雞脂肪組織TCF21基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化與其表達(dá)的關(guān)系

劉雨萌，馬艷艷，姜海煦，張心揚(yáng)，武春艷，程博涵，李 輝*

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2.黑龍江普通高等學(xué)校動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030)

脂肪組織不僅是能量?jī)?chǔ)存庫(kù)，也是機(jī)體最大的內(nèi)分泌器官，通過分泌各種內(nèi)分泌和旁分泌因子來調(diào)節(jié)多種生理過程[1-2]。脂肪組織生長(zhǎng)發(fā)育的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)是脂肪細(xì)胞數(shù)量的增多和體積的增大[3]。其中，脂肪細(xì)胞的數(shù)量主要受多潛能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞定向及前脂肪細(xì)胞增殖的調(diào)控，而脂肪細(xì)胞的體積則與其分化程度及甘油三酯積累量有關(guān)[4-5]。脂肪組織的生長(zhǎng)發(fā)育主要受轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，如過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)[6]、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBPs)[7]、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)[8]、Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子(KLFs)[9]和GATA結(jié)合蛋白(GATAs)[10]等。此外，不斷有研究發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控脂肪組織生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用，如堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)家族中的轉(zhuǎn)錄因子TFE3、Ids等[11-12]。

DNA甲基化是一種重要的調(diào)控基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，其調(diào)節(jié)基因表達(dá)的主要方式為改變DNA的穩(wěn)定性、構(gòu)象以及與蛋白質(zhì)之間的相互作用[22-23]。DNA甲基化一般導(dǎo)致基因沉默[24-25]；而DNA去甲基化則相反，往往會(huì)重新激活沉默基因的表達(dá)[26]。近年來一些研究結(jié)果顯示，DNA甲基化在脂肪組織生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用[27-28]。Li等[29]發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)分化的小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞中，C/EBPα基因的啟動(dòng)子呈高甲基化狀態(tài)，而在未分化的3T3-L1前脂肪細(xì)胞中卻沒有檢測(cè)到這種高甲基化信號(hào)增加。有研究表明，用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-Aza-dC)處理小鼠C3H/10T1/2干細(xì)胞后，會(huì)增加其定向分化為脂肪細(xì)胞的能力[30]。Li等[31]利用MeDIP-seq技術(shù)繪制了豬不同部位脂肪組織(背部淺表脂肪組織和背部深層脂肪組織)的DNA甲基化圖譜，發(fā)現(xiàn)與深層脂肪組織相比，淺表脂肪組織中的DNA甲基化程度更高，表明不同部位脂肪組織的甲基化程度不同。以上研究表明，DNA甲基化在脂肪組織的生長(zhǎng)發(fā)育中扮演重要角色。近年來，對(duì)TCF21基因DNA甲基化的研究主要集中在癌癥上面。在多種癌癥中發(fā)現(xiàn)TCF21基因的表達(dá)與其啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化的狀態(tài)密切相關(guān)[32-35]。到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)脂肪組織中TCF21基因DNA甲基化水平與其表達(dá)關(guān)系的研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室以腹脂率和血漿極低密度脂蛋白為選擇指標(biāo)，構(gòu)建了東北農(nóng)業(yè)大學(xué)肉雞高、低腹脂雙向選擇品系(Northeast Agricultural University broiler lines divergently selected for abdominal fat content，NEAUHLF)[36]。目前，這兩個(gè)品系已經(jīng)選育了24個(gè)世代，兩品系肉雞之間腹脂率差異極顯著。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TCF21基因在第19世代高脂系肉雞腹部脂肪組織中的表達(dá)水平顯著高于低脂系肉雞[21]，但其潛在的調(diào)控機(jī)制還不清楚。鑒于此，本研究將在前期研究的基礎(chǔ)上，探究雞脂肪組織中TCF21基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化與其表達(dá)之間的關(guān)系。研究結(jié)果將有助于揭示高、低脂系肉雞腹部脂肪組織中TCF21基因差異表達(dá)的原因，為深入研究雞TCF21基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以高、低脂系第24世代7周齡肉雞(來自于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)阿城畜牧基地雞場(chǎng))為試驗(yàn)材料(每個(gè)品系15只雞)。禁食12 h后稱量體重(BW)并屠宰，屠宰后稱量腹脂重(AFW)，并計(jì)算腹脂率(AFP=AFW/BW)。采集的腹部脂肪組織樣品于0.75%氯化鈉中清洗，剪成小塊，放置于5 mL采樣管中，并于液氮中速凍，-80 ℃保存待用。需要說明的是：高、低脂系肉雞第24世代每個(gè)品系各組建了40個(gè) 半同胞家系，定向輸精、系譜孵化。每個(gè)品系孵化出1 000只左右的雛雞，公母各半。所有公雞按照肉仔雞的飼養(yǎng)方式飼養(yǎng)至7周齡屠宰。在挑選用于組織樣品采集的雞只時(shí)，要符合以下兩個(gè)條件：1)每個(gè)品系的15只雞生長(zhǎng)發(fā)育正常；2)每個(gè)品系的15只雞來源于不同的半同胞家系。

1.2 載體和細(xì)胞系

海腎熒光素酶報(bào)告基因載體pRL-TK和螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-basic由本實(shí)驗(yàn)室留存；不含CpG位點(diǎn)的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因載體，pCpGL-basic由揚(yáng)州大學(xué)戴超輝惠贈(zèng)[37]；永生化雞前脂肪細(xì)胞(ICP1、ICP2細(xì)胞)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[38]。

1.3 主要試劑

TRIzol RNA分離試劑、DMEM/F12培養(yǎng)基、Opti-MEM無血清培養(yǎng)基、LipofectamineTM3000 Transfection Reagent、Penicillin-Streptomycin Liquid購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；0.25% Trypsin-EDTA(1×)購(gòu)自Gibco公司；PBS緩沖液粉末購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser購(gòu)自TaKaRa公司；Fast Start Universal SYBR Green Master購(gòu)自Roche公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自Biological Industries公司；CpG甲基轉(zhuǎn)移酶(M.SssI)購(gòu)自NEB公司；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自Axygen公司；雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒Dual-Luciferase?Reporter Assay System購(gòu)自Promega公司。

1.4 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

利用JASPAR(http://jaspar.genereg.net/)、TRANSFAC(http://gene-regulation.com/pub/databases.html)、AnimalTFDB(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB)預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。利用MethPrimer(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)預(yù)測(cè)雞TCF21基因啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)、CpG島的數(shù)量和分布。將片段長(zhǎng)度大于200 bp，CG含量超過50%，CG核苷酸比率大于0.6 的片段定義為CpG島。

1.5 引物設(shè)計(jì)和合成

本研究所用引物均根據(jù)雞的全基因組序列(http://genome.ucsc.edu,UCSC)Mar.2018(GRCg6a/galGal6)來設(shè)計(jì)，并委托北京英濰捷基公司進(jìn)行合成。TCF21基因表達(dá)檢測(cè)引物使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，其中TCF21-P1擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為264 bp、TBP-P1擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為122 bp。TCF21基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化檢測(cè)引物使用Agena EpiDesigner程序設(shè)計(jì)，其中TCF21-P2引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為487 bp(-1 961～-1 475 bp)、TCF21-P3引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為467 bp(-1 455～-989 bp)、TCF21-P4引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為423 bp(-1 013～-590 bp)、TCF21-P5引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為490 bp(-676～-187 bp)、TCF21-P6引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為334 bp(-170～+164 bp)。引物信息見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.6 RT-qPCR

采用 TRIzol 試劑提取脂肪組織的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。Real-Time PCR反應(yīng)液的組成：SYBR 5 μL，上/下游引物各0.2 μL，H2O 3.6 μL，cDNA 1 μL，總體系為10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。以TATA盒結(jié)合蛋白(TATA-box binding protein，TBP)為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct方法計(jì)算TCF21基因的相對(duì)表達(dá)水平[39]，其中ΔCt =Ct(TCF21)-Ct(TBP)。TCF21基因表達(dá)檢測(cè)引物序列見表1。

來了一個(gè)人，正在打量投水似的神氣，把花條子襯衣下角長(zhǎng)長(zhǎng)的拖著，作成北京城大學(xué)生特有的丑樣子，在臉上，也正同樣有一派老去民族特有的憔悴顏色。

1.7 Sequenom MassARRAY檢測(cè)DNA甲基化

采用QIAamp DNA Mini Kit提取雞腹部脂肪組織DNA。采用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit說明書對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理。以上述亞硫酸鹽處理的DNA為試驗(yàn)材料，利用Sequenom MassARRAY飛行質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行TCF21基因啟動(dòng)子區(qū)CpG單元的甲基化水平檢測(cè)(委托上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成)。一個(gè)CpG單元表示一個(gè)單獨(dú)的CpG位點(diǎn)或者是多個(gè)聯(lián)合的CpG位點(diǎn)[40-41]。TCF21基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化檢測(cè)引物見表1。

1.8 啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建

委托金唯智生物技術(shù)公司合成雞TCF21基因啟動(dòng)子(將5′-UTR對(duì)應(yīng)的基因組區(qū)域及5′-UTR上游2 000 bp定義為TCF21基因啟動(dòng)子)及5′端截短的啟動(dòng)子片段并連接至pGL3-Basic載體，構(gòu)建含有TCF21基因啟動(dòng)子及5′端截短的啟動(dòng)子片段的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因載體，分別命名為pGL3-2000/+165、pGL3-1500/+165、pGL3-1000/+165、pGL3-500/+165、pGL3-200/+165、pGL3-100/+165，并將雞TCF21基因5′-UTR對(duì)應(yīng)的基因組區(qū)域及5′-UTR上游2 000 bp定義為雞TCF21基因啟動(dòng)子。委托金唯智生物技術(shù)公司合成TCF21基因啟動(dòng)子R2+R3區(qū)域(-1 500～-500 bp)、R2區(qū)域(-1 500～-1 000 bp)、R3區(qū)域(-1 000～-500 bp)DNA片段并連接至pCpGL-Basic載體(該載體骨架不含CG位點(diǎn))，構(gòu)建含有TCF21基因啟動(dòng)子重要區(qū)域的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因載體，分別命名為pCpGL-1500/-500、pCpGL-1500/-1000和pCpGL-1000/-500。

1.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及熒光素酶活性檢測(cè)

將永生化雞前脂肪細(xì)胞接種于24孔板，當(dāng)細(xì)胞70%～90%匯合時(shí)，采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建好的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和海腎熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒以100∶1的比例轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，根據(jù)Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)試劑盒說明書分別檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性(Fluc)和海腎熒光素酶活性(Rluc)。TCF21基因啟動(dòng)子活性用相對(duì)熒光素酶活性(Fluc/Rluc)表示。

1.10 DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶處理啟動(dòng)子報(bào)告基因載體

甲基化組：用CpG甲基轉(zhuǎn)移酶(M.SssI)在37 ℃ 條件下對(duì)pCpGL-TCF21-1500/-500、pCpGL-TCF21-1500/-1000、pCpGL-TCF21-1000/-500質(zhì)粒及陽性對(duì)照質(zhì)粒pGL3-P1和陰性對(duì)照質(zhì)粒pCpGL-basic處理4 h。CpG甲基化酶(M.Sssl)反應(yīng)體系：10×NEBuffer 230 μL，S-adenosylmethionone (1 600 μmol·L-1)30 μL，質(zhì)粒15 μg，甲基轉(zhuǎn)移酶3.75 μL，補(bǔ)充Nuclease-free water至150 μL。非甲基化組：反應(yīng)體系中用Nuclease-free water代替甲基轉(zhuǎn)移酶，其它操作與甲基化組相同。質(zhì)粒處理4 h后，利用PCR純化試劑盒對(duì)甲基化組與非甲基化組的質(zhì)粒進(jìn)行純化，-20 ℃保存待用。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)結(jié)果都表示為“平均值(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)”。采用Student’st-test進(jìn)行兩組數(shù)據(jù)的差異顯著性分析。利用Pearson相關(guān)系數(shù)分析DNA甲基化水平與基因表達(dá)水平之間的相關(guān)性。P<0.05 表示差異顯著或相關(guān)性顯著，P<0.01或P<0.001表示差異極顯著或相關(guān)性極顯著。統(tǒng)計(jì)分析所用軟件為JMP 11.0(SAS Institute)。

2 結(jié) 果

2.1 高、低脂系肉雞脂肪組織中TCF21基因表達(dá)水平的比較分析

結(jié)果顯示，高脂系肉雞的腹脂率極顯著高于低脂系肉雞(P<0.001，圖1A)。高脂系肉雞腹部脂肪組織中TCF21基因mRNA表達(dá)水平極顯著高于低脂系肉雞(P<0.001，圖1B)。

A.第24世代7周齡高、低脂系肉雞腹脂率的比較；B.第24世代7周齡高、低脂系肉雞腹部脂肪組織中TCF21基因的mRNA表達(dá)情況。LEAN代表低脂系肉雞(n=15)，F(xiàn)AT代表高脂系肉雞(n=15)；***.P<0.001，下同A.Comparison of abdominal fat percentage between lean and fat line broilers at 7 weeks of age from the 24th generation of NEAUHLF;B.Expression of TCF21 mRNA in abdominal adipose tissue of fat and lean broilers at 7 weeks of age from the 24th generation of NEAUHLF.LEAN represent lean line broilers (n=15),FAT represent fat line broilers (n=15).***.P<0.001,the same as below圖1 高、低脂系肉雞第24世代7周齡腹脂率及腹部脂肪組織中TCF21基因的mRNA表達(dá)情況Fig.1 Comparison of AFP and the expression of TCF21 mRNA in abdominal adipose tissue of fat and lean broilers at 7 weeks of age from the 24th generation of NEAUHLF

2.2 雞TCF21基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)與功能的初步分析

Methprimer在線軟件分析結(jié)果顯示，雞TCF21基因的啟動(dòng)子區(qū)(5′-UTR對(duì)應(yīng)的基因組區(qū)域及5′-UTR上游2 000 bp)不存在CpG島，但存在40個(gè)CpG位點(diǎn)，這些CpG位點(diǎn)在啟動(dòng)子的近端和遠(yuǎn)端均有分布(圖2)。

每條豎線代表一個(gè)CpG位點(diǎn)Each vertical line represents a CpG site圖2 雞TCF21基因啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)分布Fig.2 Distribution of CpG sites in the promoter region of chicken TCF21

啟動(dòng)子報(bào)告基因活性分析結(jié)果顯示，當(dāng)TCF21基因啟動(dòng)子從-2 000 bp截短到-1 500 bp時(shí)，啟動(dòng)子活性降低，暗示TCF21基因啟動(dòng)子-2 000～-1 500 bp之間存在重要的正調(diào)控元件，將該區(qū)域命名為“R1”(圖3A、B、C)；當(dāng)TCF21基因啟動(dòng)子從-1 500 bp截短到-1 000 bp時(shí)，啟動(dòng)子活性上升，暗示TCF21基因啟動(dòng)子-1 500～-1 000 bp之間存在重要的負(fù)調(diào)控元件，將該區(qū)域命名為“R2”(圖3A、B、C)；當(dāng)TCF21基因啟動(dòng)子從-1 000 bp截短到-500 bp時(shí)，啟動(dòng)子活性上升，暗示TCF21基因啟動(dòng)子-1 000～-500 bp之間存在重要的負(fù)調(diào)控元件，將該區(qū)域命名為“R3”(圖3A、B、C)；當(dāng)TCF21基因啟動(dòng)子從-500 bp截短到-200 bp時(shí)，啟動(dòng)子活性降低，暗示TCF21基因啟動(dòng)子-500～-200 bp之間存在重要的正調(diào)控元件，將該區(qū)域命名為“R4”(圖3A、B、C)；當(dāng)TCF21基因啟動(dòng)子從-200 bp截短到-100 bp時(shí)，啟動(dòng)子活性消失，說明TCF21基因啟動(dòng)子-200～-100 bp之間具有維持TCF21基因轉(zhuǎn)錄活性的基本元件，該區(qū)域是TCF21基因啟動(dòng)子的核心區(qū)域，將該區(qū)域命名為“Core”(圖3A、B、C)。此外，將TCF21啟動(dòng)子-100～ +165 bp的區(qū)域命名為R5(圖3C)。

為明確哪些轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)控雞TCF21基因啟動(dòng)子的活性，本研究利用JASPAR、TRANSFAC和AnimalTFDB在線軟件分析了雞TCF21基因啟動(dòng)子各個(gè)區(qū)域內(nèi)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果顯示，雞TCF21基因啟動(dòng)子R1區(qū)域(-2 000～-1 500 bp)存在CDX1、HOXA2、PDX1、Pax2及Sox17的結(jié)合位點(diǎn)；R2區(qū)域(-1 500～-1 000 bp)存在Pax2、Sox10、FOS、SPIB及FOXP3的結(jié)合位點(diǎn)；R3區(qū)域(-1 000～-500 bp)存在FOXA1、CREB1、Sox3及STAT3的結(jié)合位點(diǎn)；R4區(qū)域(-500～ -200 bp)存在IRF7、KLF5及Pax2的結(jié)合位點(diǎn)；Core區(qū)域(-200～-100 bp)存在KLFs(KLF4、KLF5、KLF16)，Sps(Sp1、Sp2、Sp3)及GATA5的結(jié)合位點(diǎn)(圖3D)。

A.ICP1細(xì)胞中雞TCF21基因啟動(dòng)子的報(bào)告基因分析；B.ICP2細(xì)胞中雞TCF21基因啟動(dòng)子的報(bào)告基因分析；C.TCF21基因啟動(dòng)子重要區(qū)域；D.雞TCF21基因啟動(dòng)子區(qū)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。*. P<0.05，**.P<0.01，下同A.Reporter gene analysis of chicken TCF21 promoter in ICP1 cells;B.Reporter gene analysis of chicken TCF21 promoter in ICP2 cells;C.The important region of TCF21 promoter;D.The potential transcription factor binding site in the chicken TCF21 promoter region.*.P<0.05,**.P<0.01,the same as below圖3 雞TCF21基因啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)和功能的初步分析Fig.3 Structure and function analysis of chicken TCF21 promoter

2.3 TCF21基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化分析

利用Sequenom MassARRAY飛行質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)高、低脂系肉雞7周齡腹部脂肪組織中TCF21基因啟動(dòng)子區(qū)(-2 000～+165 bp)40個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化程度。需要說明的是：一個(gè)CpG單元表示一個(gè)單獨(dú)的CpG位點(diǎn)或者是多個(gè)聯(lián)合的CpG位點(diǎn)。據(jù)此，將40個(gè)CpG位點(diǎn)劃分為38個(gè)CpG單元(CpG_32與CpG_33合并、CpG_37與CpG_38合并,圖4)。本研究成功檢測(cè)到31個(gè)CpG單元的甲基化，其中3個(gè)CpG單元位于R1區(qū)域、7個(gè)CpG單元位于R2區(qū)域、6個(gè)CpG單元位于R3區(qū)域、5個(gè)CpG單元位于R4區(qū)域、1個(gè)CpG單元位于Core區(qū)域、9個(gè)CpG單元位于R5區(qū)域(圖4)。

每一行表示一個(gè)樣本，每一列表示一個(gè)CpG單元。從淺黃色到紅色的變化顯示甲基化水平的升高，白色表示甲基化水平為0或缺失值Each sample is shown in one row,each CpG unit is shown in a column.The methylation degree is shown as a gradient varying from yellow to red.White indicates that methylation level of the CpG unit is 0 or missing data圖4 高、低脂系肉雞脂肪組織中TCF21基因啟動(dòng)子區(qū)CpG單元分布及其甲基化狀態(tài)Fig.4 The distribution and methylation status of CpG units in the promoter region of TCF21 in adipose tissue of fat and lean line broilers

根據(jù)檢測(cè)得到的DNA甲基化情況，本研究首先從整體水平分析了高、低脂系肉雞腹部脂肪組織中TCF21基因啟動(dòng)子及啟動(dòng)子各個(gè)區(qū)域的DNA甲基化程度(用每個(gè)區(qū)域內(nèi)所有成功檢測(cè)的CpG單元的平均甲基化水平來代表該區(qū)域的DNA甲基化水平,圖5)。結(jié)果顯示，TCF21基因啟動(dòng)子的DNA甲基化水平在高、低脂系間差異不顯著(P>0.05；圖5H)，高脂系R2、R3及R2+R3的區(qū)域DNA甲基化水平顯著或極顯著高于低脂系(P<0.05或P<0.001；圖5B、C、G)，其他區(qū)域(R1區(qū)域、R4區(qū)域、Core區(qū)域、R5區(qū)域)的DNA甲基化水平在高、低脂系間差異不顯著(P>0.05；圖5A、D、E、F)。

A～G.TCF21基因啟動(dòng)子R1、R2、R3、R4、Core、R5和R2+R3區(qū)域的DNA甲基化分析；H.TCF21基因啟動(dòng)子DNA甲基化分析。ns.差異不顯著A-G.DNA methylation analysis of R1，R2，R3，R4，Core,R5 and R2+R3 regions of TCF21 promoter,respectively;H.DNA methylation analysis of promoter of TCF21.ns.Not significant圖5 高、低脂系肉雞脂肪組織中TCF21基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平的比較Fig.5 Comparison of DNA methylation level of TCF21 promoter in adipose tissue between fat and lean broilers

另外，本研究還分析了高、低脂系肉雞腹部脂肪組織中TCF21基因啟動(dòng)子區(qū)每個(gè)CpG單元的DNA甲基化水平。結(jié)果顯示，高、低脂系肉雞間存在甲基化水平差異的CpG單元有8個(gè)，包括CpG_6、CpG_7、CpG_10、CpG_11、CpG_12、CpG_20、CpG_29、CpG_32,33，其中高脂系CpG_6、CpG_7、CpG_10、CpG_12、CpG_20、CpG_32,33單元的甲基化水平顯著或極顯著高于低脂系，而高脂系CpG_11和CpG_29單元的甲基化水平顯著低于低脂系(表2)。

2.4 TCF21基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平與其mRNA 表達(dá)水平的相關(guān)性分析

首先，從整體水平分析高、低脂系肉雞腹部脂肪組織中TCF21基因啟動(dòng)子及啟動(dòng)子各個(gè)區(qū)域的DNA甲基化水平與其mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性。結(jié)果顯示，TCF21基因啟動(dòng)子R2區(qū)域、R3區(qū)域及R2+R3區(qū)域DNA甲基化水平與TCF21基因mRNA表達(dá)水平呈顯著的正相關(guān)(R2區(qū)域：r=0.438，P<0.05；R3區(qū)域：r=0.371，P<0.05；R2+R3區(qū)域：r=0.489，P<0.05；圖6B、C、G)。以上結(jié)果表明，TCF21基因啟動(dòng)子R2和R3區(qū)域的DNA甲基化對(duì)于調(diào)控TCF21 mRNA的表達(dá)可能具有重要作用。

除此之外，本研究還分析了單個(gè)CpG單元的甲基化水平與TCF21基因mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性，結(jié)果見表2。高、低脂系肉雞中顯著差異的8個(gè)CpG單元的甲基化水平與TCF21 mRNA表達(dá)水平相關(guān)分析的結(jié)果顯示：CpG_7、CpG_10、CpG_20的甲基化水平與TCF21 mRNA表達(dá)水平呈顯著或極顯著正相關(guān)(P<0.05或P<0.01)，CpG_29的甲基化水平與TCF21 mRNA表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

表2 TCF21基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)以及單個(gè)CpG單元甲基化水平與其mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性Table 2 The DNA methylation status of TCF21 promoter region and the correlation of the levels of individual CpG unit methylation with TCF21 mRNA expression

A.TCF21基因啟動(dòng)子R1區(qū)域DNA甲基化與其mRNA表達(dá)的相關(guān)性；B.TCF21基因啟動(dòng)子R2區(qū)域DNA甲基化與其mRNA表達(dá)的相關(guān)性；C.TCF21基因啟動(dòng)子R3區(qū)域DNA甲基化與其mRNA表達(dá)的相關(guān)性；D.TCF21基因啟動(dòng)子R4區(qū)域DNA甲基化與其mRNA表達(dá)的相關(guān)性；E.TCF21基因啟動(dòng)子Core區(qū)域DNA甲基化與其mRNA表達(dá)的相關(guān)性析；F.TCF21基因啟動(dòng)子R5區(qū)域DNA甲基化與其mRNA表達(dá)的相關(guān)性；G.TCF21基因啟動(dòng)子R2+R3區(qū)域DNA甲基化與其mRNA表達(dá)的相關(guān)性；H.TCF21基因啟動(dòng)子DNA甲基化與其mRNA表達(dá)的相關(guān)性A.The correlation between DNA methylation level of R1 region and TCF21 mRNA expression level;B.The correlation between DNA methylation level of R2 region and TCF21 mRNA expression level;C.The correlation between DNA methylation level of R3 region and TCF21 mRNA expression level;D.The correlation between DNA methylation level of R4 region and TCF21 mRNA expression level;E.The correlation between DNA methylation level of Core region and TCF21 mRNA expression level;F.The correlation between DNA methylation level of R5 region and TCF21 mRNA expression level;G.The correlation between DNA methylation level of R2+R3 region and TCF21 mRNA expression level;H.The correlation between DNA methylation level of promoter of TCF21 gene and TCF21 mRNA expression level圖6 肉雞腹部脂肪組織中TCF21基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平與其mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性Fig.6 Correlation between TCF21 promoter DNA methylation level and mRNA expression in abdominal adipose tissue of broilers

2.5 DNA甲基化對(duì)雞TCF21基因啟動(dòng)子活性的影響

本研究發(fā)現(xiàn)TCF21基因啟動(dòng)子R2、R3及R2+R3的區(qū)域DNA甲基化水平在高、低脂系肉雞腹部脂肪組織之間差異顯著，且R2區(qū)域、R3區(qū)域及R2+R3區(qū)域DNA甲基化水平與TCF21基因mRNA 表達(dá)水平顯著相關(guān)，提示TCF21啟動(dòng)子這些區(qū)域的DNA甲基化可能影響其mRNA表達(dá)。為進(jìn)一步分析TCF21啟動(dòng)子R2區(qū)域、R3區(qū)域及R2+R3區(qū)域的DNA甲基化是否影響其轉(zhuǎn)錄活性，首先將雞TCF21基因啟動(dòng)子R2區(qū)域、R3區(qū)域及R2+R3區(qū)域分別克隆到無CpG位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告基因載體pCpGL-basic上，將上述3個(gè)質(zhì)粒及pCpGL-basic分別與pRL-TK共轉(zhuǎn)染于雞ICP1細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，檢測(cè)報(bào)告基因活性。結(jié)果顯示，pCpGL-1500/-500(TCF21基因啟動(dòng)子R2+R3區(qū)域)、pCpGL-1500/-1000(TCF21基因啟動(dòng)子R2區(qū)域)、pCpGL-1000/-500(TCF21基因啟動(dòng)子R3區(qū)域)的報(bào)告基因活性顯著高于pCpGL-basic(P<0.05，圖7A)，說明TCF21啟動(dòng)子R2區(qū)域、R3區(qū)域、R2+R3區(qū)域在雞ICP1細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性。

隨后，將以上3個(gè)雞TCF21啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒、陽性對(duì)照質(zhì)粒pGL3-P1(該陽性對(duì)照質(zhì)粒是包含雞PPARγ基因P1啟動(dòng)子的報(bào)告基因載體，本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)DNA甲基化能顯著抑制pGL3-P1的報(bào)告基因活性[42]。因此，本研究用該陽性對(duì)照質(zhì)粒來證實(shí)DNA甲基化酶處理質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的有效性)及陰性對(duì)照質(zhì)粒pCpGL-basic利用CpG甲基轉(zhuǎn)移酶M.SssI處理，作為甲基化組；而未甲基化組則是用RNase Free H2O處理這5種質(zhì)粒。將甲基化的質(zhì)粒pCpGL-1500/-500、pCpGL-1500/-1000、pCpGL-1000/-500、pGL3-P1和pCpGL-basic以及他們對(duì)應(yīng)的未甲基化質(zhì)粒分別與pRL-TK共轉(zhuǎn)染于雞ICP1細(xì)胞中。報(bào)告基因活性分析結(jié)果顯示，甲基化的pGL3-P1的報(bào)告基因活性顯著低于其對(duì)應(yīng)的未甲基化的報(bào)告基因活性(P<0.05，圖7B)，說明DNA甲基化酶處理報(bào)告基因質(zhì)粒這一試驗(yàn)系統(tǒng)是有效的。此外，甲基化的pCpGL-1500/-500(TCF21基因啟動(dòng)子R2+R3區(qū)域)和pCpGL-1500/-1000(TCF21基因啟動(dòng)子R2區(qū)域)的報(bào)告基因活性顯著低于其對(duì)應(yīng)的未甲基化的報(bào)告基因活性，報(bào)告基因活性分別下調(diào)37%和47%(P<0.05，圖7B)，而pCpGL-1000/-500(TCF21基因啟動(dòng)子R3區(qū)域)在甲基化酶處理前后報(bào)告基因活性沒有顯著差異(P>0.05，圖7B)。盡管R2+R3區(qū)域的DNA甲基化對(duì)報(bào)告基因活性的抑制作用略弱于單獨(dú)的R2區(qū)域的DNA甲基化對(duì)報(bào)告基因活性的抑制作用，但差異并不顯著(P>0.05，圖7C)。以上結(jié)果說明R2區(qū)域的DNA甲基化會(huì)顯著抑制其轉(zhuǎn)錄活性，而無論是R3區(qū)域單獨(dú)存在還是與R2區(qū)域共同存在，R3區(qū)域的DNA甲基化均不會(huì)對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性造成影響。

A.TCF21基因啟動(dòng)子報(bào)告基因活性；B.TCF21基因啟動(dòng)子甲基化和未甲基化報(bào)告基因活性；C.TCF21基因啟動(dòng)子R2+R3區(qū)域及R2區(qū)域甲基化和未甲基化報(bào)告基因活性A.Reporter activity of TCF21 promoter;B.Reporter activity of methylation and unmethylation TCF21 promoter;C.Reporter activity of methylation and unmethylation R2+R3 and R2 regions of TCF21 promoter圖7 DNA甲基化對(duì)TCF21基因啟動(dòng)子活性的影響Fig.7 Effect of DNA methylation on promoter activity of TCF21

3 討 論

DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳學(xué)修飾，啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生的DNA甲基化通常與基因的轉(zhuǎn)錄沉默有關(guān)[43]。越來越多的研究表明，TCF21基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平與其表達(dá)水平密切相關(guān)。人類上的研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，胃癌組織中TCF21啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平顯著升高，同時(shí)其基因表達(dá)水平顯著降低，用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-AZA-2’-脫氧-胞嘧啶處理胃癌細(xì)胞可以上調(diào)TCF21的表達(dá)[44]。在頭部和頸部鱗狀細(xì)胞癌中，TCF21基因的DNA甲基化及基因表達(dá)狀態(tài)與在胃癌中相同，啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化抑制了該基因的表達(dá)[45]。到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)雞TCF21基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化與其表達(dá)關(guān)系相關(guān)的研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)TCF21基因在第24世代高、低脂系肉雞7周齡腹部脂肪組織中差異表達(dá)(圖1)，這與該群體第19世代的研究結(jié)果一致[21]。由于DNA甲基化與基因表達(dá)之間存在很強(qiáng)的聯(lián)系，這促使本課題組探究雞TCF21基因在高、低脂系腹部脂肪組織的差異表達(dá)是否受到其啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化的調(diào)控。因此，本研究檢測(cè)了雞腹部脂肪組織中TCF21基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示，在高、低脂系肉雞腹部脂肪組織中TCF21基因啟動(dòng)子R2、R3、R2+R3區(qū)域的DNA甲基化水平存在顯著差異(圖5)，提示TCF21基因在高、低脂系腹脂中的差異表達(dá)與R2和R3區(qū)域的DNA甲基化水平有關(guān)。隨后的研究發(fā)現(xiàn)TCF21基因啟動(dòng)子R2、R3、R2+R3區(qū)域的DNA甲基化水平與TCF21基因mRNA表達(dá)水平確實(shí)有關(guān)。但值得注意的是，TCF21基因啟動(dòng)子上述區(qū)域的DNA甲基化水平與其mRNA表達(dá)水平呈顯著的正相關(guān)(圖6)。這一結(jié)果與通常所熟知的DNA甲基化抑制基因的表達(dá)并不一致。推測(cè)原因可能是雞脂肪組織中TCF21基因的mRNA水平除了受DNA甲基化調(diào)控外，還受轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑等其它因素的調(diào)控。前人相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)了此類現(xiàn)象。在人的肝癌(HCC)和胃腸道癌(GI)細(xì)胞系中，TP73基因的表達(dá)就是通過DNA甲基化來激活的，當(dāng)TP73基因啟動(dòng)子區(qū)DNA未甲基化時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子CTCF和p53與TP73啟動(dòng)子不結(jié)合，TP73基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制；當(dāng)TP73基因啟動(dòng)子區(qū)DNA發(fā)生甲基化后，CTCF和p53可以與之結(jié)合，從而激活TP73基因的表達(dá)[46]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxA2基因啟動(dòng)子區(qū)DNA未甲基化時(shí)，Polycomb Group (PcG)蛋白作為轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物可與FoxA2啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，引起FoxA2啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3K27 me3修飾，進(jìn)而抑制FoxA2啟動(dòng)子活性與基因表達(dá)；當(dāng)FoxA2基因啟動(dòng)子區(qū)DNA發(fā)生甲基化后，阻礙了PcG蛋白與FoxA2啟動(dòng)子的結(jié)合，解除了PcG蛋白對(duì)FoxA2基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用，使FoxA2表達(dá)水平增加[47]。類似的研究發(fā)現(xiàn)，RHOC基因啟動(dòng)子區(qū)DNA未甲基化時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子KLF4與RHOC啟動(dòng)子不結(jié)合，RHOC啟動(dòng)子處于高度濃縮狀態(tài)，RHOC基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制；當(dāng)RHOC基因啟動(dòng)子區(qū)DNA發(fā)生甲基化后，KLF4可以與之結(jié)合，引起RHOC啟動(dòng)子區(qū)的染色質(zhì)發(fā)生重塑，染色質(zhì)由原來高度濃縮的狀態(tài)變?yōu)槭杷汕议_放的狀態(tài)，從而激活RHOC基因的表達(dá)[48]。因此，推測(cè)高脂系肉雞腹部脂肪組織中TCF21基因啟動(dòng)子R2和R3區(qū)域的高甲基化可能改變了某些轉(zhuǎn)錄因子與該區(qū)域的結(jié)合，影響了該區(qū)域組蛋白的修飾水平，增強(qiáng)了染色質(zhì)可及性，進(jìn)而促進(jìn)了TCF21基因的表達(dá)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究在分析雞前脂肪細(xì)胞中DNA甲基化是否影響TCF21基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，雞TCF21基因啟動(dòng)子R2區(qū)域和R2+R3區(qū)域的DNA高甲基化導(dǎo)致了報(bào)告基因活性的顯著降低，而雞TCF21基因啟動(dòng)子R3區(qū)域的DNA高甲基化沒有改變報(bào)告基因活性(圖7B)。這一結(jié)果與雞腹部脂肪組織中TCF21基因啟動(dòng)子R2、R3、R2+R3區(qū)域的DNA甲基化水平與TCF21基因mRNA表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)的結(jié)果并不一致，分析其原因可能有4個(gè)：1)兩個(gè)試驗(yàn)所用的試驗(yàn)材料不同。檢測(cè)TCF21基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平及mRNA表達(dá)水平時(shí)所用的試驗(yàn)材料為雞脂肪組織，而檢測(cè)DNA甲基化對(duì)TCF21基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性的影響時(shí)所用的試驗(yàn)材料為雞前脂肪細(xì)胞(ICP1細(xì)胞)。脂肪組織除了包含成熟脂肪細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞外，還含有成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞[49]，而ICP1細(xì)胞是單純的前脂肪細(xì)胞。2)兩個(gè)試驗(yàn)中，TCF21基因啟動(dòng)子DNA所處環(huán)境不同。脂肪組織中TCF21基因的啟動(dòng)子是由組蛋白包裹的DNA片段，而在熒光素酶報(bào)告基因載體中，TCF21基因的啟動(dòng)子是裸露的DNA片段。3)TCF21基因在雞脂肪組織中可能受增強(qiáng)子的調(diào)控，而本研究在構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因時(shí)只是連接了雞TCF21基因的啟動(dòng)子，并沒有連接增強(qiáng)子到報(bào)告基因載體中。4)兩個(gè)試驗(yàn)中，TCF21基因啟動(dòng)子的DNA甲基化模式不同。體內(nèi)脂肪組織中TCF21啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)受DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、DNA去甲基化酶等表觀修飾因子的動(dòng)態(tài)調(diào)控，而體外DNA甲基轉(zhuǎn)移酶處理報(bào)告基因質(zhì)粒是對(duì)TCF21啟動(dòng)子區(qū)的CpG位點(diǎn)進(jìn)行強(qiáng)行甲基化，這與體內(nèi)脂肪組織中TCF21基因的甲基化模式是不一樣的。

有研究表明，CpG位點(diǎn)的甲基化會(huì)影響DNA序列與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合狀態(tài)，進(jìn)而影響基因的表達(dá)[50-52]。本項(xiàng)研究報(bào)告基因結(jié)果顯示，雞TCF21基因啟動(dòng)子R2區(qū)域及R2+R3區(qū)域的DNA甲基化會(huì)抑制其轉(zhuǎn)錄活性，而無論是R3區(qū)域單獨(dú)存在還是與R2區(qū)域共同存在，R3區(qū)域的DNA甲基化均不會(huì)影響其轉(zhuǎn)錄活性(圖7B、7C)。因此，本研究將目光聚焦在了TCF21基因啟動(dòng)子的R2區(qū)域。將R2區(qū)域內(nèi)潛在的轉(zhuǎn)錄因子(Pax2、Sox10、FOS、SPIB與FOXP3)與該區(qū)域內(nèi)的與TCF21基因表達(dá)顯著相關(guān)的CpG位點(diǎn)(CpG_7和CpG_10)進(jìn)行聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)CpG_7位于Pax2的結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)，提示CpG_7位點(diǎn)的甲基化可能通過改變轉(zhuǎn)錄因子Pax2與TCF21基因啟動(dòng)子R2區(qū)域的結(jié)合來影響TCF21基因的轉(zhuǎn)錄。

綜上所述，組織水平的研究結(jié)果顯示TCF21基因啟動(dòng)子R2和R3區(qū)域的DNA甲基化水平與其mRNA表達(dá)水平顯著相關(guān)；細(xì)胞水平的研究結(jié)果顯示TCF21基因啟動(dòng)子R2區(qū)域的DNA甲基化會(huì)影響其轉(zhuǎn)錄活性，但R3區(qū)域的DNA甲基化對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性沒有影響。

4 結(jié) 論

結(jié)合組織水平、細(xì)胞水平的研究結(jié)果，本研究表明：TCF21基因在7周齡高、低脂系肉雞腹部脂肪組織中的差異表達(dá)主要與其啟動(dòng)子R2區(qū)域的DNA甲基化水平有關(guān)，但具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步深入的研究。