無透鏡智能顯微成像裝置設(shè)計

曾周杰，于 雯，仇浩謙，陳文娟，張立紅

(中國石油大學(華東)理學院，山東 青島 266580)

光學顯微技術(shù)對人類探索微觀世界具有重要意義，其在細胞生物學、醫(yī)學、物理學、化學等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)顯微系統(tǒng)主要由光源，透鏡組及光電傳感器等多個部件組成，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，價格昂貴[1]。其中，物鏡是顯微系統(tǒng)中至關(guān)重要的一環(huán)，但因為其固定空間帶寬積，往往無法同時實現(xiàn)高分辨率與大視場成像。以對大面積病理樣本成像為例，需要進行染色、冷凍、切片、掃描和拼接[2]。在此過程中，又需要對多幅小視場圖片進行預(yù)處理，圖像的配準和融合通常存在準確性低、耗時長等問題[3,4]。

近年來，隨著優(yōu)良圖像傳感器和高性能計算機的出現(xiàn)，無透鏡成像技術(shù)迅速發(fā)展。該技術(shù)不僅可以克服傳統(tǒng)光學顯微鏡固定分辨率-視場積的限制，無像差，且具有結(jié)構(gòu)簡單，便攜性高和成本低等優(yōu)點[5-8]。目前無透鏡成像技術(shù)分為無透鏡陰影成像[9]、無透鏡熒光成像[10]和無透鏡全息成像[7]三種。其中，無透鏡全息成像因其高分辨率和簡潔的成像流程而具有廣泛應(yīng)用前景。無透鏡全息顯微成像系統(tǒng)通常由光源、樣品臺以及光電探測器組成。成像過程中，光源中的LED光經(jīng)過微孔傳播一段距離后照射至樣本，發(fā)生衍射后的衍射圖案最后被下方的光電傳感器所記錄。計算機根據(jù)光電傳感器所記錄的圖像，利用圖像恢復(fù)算法進行重建，最終得到樣本的再現(xiàn)像。目前常用的重建算法主要有菲涅爾積分法[11]、卷積法[12]、角譜法[13]等。

針對現(xiàn)有無透鏡裝置自動化程度低的缺點，搭建了一套無透鏡智能顯微成像裝置，該系統(tǒng)硬件部分由1W高功率藍光LED光源、直徑為50 μm的精密針孔和單像素尺寸為1.335 μm、2 600萬像素、視場為57.1 mm2的CMOS相機、兩部兩相四線精密步進電機、STM32F4VE單片機、可調(diào)降壓穩(wěn)壓電源模塊和暗箱組成，軟件部分由電腦端上位機組成。該系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)對生物樣品的大視場顯微成像，及對圖像視野的自適應(yīng)智能調(diào)整，具有自動化程度高的優(yōu)點，不僅可用于對生物樣品的大視場顯微成像，還可應(yīng)用于無透鏡成像的教學演示實驗及科普演示實驗。

1 成像原理

全息圖像恢復(fù)的主要算法有菲涅耳積分法、卷積法及角譜法。其中，角譜法恢復(fù)過程計算量較小，故選用角譜法進行全息圖的恢復(fù)。

無透鏡智能顯微成像系統(tǒng)原理如圖1所示，微孔與樣品的距離為Z1，樣品與CMOS相機的距離為Z2。利用微孔提高光源相干性，使光源經(jīng)過Z1距離的傳播后，照射到樣品上的光為近似相干光。照射至樣品時，通過樣品的光可分為兩種，一種是經(jīng)過樣品的光，其攜帶樣品部分信息，被稱為物光；另一種是透過玻片，未經(jīng)樣品的光，被稱為參考光。這兩部分光相互干渉，形成的干涉圖案被下方的CMOS相機記錄，并傳入電腦端上位機。

圖1 無透鏡智能顯微成像系統(tǒng)原理圖

(1)

其中，α和β為空間頻譜的方位角。

因此，U與Uo的關(guān)系可表示為：

U=-1{{Uo}Hz}

(2)

對全息圖U進行二維傅立葉變換求出CMOS圖像傳感器平面處的角譜A后，代入波長等參數(shù)并乘以該傳播函數(shù)Hz，即可得到樣品平面處的角譜Ao，對求得的角譜做二維傅立葉變換，即可求得樣品平面處的光場分布Uo。圖像重建流程如圖2所示。

圖2 圖像重建流程圖

2 裝置組成

圖3為無透鏡智能顯微成像裝置示意圖。

圖3 無透鏡智能顯微成像裝置示意圖

該裝置從上到下依次為無透鏡成像模塊、自適應(yīng)位移臺及可調(diào)降壓穩(wěn)壓電源模塊。

其中，無透鏡成像模塊包括：1 W高功率藍光LED光源、直徑為50 μm的精密針孔和單像素尺寸為1.335 μm、2600萬像素、視場為57.1 mm2的CMOS相機；自適應(yīng)位移臺包括：兩部垂直放置的兩相四線精密步進電機、兩部低熱量步進電機驅(qū)動器和STM32F4VE單片機；可調(diào)降壓穩(wěn)壓電源模塊包括：LM2596S DC-DC直流可調(diào)降壓穩(wěn)壓模塊及1800 mAh3S航模電池。另外，為滿足無透鏡成像需要，本裝置還設(shè)計了配套暗箱。無透鏡智能顯微成像裝置實物圖如圖4所示。

裝置工作時，無透鏡成像模塊中的LED作為光源向下照射樣品，其干涉圖像被樣品下方的CMOS所記錄并傳至電腦端上位機(其界面如圖4所示)，電腦端上位機實時顯示CMOS所記錄圖像。當電腦端上位機執(zhí)行成像視野自適應(yīng)調(diào)整操作時，其根據(jù)CMOS所成圖像計算并向STM32F4VE單片機發(fā)送指令。單片機根據(jù)指令控制步進電機運動，從而完成對成像視野的自適應(yīng)調(diào)整。調(diào)整至合適視野后，電腦端上位機可實現(xiàn)當前圖像的實時重建與保存。

圖4 無透鏡智能顯微成像裝置實物圖

圖5 電腦端上位機界面

3 自適應(yīng)位移臺及其算法設(shè)計

3.1 自適應(yīng)位移臺設(shè)計

自適應(yīng)位移臺包括兩部運動方向垂直放置的步進電機、下方的STM32F4VE單片機、兩部低熱量步進電機驅(qū)動器以及可調(diào)降壓穩(wěn)壓模塊，圖6為自適應(yīng)位移臺部分示意圖，圖7為位移臺控制圖。通過兩部運動方向垂直放置的步進電機，CMOS能夠?qū)崿F(xiàn)x-y方向的水平位移。其中，兩部步進電機驅(qū)動器設(shè)置為800細分，精度為1.25 μm每步。

在單片機收到電腦端上位機的指令后，根據(jù)指令中的步數(shù)標志向步進電機驅(qū)動器的脈沖正接口輸出相應(yīng)數(shù)目的脈沖精確控制步進電機的運動步數(shù)；根據(jù)指令中的方向標志向步進電機驅(qū)動器的方向負接口輸出對應(yīng)的高低電平控制步進電機運動的方向。步進電機滑塊與CMOS相機固定，從而帶動CMOS相機進行水平位移，實現(xiàn)成像視野的自適應(yīng)智能調(diào)整。

圖6 自適應(yīng)位移臺部分示意圖

圖7 位移臺控制圖

3.2 自適應(yīng)視野調(diào)整算法設(shè)計

在自適應(yīng)調(diào)整時，首先進行圖像處理。圖像處理過程中，將CMOS相機采集到的圖像轉(zhuǎn)化為灰度圖像，得到灰度圖像后對灰度圖像進行邊緣識別。邊緣識別使用Prewitt算子，該算子是一種一階微分算子。對于離散的二維圖像，其水平和垂直方向的梯度為：

(3)

因為圖像的離散性，上式可化簡為：

(4)

其中，f(x,y) 代表(x,y)處的灰度值。

根據(jù)上述原理，Prewitt算子利用3×3的梯度模板，對整幅圖像進行梯度運算，在邊緣處，其灰度值變化大，梯度大，從而提取出圖像中的邊緣信息。

邊緣識別后，圖像相當于經(jīng)過二值化處理，數(shù)據(jù)量大大減小，此時顯示的便是樣品的邊緣。對此時圖像邊緣的所有像素點的坐標進行加權(quán)平均：

(5)

其中，fi代表第i個點的灰度值，xi代表第i個點的x坐標，yi代表第i個點的y坐標。

每一個像素點的權(quán)數(shù)為該點的灰度值，最后除以邊緣像素點的個數(shù)，從而得到樣品的幾何中心坐標(xc,yc)。圖像處理示意圖如圖8所示。

圖8 圖像處理示意圖

對本裝置所用的CMOS相機，其在上位機顯示畫面的尺寸為1 920×1 080，因此畫面中心的坐標為(960,540)。將所求得的樣品中心坐標(xc,yc)與畫面中心坐標(960,540)作差，可得位移臺步數(shù)為：

(6)

其中stepx，stepy為兩個整數(shù)，其絕對值分別代表x及y方向步進電機移動步數(shù)，其正負代表x及y方向步進電機移動方向。

得到上述信息后，進行判斷并生成指令，根據(jù)步進電機擺放方式，若stepx>0則x方向位移臺的方向標志為1，反之方向標志為2；若stepy>0則y方向位移臺的方向標志為2，反之方向標志為1。對stepx和stepy取絕對值，若其中有一項大于99 999，則設(shè)置二次位移標志為1，大于99 999的那一項設(shè)置為99 999。若二次位移標志為1，則位移臺完成位移動作后，上述流程將再次重復(fù)，直至一次位移便能將樣品幾何中心移至視野中心，從而完成視野的自適應(yīng)調(diào)整。自適應(yīng)算法流程圖如圖9所示。

圖9 自適應(yīng)算法流程圖

3.3 指定中心視野調(diào)整算法設(shè)計

指定中心視野調(diào)整模式下，當鼠標點擊上位機界面攝像頭實時畫面視窗某點時，裝置將自動將該點移至視野中央，實現(xiàn)指定中心視野調(diào)整。指定中心視野調(diào)整算法流程圖如圖10所示。

圖10 指定中心視野調(diào)整算法流程圖

該算法首先獲取點擊像素點的坐標(xg,yg)，將其與畫面中心坐標(960,540)作差，可得位移臺步數(shù)為：

(7)

其中stepx包含x方向步進電機移動的方向和步數(shù)，stepy包含y方向步進電機移動的方向和步數(shù)。

重復(fù)3.2節(jié)中生成指令流程，并向單片機發(fā)送指令，控制位移臺動作，從而將鼠標點擊像素點移至視野中央，實現(xiàn)指定中心的視野調(diào)整。

4 裝置測試

裝置測試中，選取椴樹莖及水蚤進行成像。椴樹莖和水蚤成像圖像如圖11、12所示。

(a)椴樹莖干涉圖樣

(a)水蚤干涉圖樣

由圖11、12可見，本裝置能夠很好分辨椴樹莖的外形輪廓、內(nèi)部細節(jié)及水蚤胸肢、殼刺等，具有良好成像能力，能夠滿足教學及演示實驗需求。

5 結(jié) 語

針對傳統(tǒng)光學顯微鏡固定分辨率-視場積的局限，研究人員提出無透鏡顯微鏡，但現(xiàn)有無透鏡顯微裝置大多結(jié)構(gòu)固定，自動化，智能化程度低。針對以上問題，設(shè)計了一套無透鏡智能顯微成像裝置。測試表明，該裝置不僅可實現(xiàn)大市場較高分辨率顯微成像，且配合自適應(yīng)位移臺能夠?qū)崿F(xiàn)對成像視野的自適應(yīng)調(diào)整，結(jié)構(gòu)簡單，經(jīng)濟效益高，自動化程度高。