夏晨潔,陳志鵬,李偉東*
(1南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院;2江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京210023)
納米技術(shù)作為“21 世紀(jì)的決定性技術(shù)”,在藥物研發(fā)、疾病治療和診斷及藥物遞送領(lǐng)域發(fā)展迅猛[1]。納米載體以不同形式與藥物分子通過(guò)物理包埋、化學(xué)鍵合,構(gòu)成納米藥物遞送系統(tǒng)。因其尺寸、形狀、材料等特殊性,可有效改善藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)性能,提高療效[2]。但物理包埋存在藥物穩(wěn)定性差、載藥量低的問(wèn)題,化學(xué)偶聯(lián)雖然可以提高藥物的穩(wěn)定性和載藥量[3],但合成復(fù)雜以及會(huì)對(duì)斷裂后藥物的藥理作用有一定影響。因此,尋找一種簡(jiǎn)便、高效的策略提高納米藥物的載藥量和穩(wěn)定性是推動(dòng)其轉(zhuǎn)化的重要方向。
聚多巴胺(polydopamine,PDA)可以在堿性溶液中由多巴胺發(fā)生氧化自聚反應(yīng)得到[4],具有良好的生物相容性和可降解性。更為重要的是,由于其表面具有大量的兒茶酚基和胺基,從而顯示出較強(qiáng)的吸附能力,具有高載藥潛力,適合作為藥物載體[5]。此外,為了進(jìn)一步提高聚多巴胺載藥納米粒在體內(nèi)的駐留時(shí)間,有必要對(duì)其進(jìn)行修飾。細(xì)胞膜仿生技術(shù)利用仿生載體與機(jī)體實(shí)現(xiàn)完美兼容,在體內(nèi)具有長(zhǎng)循環(huán)、靶向、生物相容性等優(yōu)勢(shì)[6-7]。已有文獻(xiàn)報(bào)道,利用紅細(xì)胞膜修飾納米??梢杂行右輽C(jī)體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬[8-9],延長(zhǎng)其體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。
補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚(bavachinin,BVA)是從補(bǔ)骨脂中提取的一種異戊烯基黃酮類化合物,具有抗炎[10]、平喘[11]、抗氧化[12]及抗腫瘤[13]等多種藥理作用,具有較為廣闊的開(kāi)發(fā)前景。其中,抗腫瘤作用是目前的研究熱點(diǎn),但其口服生物利用度低,無(wú)法在體內(nèi)達(dá)到有效的治療濃度,制約其臨床應(yīng)用,而傳統(tǒng)的脂質(zhì)體等手段無(wú)法實(shí)現(xiàn)其高載藥量負(fù)載。為此,本研究利用聚多巴胺的強(qiáng)吸附性,構(gòu)建補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚高載藥量?jī)?chǔ)庫(kù)(polydopamine nanoparticles loaded with BVA,BP),進(jìn)一步利用紅細(xì)胞膜修飾,構(gòu)建紅細(xì)胞膜仿生納米粒(erythrocyte membrane biomimetic nanoparticles,RBC-BP)(圖1),延長(zhǎng)其在體內(nèi)的駐留時(shí)間,并初步研究了該遞送系統(tǒng)的靜脈注射后的小鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)行為,為利用聚多巴胺納米粒構(gòu)建高載藥量納米藥物提供有益的借鑒。
Figure 1 Schematic illustration of the preparation process of erythrocyte membrane biomimetic nanoparticles (RBC-BP)RBC: Red blood cell; PDA:Polydopamine;BVA:Bavachinin
補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚(純度≥98 %,批號(hào):110502,南京世洲生物科技有限公司);濱蒿內(nèi)酯(純度≥99 %,批號(hào):20180203,南京世洲生物科技有限公司);鹽酸多巴胺(美國(guó)Sigma-Aldrich 公司);PBS(北京索萊寶科技有限公司);甲醇、氨水、乙腈(南京化學(xué)試劑有限公司)均為色譜純;甲酸(德國(guó)Merck公司)。
BS-124S 電子天平(德國(guó)賽多利斯公司);1736R 低溫高速離心機(jī)(GENE 有限公司);JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);Zetasizer Nano ZS90 激光粒度儀(英國(guó)馬爾文公司);脂質(zhì)體擠出儀(美國(guó)Avanti 公司);100CX 透射電子顯微鏡(日本Jeol 公司);QF-3800 氮?dú)獯蹈蓛x(廣州科雷納儀器設(shè)備有限公司);Waters 2695 型高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo 公司);5500 MS 系統(tǒng)三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Absciex 公司)。
ICR小鼠,雌性,SPF級(jí),體重18 ~22 g(南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(浙)2019-0002。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。
采用HPLC 法測(cè)定BVA 含量。色譜條件:色譜柱為Kromasil-C18柱(250 mm × 4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈-0.01% 甲酸水(75∶25);檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm;柱溫為30 ℃;流速為1.0 mL/min;進(jìn)樣量為20 μL。BVA 在0.10 ~25.0 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程為y= 46900x+ 76.948,r2= 0.9998;進(jìn)樣精密度RSD 為0.78 %(n= 6);加樣回收率平均值(100.00 ± 0.35)%(n= 6),經(jīng)驗(yàn)證該方法滿足BVA的含量測(cè)定要求。
參照課題組前期制備工藝[14],利用溶劑置換法制備BP,稱取一定量的BVA 溶于乙醇20 mL 中得有機(jī)相。隨后在攪拌條件下緩慢加入至含PDA的純水5 mL中,通過(guò)室溫?cái)嚢璺跤?fù)載BVA,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇,高速離心10 min,棄去上清液得BP。以吸附率為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察PDA 與BVA 的比例、溶液pH、孵育時(shí)間和溫度等因素對(duì)PDA 負(fù)載BVA的影響。
參照文獻(xiàn)報(bào)道制備RBC[15],將制備后的RBC和BP 納米粒進(jìn)行混合,調(diào)節(jié)混合液的pH,常溫振搖孵育,高速離心,棄上清液,加入PBS 溶液混勻,得RBC-BP 粗懸液,通過(guò)脂質(zhì)體擠出儀進(jìn)行多次擠壓,制備得粒徑均一的RBC-BP 混懸液。為了更好地利用正負(fù)電荷作用實(shí)現(xiàn)包裹,考察pH 對(duì)BP 電位的影響,以PDI 為評(píng)價(jià)指標(biāo)考察擠出次數(shù)對(duì)RBC-BP粒徑和均一性的影響。
2.4.1 外觀形貌觀察 用移液槍分別吸取少量的BP、RBC和RBC-BP,滴加到銅網(wǎng),用磷鎢酸負(fù)染法染色,自然晾干,將制得的樣品通過(guò)透射電子顯微鏡進(jìn)行分析。
2.4.2 粒徑與電位測(cè)定 取上述制備所得的RBC、BP 和RBC-BP,用粒度測(cè)定儀測(cè)定不同樣品的粒徑和Zeta電位。
2.4.3 吸附率與載藥量的測(cè)定 稱取固定量的BP 或RBC-BP,加入破膜劑(異丙醇-無(wú)水乙醇,4∶1),充分吹打并渦旋,高速離心10 min,取上清液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,HPLC 進(jìn)樣分析,測(cè)定BVA 的含量,計(jì)算其質(zhì)量。按下述公式計(jì)算吸附率與載藥率:吸附率=(載體中BVA 的量/BVA 的加入量)× 100 %,載藥率=(載體中BVA 的量/制劑的總量)× 100 %。
2.4.4 釋放行為研究 取BVA、BP 和RBC-BP 1 mL置于透析袋內(nèi),放入pH 7.4的溶出介質(zhì)10 mL中,37 ℃振蕩,在給定時(shí)間點(diǎn)取樣,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定BVA 含量,計(jì)算累積釋放率,繪制時(shí)間-累積釋放率曲線。
2.5.1 給藥及取樣 ICR 小鼠75 只,隨機(jī)分為3組,實(shí)驗(yàn)前12 h禁食,自由飲水。分別尾靜脈注射BVA、BP、RBC-BP,給藥劑量為40 mg/kg。分別于給藥后1、4、8、12、24 h,摘眼球取血約0.5 mL,置預(yù)先裝有肝素鈉的試管中,3000 r/min 離心10 min,分離血漿,-20 ℃條件下保存,備用。
2.5.2 血漿樣品處理方法 取小鼠血漿樣品90 μL于1.5 mL EP 管中,加入內(nèi)標(biāo)液10 μL,振搖混合均勻,再加入乙腈290 μL,渦旋5 min,13000 r/min 離心10 min,取上清液300 μL,真空濃縮后,加甲醇150 μL 復(fù)溶,13000 r/min 離心10 min。取上清液用于UHPLC-MS/MS分析。
2.5.3 體內(nèi)分析方法建立 色譜質(zhì)譜條件:流動(dòng)相為0.1% 甲酸水(A)-乙腈(B);梯度洗脫:0.01 ~1.0 min,5% ~75%(B);1.0 ~3.5 min,75%(B),4.5 ~5.0 min,75% ~50%(B);流速為0.3 mL/min;柱溫為40 ℃;進(jìn)樣量為2 μL。離子源為ESI 源;CUR:35 psi(1 psi = 6.895 kPa);CAD:8 V;IS:5500 N;TEM:600 ℃;GS1:50 psi;GS2:60 psi。補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚在血漿中1 ~1250 ng/mL 線性關(guān)系良好,回歸方程為y= 0.00130x+ 0.00756,r2= 0.9999;方法學(xué)考察顯示符合生物樣品的分析控制要求。
PDA 與BVA 比例、溶液pH、孵育時(shí)間和溫度對(duì)PDA 負(fù)載BVA 的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。如圖2-A 所示,當(dāng)固定PDA 用量時(shí),BVA 在一定范圍內(nèi)均可被負(fù)載,吸附率穩(wěn)定在90% 以上,隨著B(niǎo)VA 加入量的增加,質(zhì)量比例大于1∶0.5 時(shí),PDA 的吸附逐漸趨于飽和,吸附率呈下降趨勢(shì)。溶液pH 影響研究結(jié)果顯示(如圖2-B 所示),隨著pH 增加,吸附率出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)pH 為7 時(shí),吸附率最高。隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng),吸附率顯著增加,而當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)6 h 后,吸附率趨于穩(wěn)定(如圖2-C 所示)。孵育溫度在10 ~40 ℃時(shí),對(duì)吸附率沒(méi)有明顯影響。
綜上,最終確定PDA 負(fù)載BVA 的處方和工藝參數(shù)為:PDA 與BVA 的質(zhì)量比例為1∶0.5、溶液pH為7、孵育時(shí)間為6 h、孵育溫度為20 ℃。
Figure 2 Changes in adsorption rate under different ratios of PDA to BVA (A),pH(B),incubation time(C)and incubation temperature(D)(±s, n = 3)***P <0.001
溶液pH 對(duì)BP 表面電荷影響結(jié)果如圖3-A 所示,隨著pH 的增加,BP 表面電荷逐漸降低,在pH 4 ~7 時(shí),由正電荷轉(zhuǎn)為負(fù)電荷。依據(jù)細(xì)胞膜外側(cè)正電荷內(nèi)側(cè)負(fù)電荷的特性,巧妙地選擇BP 在負(fù)電荷時(shí)進(jìn)行包覆,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜的定向包裹。而當(dāng)pH為2 時(shí),BP 有聚集變大的趨勢(shì),故而本研究選擇的溶液pH為4。
擠出次數(shù)對(duì)RBC-BP 的影響如圖3-B 所示,經(jīng)200 nm 的聚碳酸酯膜擠壓,平均粒徑控制在200 ~300 nm,隨著擠出次數(shù)增加,PDI逐漸減小,擠出達(dá)3 次以上時(shí),PDI 無(wú)明顯變化。通過(guò)反復(fù)擠出可以改善粒徑分布,獲得均一性良好納米粒。
Figure 3 BP Zeta potential of different pH(A)and particle size and PDI of RBC-BP with different extrusion times(B)(±s, n = 3)
3.3.1 外觀形態(tài)觀察 BP、RBC 和RBC-BP 的透射電鏡照片見(jiàn)圖4。如圖4-A 和4-B 所示,BP 具有良好的球形形貌,RBC 多以碎片存在,部分自發(fā)聚集形成不規(guī)則的囊泡,圖4-C 所示,RBC-BP 呈明顯的核殼結(jié)構(gòu),球形的BP 外周包裹了一層膜結(jié)構(gòu),說(shuō)明細(xì)胞膜成功包覆。
Figure 4 Transmission electron microscopy of RBC(A),BP(B)and RBC-BP(C)
3.3.2 粒徑與電位測(cè)定 BP、RBC 和RBC-BP 粒徑電位結(jié)果見(jiàn)圖5。 BP 的粒徑為(146.67 ±11.90)nm,由于RBC 部分發(fā)生自身聚集形成不規(guī)則囊泡,其粒徑為(213.67 ± 34.63)nm,與BP 相比,制得的RBC-BP 粒徑有所增大為308 nm。RBC-BP 的電位為(4.78 ± 0.76)mV,與RBC 的表面電位(4.89 ± 0.19)mV 相似,間接證明了RBCBP的成功制備。
Figure 5 Particle size and Zeta potential of polydopamine nanoparticles loaded with BVA (BP),RBC and RBC-BP (±s, n = 3)
3.3.3 載藥量及藥物釋放情況 使用HPLC 法檢測(cè)BP 和RBC-BP 中BVA 的含量,根據(jù)公式計(jì)算包封率和載藥率,測(cè)得BP 吸附率為(92.08 ±0.17)%,載藥率為(42.05 ± 2.95)%;RBC-BP 吸附率 為(92.72 ± 3.31)% ,載 藥 量 為(30.23 ±4.32)%,吸附率無(wú)顯著變化,證明包覆過(guò)程無(wú)藥物滲漏。
BVA、BP 和RBC-BP 的累積釋藥曲線見(jiàn)圖6。BVA 溶液表現(xiàn)出快速釋放的特征,在1 h 內(nèi)已經(jīng)釋放近97% 的藥量;BP 組在前4 h 釋放了約50% 的BVA,之后釋放速率減慢,48 h 累積釋放量為67 %;RBC-BP在前2 h釋放了約20 %的BVA,之后幾乎不釋放,48 h累積釋放量?jī)H為30 %。
綜上,PDA 具有較高的載藥能力,且在生理環(huán)境下較為穩(wěn)定,進(jìn)一步用細(xì)胞膜包裹后,其穩(wěn)定性增加。
Figure 6 Cumulative release curves of BVA,BP and RBC-BP in vitro(±s, n = 3)
采用中國(guó)藥理學(xué)會(huì)3P97軟件包進(jìn)行房室模型擬合并計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。 BVA、BP 和RBCBP 藥時(shí)曲線見(jiàn)圖7,其主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。與BVA 溶液劑相比,BP 和RBC-BP 的AUC0-∞和MRT0-∞分別是BVA 的2.0 倍、2.5 倍和5.4 倍、3.2倍。RBC-BP 的AUC0-∞和MRT0-∞是BP 的2.6 倍 和1.2 倍,表明紅細(xì)胞膜的包裹能夠進(jìn)一步提高BP的體內(nèi)駐留時(shí)間。
Figure 7 Plasma concentration-time curves of BVA、BP and RBC-BP(±s, n = 5)
Table 1 Comparison of the mean pharmacokinetic parameters of BVA、BP、RBC-BP after a single 40 mg/kg intravenous injection in mouse (±s, n = 5)
Table 1 Comparison of the mean pharmacokinetic parameters of BVA、BP、RBC-BP after a single 40 mg/kg intravenous injection in mouse (±s, n = 5)
**P <0.01, ***P <0.001 vs BP group
Parameter AUC0-t/(mg/L·h)AUC0-∞/(mg/L·h)MRT0-t /h MRT0-∞/h BVA 9.72 ± 4.269.84 ± 4.253.76 ± 0.513.97 ± 0.55 BP 16.74 ± 7.1020.18 ± 10.795.50 ± 0.7810.00 ± 5.37 RBC-RBC 47.29 ± 10.15***53.18 ± 13.85**7.82 ± 0.27***12.51 ± 0.99
近年來(lái),納米藥物取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展,但是能夠轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床的卻很少,載藥量、穩(wěn)定性以及工業(yè)化的可行性一直是限制其發(fā)展的主要瓶頸。從中藥中提取分離獲得多種生理活性良好的化合物,由于溶解度低等問(wèn)題制約其臨床應(yīng)用。
本研究依據(jù)PDA 的強(qiáng)吸附性,實(shí)現(xiàn)對(duì)BVA 高效負(fù)載,制備BVA 的高載藥量?jī)?chǔ)庫(kù),為進(jìn)一步制備新型遞釋系統(tǒng)提供了基礎(chǔ)。其次,利用紅細(xì)胞膜仿生技術(shù)進(jìn)一步修飾載藥納米粒,基于紅細(xì)胞膜內(nèi)負(fù)外正的電荷特性,巧妙通過(guò)調(diào)節(jié)溶液pH 實(shí)現(xiàn)對(duì)PDA 的電荷調(diào)控,從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜定向包覆納米粒的目的。成功構(gòu)建具有長(zhǎng)循環(huán)特性和高載藥量的遞送系統(tǒng),其臨床轉(zhuǎn)化有望在將來(lái)實(shí)現(xiàn)為腫瘤治療。
PDA 作為一種新型載體,載藥方式多樣且可調(diào)控性強(qiáng),可以負(fù)載多種成分,進(jìn)一步研究其載藥機(jī)制,有望將其作為負(fù)載多成分的載體,在中藥多組分負(fù)載具有良好的應(yīng)用前景,也為中藥制劑的現(xiàn)代化研究提供一種新的方向。同時(shí),通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜包覆時(shí)的條件,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜的定向包裹,最大程度地保留其生理學(xué)特點(diǎn),也為細(xì)胞膜修飾遞釋系統(tǒng)的應(yīng)用提供了有益的借鑒。