澳洲茄邊堿對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響及機(jī)制初探

吳晶晶 張文娟 張駿鴻 張雅婷 黎莉 盧月 危建安 韓凌

中圖分類(lèi)號(hào) R735.7;R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）24-2963-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.24.04

摘 要 目的：探討澳洲茄邊堿對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響，并研究其潛在作用機(jī)制。方法：考察0（空白組）～12 μmol/L澳洲茄邊堿作用24、48 h對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響，0（空白組）、6 μmol/L澳洲茄邊堿作用10 d對(duì)細(xì)胞克隆形成的影響，0（空白組）、4、6、8 μmol/L澳洲茄邊堿作用24 h對(duì)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（caspase-3）mRNA表達(dá)量以及Bcl-2、剪切的caspase-3（cleaved caspase-3）蛋白表達(dá)量和磷酸化腺苷一磷酸活化蛋白激酶α（p-AMPKα）/AMPKα的影響?？疾霢MPK抑制劑compound C對(duì)經(jīng)6 μmol/L澳洲茄邊堿作用24 h后細(xì)胞中AMPKα、Bcl-2蛋白表達(dá)量的影響。結(jié)果：與空白組比較，1～12 μmol/L澳洲茄邊堿作用24、48 h均可顯著降低細(xì)胞存活率（P<0.05），且有濃度依賴(lài)趨勢(shì)，其半數(shù)抑制濃度分別為8.310、7.996 μmol/L;經(jīng)6 μmol/L澳洲茄邊堿作用10 d后細(xì)胞的克隆形成率顯著降低（P<0.05）。6、8 μmol/L澳洲茄邊堿作用后細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中Bax、caspase-3 mRNA及cleaved caspase-3蛋白（除8 μmol/L外）表達(dá)量、p-AMPKα/AMPKα（除8 μmol/L外）均顯著升高（P<0.05），Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)量均顯著降低（P<0.05），部分指標(biāo)變化有濃度依賴(lài)性。compound C可以抑制AMPKα蛋白表達(dá)并逆轉(zhuǎn)澳洲茄邊堿對(duì)Bcl-2蛋白的抑制作用。結(jié)論：澳洲茄邊堿可以抑制HepG2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，作用機(jī)制可能與激活A(yù)MPK信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 澳洲茄邊堿;人肝癌HepG2細(xì)胞;生長(zhǎng);凋亡;磷酸化腺苷一磷酸活化蛋白激酶信號(hào)通路

Preliminary Study on Effects of Solamargine on the Growth and Apoptosis of Human Hepatocarcinoma Cells HepG2 and Its Mechanism

WU Jingjing1，ZHANG Wenjuan2，ZHANG Junhong1，ZHANG Yating2，LI Li1，LU Yue1，WEI Jian’an1，HAN Ling3，4（1. Research Team of Molecular Biology and System Biology of Chinese Medicine， the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510120， China; 2. The Second Clinical College of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510120， China; 3. State Key Laboratory of Dampness Syndrome of Chinese Medicine， the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510120， China; 4. Guangdong Provincial Key Laboratory of Clinical Research on Traditional Chinese Medicine Syndrome/Guangdong Clinical Research Center for Dermatosis in Chinese Medicine/Guangdong-Hong Kong-Macau Joint Lab for Chinese Medicine and Immune Disease Research， Guangzhou 510120， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To explore the effects of solamargine on the growth and apoptosis of human hepatocarcinoma cells HepG2 and its underlying mechanism. METHODS： The effects of 0（blank group）-12 μmol/L solamargine treatment of 24， 48 h on survival rate of HepG2 cells were investigated. The effects of 0 （blank group）， 6 μmol/L solamargine treatment of 10 days on cell clone formation were also investigated. The effects of 0 （blank group）， 4， 6， 8 μmol/L solamargine for 24 h on the apoptotic rate of cells， mRNA expression of Bcl-2， Bax and caspase-3， protein expression of Bcl-2 and cleaved caspase-3 as well as ratio of p-AMPKα to AMPKα were all tested. The effects of AMPK inhibitor as compound C on the protein expression of AMPKα and Bcl-2 in cells were investigated after treated with 6 μmol/L solamargine for 24 h. RESULTS： Compared with blank group， 1-12 μmol/L solamargine for 24， 48 h could significantly decrease the survival rates of cells （P<0.05） in a concentration-dependent manner; IC50 of them were 8.310 and 7.996 μmol/L，respectively; the rate of cell clone formation was decreased significantly after treated with 6 μmol/L solamargine? for 10 days （P<0.05）. The apoptotic rate of HepG2 cells， mRNA expression of Bax and caspase-3， protein expression of? cleaved caspase-3 （except for 8 μmol/L） as well as ratio of p-AMPKα to AMPKα （except for 8 μmol/L） were all increased significantly after treated with 6， 8 μmol/L solamargine （P<0.05）; mRNA and protein expression of Bcl-2 were decreased significantly （P<0.05）; the changes of some indexes were in a concentration-dependent manner. The compound C could inhibit protein expression of AMPKα， and reverse the inhibitory effect of solamargine on Bcl-2 protein. CONCLUSIONS： Solamargine can inhibit the proliferation of HepG2 cells and induce apoptosis， the mechanism of which may be associated with activating AMPK signaling pathway.

KEYWORDS? ?Solamargine; Human hepatocarcinoma cells HepG2; Growth; Apoptosis; AMPK signaling pathway

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（青年科學(xué)基金）資助項(xiàng)目（No.81902752）;廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2020B1212030006）;廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.2020A1515010607）;省部共建中醫(yī)濕證國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室重點(diǎn)項(xiàng)目（No.SZ2021ZZ29）;廣東省中醫(yī)院-瑞博奧研究項(xiàng)目（No.YN2018RBA02）

助理研究員，碩士。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)。電話：020-39318678。E-mail：wujingjing6028@gzucm.edu.cn

通信作者：研究員，博士。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)。電話：020-39318678。E-mail：linghan99@gzucm.edu.cn

肝癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是惡性腫瘤導(dǎo)致患者死亡的第三大原因[1]。目前，手術(shù)切除是肝細(xì)胞癌的最佳治療方法，特別是在發(fā)病早期且腫塊直徑小于2 cm時(shí)，手術(shù)切除是最有效的方法，但患者的5年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)68%[2-3]。近年來(lái)，化療和靶向治療在肝癌的治療中得到了廣泛的應(yīng)用，其代表藥物索拉非尼和侖伐替尼可以明顯提高無(wú)法進(jìn)行手術(shù)的肝癌患者的生存率[4-5]。然而，分子靶向治療的耐受性和相對(duì)嚴(yán)重的副作用限制了這類(lèi)藥物在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用[6]。因此，尋找新的肝癌治療方法和抗肝癌藥物意義重大。

澳洲茄邊堿（solamargine）是中藥龍葵Solanum nigrum L.生物堿中的主要成分，屬于甾體生物堿的膽甾烷衍生物，已被證實(shí)對(duì)非小細(xì)胞肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用[7-10]。但該成分抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制尚不明確。腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)的重要介質(zhì)，活化后的AMPK可以通過(guò)抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]?；诖?，本研究擬探討澳洲茄邊堿對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響，以及可能涉及的分子機(jī)制，為該成分在肝癌臨床治療領(lǐng)域中的應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有SYNERGY-H1型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司），TS2型倒置生物顯微鏡（日本Nikon公司），Centrifuge 5430R型高速離心機(jī)、Galaxy 170S型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國(guó)Eppendorf公司），Novo Quanteon型流式細(xì)胞儀（美國(guó)ACEA Biosciences公司），ViiA 7型熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國(guó)ABI公司），Mini-PROTEAN? Tetra cell小型垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、ChemiDoc Touch型高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司），NanoDrop 2000型超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），ELPH 1301S型相機(jī)（日本Canon公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

澳洲茄邊堿對(duì)照品（批號(hào)MUST-20112005，純度≥98%）購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司;二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)RNBH8343）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;MTT試劑（批號(hào)S3444）購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals公司;4%多聚甲醛固定液、結(jié)晶紫染色液均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔源磷酸化AMPKα（p-AMPKα）（T172）單克隆抗體、兔源AMPKα單克隆抗體、兔源B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）單克隆抗體、兔源胱天蛋白酶3（caspase-3）單克隆抗體、兔源β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體、兔源剪切的caspase-3（cleaved caspase-3）單克隆抗體和RIPA細(xì)胞裂解液（批號(hào)分別為50081S、5832S、4223S、9665S、4970S、9664S、7723S）均購(gòu)自美國(guó)CST公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（H+L）二抗（批號(hào)1706515）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;膜聯(lián)蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡試劑盒（批號(hào)73001255）購(gòu)自杭州聯(lián)科生物科技股份有限公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素溶液和0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化液均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)VK314219）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;Trizol試劑（批號(hào)74117）購(gòu)自美國(guó)Life Invitrogen公司;Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒、SYBR? Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit（批號(hào)分別為AG11728、AG11718）均購(gòu)自艾科瑞生物科技有限公司;AMPK抑制劑6-{4-[2-（1-哌啶基）乙氧基]苯基}-3-（4-吡啶基）吡唑并[1，5-A]嘧啶對(duì)照品（compound C，批號(hào)HY-13418A，純度99.65%）購(gòu)自美國(guó)MCE公司;ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒（批號(hào)36208ES76）購(gòu)自翌圣生物科技（上海）股份有限公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

本研究所用人肝癌HepG2細(xì)胞購(gòu)自廣州賽庫(kù)生物科技有限公司。

2 方法

2.1 澳洲茄邊堿溶液的制備

取澳洲茄邊堿對(duì)照品適量，用DMSO溶解、稀釋?zhuān)瞥蓾舛葹?0 mmol/L的貯備液，分裝后，于-20 ℃冰箱中保存，備用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 u/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（下文簡(jiǎn)稱(chēng)“DMEM完全培養(yǎng)基”），在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中無(wú)菌培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同），每隔24 h換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化（消化方法下同）傳代，待細(xì)胞貼壁后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 細(xì)胞存活率的檢測(cè)和澳洲茄邊堿作用濃度及時(shí)間的篩選

采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，分別以每孔10 000個(gè)接種到96孔板中，每孔加入DMEM完全培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，分別加入含澳洲茄邊堿0（空白組）、1、2、4、6、8、10、12 μmol/L的DMEM完全培養(yǎng)基100 μL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT試劑10 μL，培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩5 min，使用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度（A），按下式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組A值/空白組A值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。使用GraphPad Prism 7軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度，以篩選后續(xù)實(shí)驗(yàn)的藥物作用濃度和作用時(shí)間。

2.4 分組與給藥

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)接種到6孔板中，每孔加入DMEM完全培養(yǎng)基2 mL，待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，分別加入含澳洲茄邊堿0（空白組）、4、6、8 μmol/L（濃度根據(jù)“2.3”項(xiàng)下結(jié)果設(shè)置）的DMEM完全培養(yǎng)基2 mL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

2.5 細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)

采用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染色法結(jié)合流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，按“2.4”項(xiàng)下方法接種、分組、給藥。培養(yǎng)24 h后，消化并收集細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）離心（100×g，5 min）洗滌2次，棄去上清液;用水稀釋5×binding buffer得1×binding buffer，取1×binding buffer 500 μL重懸細(xì)胞，加入Annexin Ⅴ-FITC試劑5 μL和PI試劑10 μL，輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育5 min，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況，記錄細(xì)胞凋亡率（含早期凋亡率和晚期凋亡率）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 細(xì)胞克隆形成率的檢測(cè)

采用結(jié)晶紫染色法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以每孔500個(gè)接種到6孔板中，每孔加入DMEM完全培養(yǎng)基2 mL。培養(yǎng)次日，棄去培養(yǎng)基，分別加入含澳洲茄邊堿0（空白組）、6 μmol/L（濃度根據(jù)“2.5”項(xiàng)下結(jié)果設(shè)置）的DMEM完全培養(yǎng)基2 mL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)10 d后，用4%多聚甲醛固定液固定30 min，以結(jié)晶紫染色液染色30 min，再用ddH2O沖洗干凈，記錄各孔內(nèi)形成的克隆數(shù)[細(xì)胞數(shù)大于50個(gè)的集落（直徑大于0.3～1.0 mm）計(jì)為1個(gè)克隆]并拍照，按下式計(jì)算克隆形成率：克隆形成率（%）=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

2.7 細(xì)胞中Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA表達(dá)的檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，按“2.4”項(xiàng)下方法接種、分組、給藥。培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，用PBS洗滌2次，每孔加入Trizol試劑1 mL，提取細(xì)胞總RNA，使用超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度后，按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以上述cDNA為模板，按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系（共10 μL）如下：2×SYBR Green Pro Taq HS Premix（ROX plus）5 μL，cDNA模板 1 μL，上、下游引物各0.2 μL，RNase-free水3.6 μL。反應(yīng)程序采用兩步法，具體條件如下：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s，60 ℃退火與延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt法以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參計(jì)算細(xì)胞中Bcl-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、caspase-3 mRNA的表達(dá)量。PCR引物均委托美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司設(shè)計(jì)、合成，引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

2.8 細(xì)胞中p-AMPKα、AMPKα、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，按“2.4”項(xiàng)下方法接種、分組、給藥。培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，煮沸5 min使其變性。取變性蛋白30 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，用半干轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用TBST緩沖液（含0.5%吐溫20，下同）洗滌3次后，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h;加入p-AMPKα（T172）（稀釋比例1 ∶ 1 000）、AMPKα（稀釋比例1 ∶ 1 000）、Bcl-2（稀釋比例1 ∶ 1 000）、caspase-3（稀釋比例1 ∶ 1 000）、cleaved caspase-3（稀釋比例1 ∶ 1 000）、β-actin（稀釋比例1 ∶ 5 000）一抗，4 ℃孵育過(guò)夜;用TBST緩沖液洗滌3次，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例1 ∶ 3 000），室溫孵育1 h;用TBST緩沖液洗滌3次，將顯色液A液和B液混合，用移液槍均勻加至膜上，再用高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像儀成像，用Image Lab 5.2.1軟件分析目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）的灰度值比值，并計(jì)算p-AMPKα/AMPKα，再將上述結(jié)果與空白組比較進(jìn)行歸一化處理，作為目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。

另取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，按“2.4”項(xiàng)下方法接種后分為空白對(duì)照組、澳洲茄邊堿組、compound C組和compound C+澳洲茄邊堿組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。相應(yīng)藥物組加入含compound C 5 μmol/L[12]的DMEM完全培養(yǎng)基2 mL，培養(yǎng)2 h后，棄去培養(yǎng)基，再（或）加入含澳洲茄邊堿6 μmol/L（濃度根據(jù)“2.5”項(xiàng)下結(jié)果設(shè)置）的DMEM完全培養(yǎng)基2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后按上述方法測(cè)定細(xì)胞中AMPKα、Bcl-2蛋白的表達(dá)量。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用x±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn);多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 澳洲茄邊堿對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

與空白組比較，1～12 μmol/L澳洲茄邊堿作用24、48 h后，HepG2細(xì)胞存活率均顯著降低（P<0.05），且有濃度依賴(lài)趨勢(shì)。澳洲茄邊堿作用24、48 h對(duì)HepG2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度分別為8.310、7.996 μmol/L，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)以4、6、8 μmol/L作為澳洲茄邊堿的作用濃度，24 h作為其作用時(shí)間。澳洲茄邊堿作用24、48 h對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響見(jiàn)表2。

3.2 澳洲茄邊堿對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡率的影響

0、4、6、8 μmol/L澳洲茄邊堿作用24 h后，HepG2細(xì)胞的凋亡率分別為（8.687±0.331）%、（9.707±0.891）%、（12.753±0.534）%、（13.900±1.015）%，其中6、8 μmol/L澳洲茄邊堿作用后HepG2細(xì)胞的凋亡率均顯著高于空白組和4 μmol/L澳洲茄邊堿（P<0.05），故后續(xù)細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)和機(jī)制驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)以6 μmol/L作為澳洲茄邊堿的作用濃度。澳洲茄邊堿對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡率的影響見(jiàn)圖1。

3.3 澳洲茄邊堿對(duì)HepG2細(xì)胞克隆形成的影響

經(jīng)6 μmol/L澳洲茄邊堿作用10 d后，HepG2細(xì)胞的克隆形成率較空白組顯著降低[（20.666±5.033）%vs.（32.667±3.055）%，P<0.05]。澳洲茄邊堿對(duì)HepG2細(xì)胞克隆形成的影響見(jiàn)圖2。

3.4 澳洲茄邊堿對(duì)HepG2細(xì)胞中Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，6、8 μmol/L澳洲茄邊堿作用24 h后，HepG2細(xì)胞中Bcl-2 mRNA的表達(dá)量均顯著降低（P<0.05），Bax、caspase-3 mRNA的表達(dá)量均顯著升高（P<0.05）。與4 μmol/L澳洲茄邊堿比較，6、8 μmol/L澳洲茄邊堿作用24 h后HepG2細(xì)胞中caspase-3 mRNA的表達(dá)量均顯著升高（P<0.05）。澳洲茄邊堿對(duì)HepG2細(xì)胞中Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA表達(dá)的影響見(jiàn)表3。

3.5 澳洲茄邊堿對(duì)HepG2細(xì)胞中Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，6、8 μmol/L澳洲茄邊堿作用24 h后HepG2細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)量均顯著降低（P<0.05），6μmol/L澳洲茄邊堿作用后HepG2細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)量顯著升高（P<0.05）。與4、6 μmol/L澳洲茄邊堿比較，8 μmol/L澳洲茄邊堿作用24 h后HepG2細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）。澳洲茄邊堿對(duì)HepG2細(xì)胞中Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響見(jiàn)圖3、表4。

3.6 澳洲茄邊堿對(duì)AMPK信號(hào)通路的影響及驗(yàn)證

經(jīng)0、4、6、8 μmol/L澳洲茄邊堿作用24 h后，HepG2細(xì)胞中p-AMPKα/AMPKα分別為1、1.212±0.114、1.315±0.143、1.310±0.320。與空白組比較，4、6、8 μmol/L澳洲茄邊堿作用24 h后HepG2細(xì)胞中p-AMPKα/AMPKα均有升高趨勢(shì)，其中6 μmol/L澳洲茄邊堿可使上述比值顯著升高（P<0.05）。澳洲茄邊堿對(duì)HepG2細(xì)胞中p-AMPKα、AMPKα蛋白表達(dá)影響的電泳圖見(jiàn)圖4。

與空白對(duì)照組比較，compound C組、compound C+澳洲茄邊堿組HepG2細(xì)胞中AMPKα蛋白的表達(dá)量和澳洲茄邊堿組HepG2細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）。與澳洲茄邊堿組比較，compound C+澳洲茄邊堿組HepG2細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)量顯著升高（P<0.05）。AMPK抑制劑對(duì)經(jīng)澳洲茄邊堿作用后HepG2細(xì)胞中AMPKα、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響見(jiàn)圖5、表5。

4 討論

我國(guó)肝癌的發(fā)病人數(shù)占全世界所有肝癌病例總數(shù)的55%[13-14]。盡管治療肝癌有許多策略，包括手術(shù)切除、肝臟移植、消融、經(jīng)動(dòng)脈化學(xué)栓塞術(shù)和分子靶向治療（索拉非尼和侖伐替尼）等，但療效仍不令人滿意[15-16]。因此，進(jìn)一步尋找新的抗肝癌治療途徑和藥物是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。

已有體內(nèi)外研究表明，澳洲茄邊堿對(duì)鼻咽癌、肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用[8-9]，但其在肝癌細(xì)胞中的作用尚不明確。細(xì)胞增殖是活細(xì)胞的重要生理功能之一，當(dāng)細(xì)胞受到致癌因素的影響時(shí)，其無(wú)法正常地完成分化，取而代之的則是不受控制地持續(xù)分裂、惡性增殖[17-19]。既往研究發(fā)現(xiàn)，澳洲茄邊堿可通過(guò)下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞的遷移和侵襲[20]。本研究采用MTT法和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)考察了澳洲茄邊堿對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示，澳洲茄邊堿可降低HepG2細(xì)胞的存活率且對(duì)存活率的影響有濃度依賴(lài)趨勢(shì)，并能抑制其克隆形成。

細(xì)胞凋亡是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定所必需的一種基本的生物學(xué)過(guò)程[21]。Bcl-2和Bax均為Bcl-2家族成員，是參與細(xì)胞凋亡的重要因子。Bcl-2在維持細(xì)胞存活中起著重要作用，而B(niǎo)ax的主要作用是加速細(xì)胞凋亡[22]。有研究表明，細(xì)胞凋亡實(shí)際上是caspase被活化并誘發(fā)凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的過(guò)程[23]。caspase-3是caspase家族成員之一，可激活凋亡信號(hào)的傳遞，是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白;caspase-3切割之后可形成cleaved caspase-3，cleaved caspase-3是caspase-3的活化形式并能夠破壞細(xì)胞功能、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[23-24]。本研究結(jié)果顯示，澳洲茄邊堿可通過(guò)抑制Bcl-2 mRNA及其蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Bax、caspase-3 mRNA和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，與Ding等[25]研究結(jié)果一致。

AMPK是細(xì)胞能量的傳感器，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)和自噬[26]。有研究表明，AMPK可作為抑癌因子發(fā)揮作用，其活化可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[27]。AMPK還是一種參與凋亡信號(hào)通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的交互蛋白，包括LKB1（liver kinase B1）/AMPK和AMPK/p53信號(hào)通路[28-29]。有研究發(fā)現(xiàn)，ω-羥基十一碳-9-烯酸可增加乳腺癌細(xì)胞中AMPK的磷酸化水平和cleaved caspase-3、Bax蛋白的表達(dá)水平，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，而使用AMPK抑制劑可以逆轉(zhuǎn)這種作用[30]。本研究結(jié)果顯示，澳洲茄邊堿作用于HepG2細(xì)胞后可輕微上調(diào)磷酸化AMPKα蛋白的表達(dá)，使用AMPK抑制劑compound C后可以抑制AMPKα蛋白的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)澳洲茄邊堿對(duì)Bcl-2蛋白的抑制作用，說(shuō)明澳洲茄邊堿誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的作用可能與調(diào)控AMPK信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，澳洲茄邊堿可以抑制HepG2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，作用機(jī)制可能與激活A(yù)MPK信號(hào)通路有關(guān)。在下一步研究中，本課題組將采用肝癌細(xì)胞荷瘤小鼠模型評(píng)估澳洲茄邊堿治療肝癌的效果與機(jī)制。

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（收稿日期：2021-08-19 修回日期：2021-11-19）