠適應(yīng)牧區(qū)現(xiàn)代化的生產(chǎn)要求[11]。大量研究表明，繁殖效率除了受胎次、季節(jié)、營養(yǎng)的影響外主要受遺傳因素控制[12]。HSP27基因在哺乳動物卵泡的發(fā)育包括細胞的增殖與分化過程中發(fā)揮著重要的作用[8]。前人研究發(fā)現(xiàn)，生長分化因子9(growth differentiation factor 9,GDF9)可以通過調(diào)節(jié)卵巢顆粒細胞增殖分化，促進繁殖軸相關(guān)基因、功能蛋白、因子的產(chǎn)生及表達，進而在卵泡發(fā)育及排卵方面發(fā)揮重要作用[13]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1B(bone morphogenetic protein receptor type 1B,BMPR-1B)在綿羊卵巢內(nèi)廣泛表達，通過調(diào)節(jié)細胞分化、增殖等生理過程對動物卵泡發(fā)育、激素釋放等方面發(fā)揮重要作用，是卵巢中啟動卵泡發(fā)育以及調(diào)節(jié)排卵的必要生長因子[14]。雌激素受體(estrogen receptor β,Erβ)作為卵泡發(fā)育重要轉(zhuǎn)錄因子之一，其蛋白結(jié)構(gòu)的D區(qū)有與HSP結(jié)合的位點，雌激素通過這一受體對HSP27的調(diào)節(jié)起作用[15]。

本研究擬克隆藏羊卵巢HSP27基因并進行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建藏羊HSP27基因過表達及沉默載體，分離培養(yǎng)藏羊卵巢顆粒細胞用于轉(zhuǎn)染，并在顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后不同培養(yǎng)時間點細胞形態(tài)及細胞計數(shù)變化，通過RT-PCR檢測經(jīng)轉(zhuǎn)染后HSP27基因在顆粒細胞的表達，同時檢測HSP27基因?qū)β雅莅l(fā)育相關(guān)基因GDF9、BMPR-1B、Erβ在卵巢顆粒細胞中表達的影響，以期進一步探究HSP27基因在藏羊卵泡發(fā)育過程中的分子機制和調(diào)控機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物來自青海海南州哇玉香咔梅哚牧業(yè)責(zé)任有限公司，選擇健康的(3～4歲)經(jīng)產(chǎn)藏羊母羊6只，平均體重(45.36±1.16)kg。屠宰后迅速采集卵巢組織，用無菌生理鹽水沖洗并修剪后迅速投入液氮中帶回實驗室，于-80 ℃冷凍備用。

1.2 試驗試劑

pRNA-H1.1/Adeno、pAdeasy-1、pAdTrack-CMV(優(yōu)寶生物)；TRIzol(Invitrogen)；Fast King cDNA第1鏈合成試劑盒、RT-PCR試劑盒(北京天根生化)；DMEM(Sigma)；FBS(Gibco)；內(nèi)切酶(上海生工)；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1HSP27 基因克隆 從GenBank數(shù)據(jù)庫檢索綿羊HSP27 基因序列(XM_027961472.1)、綿羊GDF9(NC_030814.1)、BMPR-1B(NC_022298.2)、Erβ(XM_005898252.1)基因mRNA序列，以β-actin為內(nèi)參基因，用 Primer Premier 5.0 軟件進行引物設(shè)計。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，試驗所用引物序列見表1。

表1 基因引物序列Table 1 Related genes primer sequences

本試驗采用常規(guī)TRIzol法，從藏羊的卵巢組織中提取總RNA檢測其濃度，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并檢測其濃度，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，擴增藏羊HSP27基因。PCR擴增體系為20 μL：50 mg·μL-1模板cDNA 1.5 μL，5 U·μL-1Taq PCR預(yù)混酶2.0 μL，100 μmol·L-1引物1 μL(上、下游引物各0.5 μL)，PCR Loading Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 2.0 μL，ddH2O 11.0 μL。PCR擴增條件：95 ℃ 預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存?；厥誔CR產(chǎn)物并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測?；厥占兓腜CR產(chǎn)物與pUC57載體16 ℃連接過夜，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中，37 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)1 h。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布到含Kan抗性的LB瓊脂平板表面，于37 ℃培養(yǎng)過夜，12～16 h后可出現(xiàn)菌落。挑取單菌落，接種至含Kan抗性的LB培養(yǎng)基，37 ℃ 180 r·min-1振蕩培養(yǎng)8～10 h。將菌液送至上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.3.2 藏羊HSP27 基因的生物信息學(xué)分析 用 NCBI 中的 BLAST 軟件對已測得藏羊HSP27 基因與其他物種HSP27 基因的序列進行比對，使用MegAlign軟件分析同源性并構(gòu)建進化樹；使用DNAStar軟件分析藏羊HSP27基因的核苷酸及氨基酸序列；使用在線軟件ORF finder、Protparam、Protscale、IBCP、SWISS-MODEL、NetOGlyc4.0、NetNGlyc1.0分析預(yù)測藏羊HSP27 基因開放閱讀框、編碼蛋白的理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)疏水性質(zhì)、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、糖基化位點及磷酸化位點。

1.3.3 藏羊HSP27基因過表達載體AdCMV-HSP27構(gòu)建及驗證 使用KpnI和XhoI雙酶切基因合成HSP27質(zhì)粒，回收HSP27片段即產(chǎn)物1；KpnI和XhoI雙酶切pAdTrack-CMV載體，回收產(chǎn)物2；將回收的產(chǎn)物1和2進行連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中，涂板后過夜培養(yǎng)；挑取轉(zhuǎn)化子，PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子(PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同“1.2.1”)；將PCR鑒定后陽性轉(zhuǎn)化子進行測序，選擇正確轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒備用。將構(gòu)建成功的pAdTrack-HSP27轉(zhuǎn)化到BJ5183感受態(tài)菌株中(BJ5183感受態(tài)菌株中含有pAdeasy-1載體)同源重組，涂布平板，抗性篩選，最后提取AdCMV-HSP27質(zhì)粒。

1.3.4 藏羊HSP27基因沉默載體構(gòu)建及驗證 依據(jù)shRNA靶點設(shè)計原則，在HSP27的編碼區(qū)設(shè)計shRNA序列，命名為HSP27-shRNA，增設(shè)陰性對照組NC-HSP27-shRNA(表2)。

表2 HSP27基因shRNA靶點設(shè)計Table 2 HSP27 gene shRNA target design

分別化學(xué)合成以上靶點序列，退火形成雙鏈即產(chǎn)物3；使用MluI和Hind III雙酶切pRNA-H1.1/Adeno載體，回收產(chǎn)物4；將回收產(chǎn)物3和4連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中，涂板后過夜培養(yǎng)；挑取轉(zhuǎn)化子進行測序(測序引物序列為F：TAATACGACTCACTATAGGG，R：CAAAACTACATAAGACCCCCAC)，挑取陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒備用。將上述構(gòu)建成功的載體分別轉(zhuǎn)化到BJ5183感受態(tài)菌株中(BJ5183感受態(tài)菌株中含有pAdeasy-1載體)同源重組，涂布平板，抗性篩選，提取AdCMV-GFP-H1-shRNA/HSP27質(zhì)粒。

1.3.5HSP27基因過表達載體及沉默載體在藏羊卵巢顆粒細胞的轉(zhuǎn)染 參考趙妙妙等[16]的方法，將采集的新鮮藏羊卵巢在含雙抗的37 ℃生理鹽水中保存帶回實驗室；用注射器吸取卵泡液后離心5 min(1 200 r·min-1)，棄去上清液后再次離心，過篩得到純凈的顆粒細胞，按照適當?shù)募毎麧舛扰c配制的細胞培養(yǎng)基(含有10%FBS的DMEM基礎(chǔ)液)裝入細胞瓶中，在5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。除去原細胞培養(yǎng)基，PBS清洗 2 遍后，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

將第2～3代卵巢顆粒細胞以每孔5×105個接種至6孔板中培養(yǎng)，待細胞生長至60%以上的匯合度時，棄去培養(yǎng)液，用2 mL無血清DMEM清洗一次后棄去，再加入1 mL不含血清培養(yǎng)液。把重組質(zhì)粒AdCMV-HSP27、AdCMV-GFP-H1-shRNA/HSP27分別與轉(zhuǎn)染試劑混合，將復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，在培養(yǎng)箱中37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后吸除無血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.6HSP27基因過表達載體及沉默載體對顆粒細胞形態(tài)變化及細胞計數(shù)的影響 將第2代卵巢顆粒細胞以每孔0.35×106個接種至24孔板中培養(yǎng)，待細胞生長至60%以上的匯合度時更無血清培養(yǎng)基，用Lipofectamin2000試劑按不同分組進行細胞轉(zhuǎn)染試驗即空白對照組、過表達載體組、沉默載體組、陰性對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染6 h后更換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)0、24、48、72 h時，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和細胞密度的變化。同時分別于0、24、48、72 h將細胞用胰酶消化制成細胞懸液，按9∶1加入4%臺盼藍溶液，利用血球計數(shù)板于顯微鏡下計數(shù)。

1.3.7HSP27基因過表達載體及沉默載體對藏羊卵泡發(fā)育相關(guān)基因表達的影響 收集“1.3.5”中培養(yǎng)的空白組細胞和各轉(zhuǎn)染組的細胞，TRIzol法提取細胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，RT-PCR檢測HSP27在各組(空白組、AdCMV-HSP27組、NC-HSP27-shRNA組、HSP27-shRNA組)細胞中的mRNA表達量，同時檢測GDF9、BMPR-1B、Erβ基因在各組細胞中的表達量。以綿羊β-actin作為內(nèi)參基因，采用SYBR GreenⅠ染料法測定mRNA表達量，每個樣品重復(fù)6次。反應(yīng)體系為20 μL ：2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10.5 μL，100 μmol·L-1引物1 μL(上、下游引物各0.5 μL)，50 mg·μL-1模板cDNA 1.0 μL，RNase-free ddH2O 7.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40個循環(huán)。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析 本試驗中基因的相對表達量采用2-△△Ct法計算，用SPSS 20.0軟件進行差異顯著性分析；其他數(shù)據(jù)用Excel 2010統(tǒng)計整理后，采用SPSS 20.0分析軟件進行細胞計數(shù)試驗的結(jié)果統(tǒng)計分析，結(jié)果以“平均值±標準差(mean±SD)”表示，以P<0.01為差異極顯著性判斷標準。

2 結(jié) 果

2.1 藏羊HSP27基因的克隆與鑒定

用卵巢組織反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，擴增藏羊HSP27基因CDS區(qū)。結(jié)合 NCBI中的 BLAST 軟件在線對比，擴增所得序列與參考序列的一致性達99.72%，因此可判定擴增出來的序列為藏羊的HSP27 基因序列。將擴增的CDS區(qū)序列與pUC57載體進行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中，培養(yǎng)后挑選菌落進行雙酶切驗證。雙酶切鑒定結(jié)果顯示，藏羊HSP27基因重組質(zhì)粒使用限制性內(nèi)切酶KpnI和XhoI雙酶切后，獲得618 bp的插入片段，且對照組質(zhì)粒未被酶切，說明藏羊HSP27基因的克隆成功(圖1)。

1.對照組質(zhì)粒DNA；2.Kpn I和Xho I雙酶切產(chǎn)物；M.DNA相對分子質(zhì)量標準1.Control plasmid DNA；2.Double enzyme digestion pro-ducts by Kpn I and Xho I；M.DL4500 DNA marker圖1 雙酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Double enzyme digestion results

2.2 藏羊HSP27基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 藏羊HSP27基因序列分析 將PCR 擴增產(chǎn)物測序拼接后獲得一段長618 bp的mRNA序列，用 NCBI 中的ORF finder 在線軟件進行HSP27基因的開放閱讀框分析，并使用DNAStar軟件分析HSP27基因的核苷酸和氨基酸序列。分析結(jié)果表明，HSP27基因的ORF最長為606 bp，起始密碼子位于7 bp處，終止密碼子位于612 bp處；HSP27基因片段長度為 618 bp，其堿基組成(表3)中C、G的含量較高；HSP27基因編碼蛋白含203個氨基酸，其氨基酸數(shù)量及種類(表4)，其中疏水性和親水性氨基酸的數(shù)量較多，蛋白分子質(zhì)量為22 735.41 u。

表3 HSP27基因核苷酸序列分析Table 3 Nucleotide sequence analysis of HSP27 gene

表4 HSP27氨基酸序列分析Table 4 Amino acid sequence analysis of HSP27

2.2.2 藏羊 HSP27 序列同源性分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 利用軟件MegAlign對藏羊HSP27基因序列與NCBI中的印度牛(XM_027527283.1)、野牛(XM_014477336.1)、家牛(XM_005005115.2)、水牛(KX806596.1)、單峰駝(XM_031432690.1)、山羊(XM_018040903.1)、白鯨(XM_022588028.2)、綿羊(XM_027961472.1)、美洲獅(XM_025923303.1)等物種的HSP27序列進行了同源性對比，同時構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果表明，核苷酸序列同源性分別為96.9%、96.9%、96.9%、98.0%、91.4%、98.7%、93.0%、97.9%和90.0%(圖2A)。氨基酸序列同源性依次為97.1%、97.1%、97.1%、98.0%、9.4%、8.3%、95.6%、98.1%、和7.3%(圖2B)。另外，由系統(tǒng)進化樹可知，進化樹主要分為?？萍捌渌种?，?？朴址譃榕喛萍把騺喛疲喛瓢ㄓ《扰?、野牛、水牛和家牛，羊亞科包括藏羊、山羊、綿羊，藏羊與綿羊的親緣關(guān)系最近(圖2C)。

A.HSP27核苷酸序列同源性分析圖；B.HSP27氨基酸序列同源性圖；C.HSP27的系統(tǒng)進化樹圖A.The homology of HSP27 nucleotide acid sequence;B.The homology of HSP27 amino acid sequence;C.The phylogenetic tree of HSP27圖2 HSP27同源性及系統(tǒng)進化樹分析Fig.2 HSP27 homology and phylogenetic tree analysis

2.2.3 藏羊HSP27基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析及親疏水性分析 利用在線軟件Protparam 分析其理化性質(zhì)，結(jié)果表明，該編碼區(qū)蛋白分子式為C1014H1562N286O307S2，包含原子個數(shù)為3 171，理論等電點為5.99，脂肪系數(shù)為69.02。該編碼蛋白質(zhì)共含有 19 種氨基酸，其中含量最高的是絲氨酸(Ser,10.3%)，含量最低的是蛋氨酸(Met,0.5%)，含帶負電氨基酸(Asp + Glu)24個，帶正電氨基酸(Arg + Lys)22個。利用在線軟件Protscale分析藏羊HSP27基因氨基酸序列的親疏水性，結(jié)果表明，藏羊HSP27 基因編碼的整個氨基酸序列中最大親水性值為4.5(Ile)，最小親水性值為-4.5(Arg)，親水性氨基酸大于疏水性氨基酸，說明HSP27是親水性蛋白(圖3)。

圖3 HSP27基因編碼蛋白的疏水性分析Fig.3 Analysis of hydrophobicity of HSP27 gene encoded protein

2.2.4 藏羊HSP27 基因編碼蛋白的高級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用在線軟件 IBCP預(yù)測藏羊HSP27 基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)(圖4)。預(yù)測表明，該蛋白 α-螺旋區(qū)為 42 個氨基酸，占20.69%；延伸鏈為 28 個氨基酸，占 13.79%；無規(guī)則卷曲為 133 個氨基酸，占 65.52%。利用在線軟件SWISS-MODEL預(yù)測藏羊HSP27 基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)(圖5)，發(fā)現(xiàn)預(yù)測的結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)相似。

圖4 HSP27 基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of the secondary structure of the protein encoded by the HSP27 gene

圖5 HSP27 基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Prediction of the tertiary structure of the protein encoded by HSP27 gene

2.2.5 藏羊HSP27 基因編碼蛋白糖基化位點及磷酸化位點預(yù)測 利用在線軟件 NetOGlyc4.0和NetNGlyc1.0預(yù)測藏羊HSP27 基因編碼蛋白質(zhì)糖基化位點，結(jié)果表明，該蛋白在第154、172、178、182、197位氨基酸處存在O-糖基化位點，沒有潛在的N-糖基化位點；利用在線軟件NetPhos預(yù)測藏羊HSP27 基因編碼蛋白質(zhì)磷酸化位點，結(jié)果表明，該蛋白共有 30 個磷酸化位點，其中Thr、Ser和Tyr磷酸化位點分別有18、9、3個(圖6)。

圖6 HSP27磷酸化位點分析Fig.6 HSP27 phosphorylation sites analysis

2.3 藏羊HSP27基因過表達載體和沉默載體構(gòu)建及細胞水平的檢測

2.3.1 載體轉(zhuǎn)染至顆粒細胞后對細胞形態(tài)變化及細胞計數(shù)的影響 將獲得的AdCMV-HSP27、AdCMV-GFP-H1-shRNA/HSP27重組質(zhì)粒交由上海生工生物工程股份公司測序，將測序結(jié)果對比，藏羊HSP27基因重組序列與NCBI上傳的綿羊HSP27基因序列一致。

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至卵巢顆粒細胞中，觀察細胞形態(tài)及細胞計數(shù)變化。細胞形態(tài)變化：轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)0 h時，各轉(zhuǎn)染組之間細胞生長情況均良好，細胞呈現(xiàn)貼壁趨勢；培養(yǎng)24 h時，空白組細胞生長狀態(tài)優(yōu)于其他3組，且空白組細胞密度高于其他3組；培養(yǎng)至48 h時，空白組細胞貼壁形態(tài)趨于穩(wěn)定并且分布較均勻，細胞呈長梭形伴有少量突起，細胞核呈卵圓形，此時空白組細胞生長大致進入第3代，過表達組與陰性對照組細胞數(shù)量明顯增長，細胞密度增加，懸浮細胞增多，細胞多呈現(xiàn)不規(guī)則的多邊形，沉默組細胞大量脫落，細胞皺縮并出現(xiàn)空泡，貼壁細胞數(shù)目明顯減少；培養(yǎng)至72 h時，空白組細胞生長狀態(tài)最佳，貼壁牢固，細胞間緊密相連，此時空白組細胞生長大致進入第4代，過表達組貼壁細胞的分支收縮，細胞核變形分解，此時過表達組細胞生長大致進入第5或6代，沉默組細胞前端偽足伸出明顯減少，細胞皺縮變圓，大量凋亡脫落(圖7)。

圖7 不同轉(zhuǎn)染分組及不同培養(yǎng)時間細胞形態(tài)顯微鏡下表現(xiàn)(40×)Fig.7 Morphological appearance of cells in different transfection groups and under different culture time (40×)

細胞計數(shù)結(jié)果顯示，培養(yǎng)至72 h時各轉(zhuǎn)染組間的總體差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=44.289，P<0.05)，沉默載體組細胞數(shù)量極顯著低于其他各組(P<0.01)，過表達組細胞數(shù)量顯著低于空白組和陰性對照組(P<0.05，圖8)。

**.P<0.01，*.P<0.05，下同**.P<0.01,*.P<0.05,the same as below圖8 不同轉(zhuǎn)染組細胞計數(shù)結(jié)果(n=3)Fig.8 Cell count results of different transfection groups(n=3)

2.3.2 過表達或沉默載體轉(zhuǎn)染至顆粒細胞后對相關(guān)基因mRNA表達水平的影響 將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)染至卵巢顆粒細胞中，培養(yǎng)24 h。RT-PCR檢測HSP27基因mRNA的表達水平，同時檢測卵巢顆粒細胞各處理組GDF9、BMPR-1B、Erβ基因mRNA的表達水平，檢測結(jié)果顯示，過表達載體組細胞中HSP27基因mRNA表達水平極顯著高于空白對照組(P<0.01)，沉默載體組細胞HSP27基因mRNA表達水平極顯著低于陰性對照組(P<0.01)，表明轉(zhuǎn)染成功且過表達載體及沉默載體構(gòu)建成功；過表達載體組細胞中GDF9、BMPR-1B、Erβ基因mRNA 表達水平均極顯著高于空白組(P<0.01)，沉默載體組細胞Erβ基因mRNA表達水平極顯著低于陰性對照組(P<0.01)，沉默載體組細胞GDF9、BMPR-1B基因mRNA表達水平與陰性對照組差異不顯著(P>0.05，圖9)。

圖9 HSP27基因過表達及沉默載體轉(zhuǎn)染對藏羊卵泡發(fā)育相關(guān)基因表達的影響(n=6)Fig.9 Effect of HSP27 overexpression and silent vectors transfection on the expression of genes related to follicular development in Tibetan sheep(n=6)

3 討 論

HSP27基因廣泛存在于哺乳動物卵巢、子宮、睪丸、前列腺等多種組織中，與動物繁殖密切相關(guān)[17]。已有研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)開展不同產(chǎn)羔性狀綿羊分別在卵泡不同發(fā)育階段卵巢組織中差異蛋白表達的檢測，篩選出與綿羊產(chǎn)羔性狀相關(guān)的關(guān)鍵蛋白HSPs，并且利用體外表達及生物信息學(xué)方式預(yù)測HSP27基因在綿羊卵泡發(fā)育過程中扮演著重要的角色，但其如何調(diào)控羊的卵泡發(fā)育，具體的作用機制尚不清楚[18-19]。本試驗成功克隆了藏羊卵巢HSP27基因序列，其CDS區(qū)長618 bp，與 NCBI 上登錄的綿羊mRNA序列一致性達99.72%，本試驗結(jié)果同何翃閎等[20]克隆的牦牛HSP27基因結(jié)果相似，其通過熒光定量PCR檢測到牦牛HSP27基因在卵巢中的表達量高于輸卵管和子宮。序列分析發(fā)現(xiàn)，藏羊HSP27基因可編碼203個氨基酸，共含有 19 種氨基酸，其中含量最高的是絲氨酸Ser，占總氨基酸的10.3%。絲氨酸作為哺乳動物機體的一種功能性氨基酸，是合成半胱氨酸Cys和甘氨酸Gly的前體[21]。姚蘭春等[22]用絲氨酸處理小鼠，觀察對其排卵的影響，發(fā)現(xiàn)絲氨酸對小鼠具有促排卵的作用；王禹盟等[23]研究發(fā)現(xiàn)，甘氨酸處理能顯著提高豬卵丘細胞擴散直徑進而提高卵母細胞體外成熟率；羅惠娣等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在羔羊卵母細胞成熟液里添加半胱氨酸能夠促進卵母細胞的成熟，同時能有效提高體外生產(chǎn)胚胎的質(zhì)量。由此可推測，藏羊HSP27蛋白能夠促進卵泡發(fā)育。磷酸化是控制蛋白質(zhì)活動機制的一部分，可以參與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)酶的活性[25]，研究表明，在卵母細胞GVBD期發(fā)生的時候，HSP27在經(jīng)過一系列磷酸化后能夠增強細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并激活p38-MAPK通路使得孕酮、雌二醇和類固醇等蛋白水平上調(diào)從而促進卵母細胞發(fā)育成熟[10]，本研究中，HSP27蛋白存在30個磷酸化位點，可以推測其在修飾后對藏羊卵母細胞成熟具有重要作用。

卵泡發(fā)育包括顆粒細胞的增殖、分化、凋亡及卵母細胞成熟閉鎖幾個方面，卵母細胞發(fā)育能力在一定程度上受顆粒細胞凋亡的影響。HSP27蛋白作為卵泡發(fā)育過程中的第一類蛋白，主要以保護細胞功能活性的形式發(fā)揮內(nèi)源性保護機制，參與到哺乳動物卵泡的生長發(fā)育過程中。研究發(fā)現(xiàn)，HSP27基因在哺乳動物機體中能夠介入細胞凋亡信號通路而直接干擾細胞凋亡，HSP27能夠不依賴于ATP而抑制ras GTP酶的活性，增加抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xl的豐度，減少促凋亡因子Bax的蛋白含量，抑制細胞色素c介導(dǎo)的caspase-3和多聚腺苷酸聚合酶的活性，抑制凋亡小體復(fù)合物的功能[26]。在雌性哺乳動物中，卵母細胞儲備量一出生就已確定，卵巢中99.9%的卵泡在不同階段閉鎖，只有少數(shù)卵泡發(fā)育成熟并完成排卵。在早期卵泡閉鎖過程中，顆粒細胞首先由內(nèi)層向外層逐漸凋亡，進而誘導(dǎo)卵母細胞凋亡，加劇卵泡的閉鎖，降低排卵率；當外源干擾減弱顆粒細胞凋亡時，優(yōu)勢卵泡的選擇受阻，諸多早期卵泡均持續(xù)發(fā)育，進而促使卵母細胞發(fā)育成熟，增加排卵。當HSP27基因表達水平上升時，能夠影響下丘腦GnRH以及垂體促性腺激素中的FSH和LH對卵泡顆粒細胞核或膜細胞下游作用的調(diào)節(jié)，抑制顆粒細胞凋亡的觸發(fā)，進而調(diào)控哺乳動物卵泡發(fā)育及排卵過程[27]。本試驗將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)染至顆粒細胞并在顯微鏡下進行細胞形態(tài)和細胞計數(shù)試驗，研究發(fā)現(xiàn)，當HSP27基因過表達時顆粒細胞增殖分化速度加快，提前進入第5～6代，當沉默HSP27基因時顆粒細胞會大量皺縮凋亡，即過表達HSP27基因能夠促進顆粒細胞增殖分化，敲低HSP27基因會觸發(fā)顆粒細胞凋亡，由此可以推測，干擾HSP27基因可能會影響顆粒細胞的增殖分化和凋亡，進而影響卵泡發(fā)育，具體作用機制還有待進一步研究。

載體構(gòu)建就是構(gòu)建含外源DNA的質(zhì)粒，是一種常用的分子生物學(xué)研究手段。構(gòu)建過表達載體可通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法將目的基因?qū)氚屑毎蚱鞴賉28]，本試驗擴增出藏羊HSP27基因序列并克隆至pUC57載體，通過雙酶切、轉(zhuǎn)化、重組、培養(yǎng)等步驟構(gòu)建AdCMV-HSP27過表達載體。RNA干擾技術(shù)中的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)是人工合成的一種基因沉默載體構(gòu)建方式[29]，本試驗設(shè)計了藏羊HSP27基因的干擾序列并通過靶點設(shè)計、連接、轉(zhuǎn)化、篩選等步驟最終構(gòu)建藏羊HSP27基因的沉默載體。本試驗將構(gòu)建的過表達載體及沉默載體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至藏羊卵巢顆粒細胞，通過RT-PCR檢測HSP27基因mRNA表達水平，結(jié)果表明，過表達載體及沉默載體構(gòu)建成功。潘章源等[30]研究發(fā)現(xiàn)，BMPR-1B直接作用于綿羊卵巢、子宮，通過抑制cAMP的釋放以及孕酮、雌二醇和雄烯二酮激素的合成促使母羊顆粒細胞加快分化，加速卵泡成熟，郭慧慧等[31]研究發(fā)現(xiàn)，BMPR-1B基因影響顆粒細胞分化和卵泡發(fā)育，具有促進排卵的作用，徐敏麗等[32]研究發(fā)現(xiàn)，GDF9基因在卵巢中主要由卵母細胞分泌，對卵泡的生長分化和胚胎的發(fā)育起重要的調(diào)節(jié)作用，本試驗中，HSP27基因過表達載體組與空白組相比BMPR-1B、GDF9的表達量均極顯著增加，沉默載體組較陰性對照組BMPR-1B、GDF9的表達量下調(diào)，但差異均不顯著，表明干擾HSP27基因表達會影響卵巢顆粒細胞BMPR-1B、GDF9基因的表達量。雌二醇(estradiol，E2)是重要的雌激素，可以由卵巢顆粒細胞合成并分泌，E2通過雌激素受體(包括Erα和Erβ)參與卵巢功能的調(diào)控[33]，本試驗中，HSP27基因過表達載體組與空白組相比Erβ的表達量極顯著增加，且沉默載體組與陰性對照組相比Erβ的表達量極顯著降低。結(jié)合前人研究結(jié)果提示，HSP27基因可能通過提高BMPR-1B、GDF9、Erβ基因的表達水平來間接提高藏羊卵泡發(fā)育，具體作用機制還有待進一步研究，結(jié)合本研究結(jié)果，以期進一步探究HSP27基因在藏羊卵泡發(fā)育過程中的分子機制和調(diào)控機理。

4 結(jié) 論

本試驗成功克隆了藏羊HSP27基因CDS區(qū)序列，并成功構(gòu)建了藏羊HSP27基因過表達載體及沉默載體，同時將所得到的載體轉(zhuǎn)染至卵巢顆粒細胞。根據(jù)形態(tài)學(xué)及細胞計數(shù)結(jié)果初步推測，當HSP27基因過表達時能夠促進顆粒細胞增殖分化，當沉默HSP27基因時可能會觸發(fā)顆粒細胞凋亡進而影響卵泡發(fā)育，同時HSP27基因可能通過提高BMPR-1B、GDF9、Erβ基因的表達水平來間接促進藏羊卵泡發(fā)育。以上研究結(jié)果均可為HSP27基因在藏羊卵泡發(fā)育過程中的功能研究奠定試驗基礎(chǔ)。