‘長林3 號’油茶傳粉生物學(xué)特性與繁育系統(tǒng)的研究

蔣 瑤，陳文波，羅家玲

（凱里學(xué)院，貴州凱里 556011）

1 前言

油茶Camellia oleifera，又名油茶樹、茶籽樹、白花茶等，是山茶科Theaceae 山茶屬Camellia常綠闊葉小喬木.油茶種子內(nèi)含高達80%以上油酸，與椰子樹、油棕樹和油橄欖樹并稱為世界四大木本油料樹種［1］.主要分布于亞洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)海拔100?500 m 的陽坡或半陽坡（坡度<25o）的山地［2?3］.

油茶在我國栽培歷史悠久，主要分布于長江流域以南的亞熱帶地區(qū)，貴州省主要集中分布于黔東南苗族侗族自治州的玉屏、錦屏、天柱、黎平等縣［4］.至2017 年，我國油茶栽培面積已高達400×104hm2，年收入約200 億元［5］.種植油茶能夠調(diào)整農(nóng)業(yè)經(jīng)濟結(jié)構(gòu)，帶動地方經(jīng)濟，對促進農(nóng)村脫貧致富具有重大意義.

本試驗所用油茶品種為‘長林3 號’，具有長勢旺盛、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、抗病蟲性強、含油率高等優(yōu)點［6］.該品種油茶喜陽光、濕潤，耐貧瘠，怕寒冷［6］，生命周期長，秋花秋實，開花時間從當年10 月至次年的1月，整個花期為80 d，單株為20 d，單花6?7 d［7］.

近年來關(guān)于油茶的研究均為常規(guī)培育優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)技術(shù)，國內(nèi)林業(yè)工作者通過無性系進行品種選育來解決提高油茶坐果率和花多果少的問題［8］.探索豐產(chǎn)栽培［9］和病蟲害防治技術(shù)［10］及使用組織培養(yǎng)［11］、油茶分子生物學(xué)［12］等技術(shù)進行的研究有很多，但仍未能有效解決油茶花多果少的低產(chǎn)問題.

繁育系統(tǒng)是當今生物學(xué)研究中較為活躍的內(nèi)容之一，它指所有影響后代遺傳組成的有性特征總和，包括花部綜合特征、花部性器官的壽命、訪花昆蟲種類、開花樣式以及交配系統(tǒng)等.

花粉必須在具有活力時到達適宜的接受柱頭方能完成授粉過程，具有接受花粉的適宜柱頭的花朵即處于柱頭可授粉期.花粉保持活力的時間長短與柱頭可授粉期的時間長短結(jié)合在一起，深刻影響著植物的自花傳粉率與授粉成功率，特別是異花傳粉的植物.因此，花粉活力與壽命、柱頭可授性、花期相遇概率以及雜交指數(shù)、異交傾向與主要傳粉媒介等便成為必須關(guān)注的問題.研究發(fā)現(xiàn)，油茶異花授粉率和坐果率均與昆蟲活動規(guī)律密切相關(guān)，實際生產(chǎn)中油茶低產(chǎn)主要是由傳粉昆蟲種群和數(shù)量匱乏造成的.因此，有效傳粉昆蟲數(shù)量依然是提高油茶產(chǎn)量及坐果率的主要因素.

油茶普遍出現(xiàn)花多果少現(xiàn)象，使得油茶產(chǎn)量及出油率都不理想.該現(xiàn)象主要是因為油茶具有典型的自交不親和特性，不存在無融合生殖和自花授粉現(xiàn)象，因此必須借助昆蟲傳粉實現(xiàn)異花授粉才能結(jié)實.

油茶是雌雄同株植物，坐果率低主要是受到花粉限制，為了改變這一現(xiàn)狀，本試驗以‘長林3號’油茶為試材，通過研究其開花物候、花粉活力、柱頭可授性、人工授粉及套袋處理、并對其傳粉者及其訪花行為進行調(diào)查調(diào)查研究，初步探索油茶的傳粉生物學(xué)特性和繁育系統(tǒng)，為油茶的增產(chǎn)或選育提供有用的數(shù)據(jù)和資料.

2 試驗材料與儀器

本試驗以5 年生的‘長林3 號’油茶為試驗材料，在天氣晴朗的上午（9∶00?11∶00）選擇生長健壯、無病蟲害、正常開花的植株并在其大蕾期進行人工授粉.

油茶試驗地位于凱里學(xué)院繼續(xù)教育學(xué)院同得利山莊，地理位置為26o31′35"N，107o53′11"E，海拔744.90 m，屬亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候區(qū)，年平均氣溫為13.6?16.2℃，年均日照1000?1400 h，＞10℃活動積溫4765?5748 ℃，無霜期長達288 d，年相對濕度80%，年平均降雨量1200 mm.

所用的試驗儀器主要有電子分析天平（AR224CN，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），光學(xué)顯微鏡（XSP?1C，北京普析通用儀器有限公司）和連續(xù)變倍體式顯微鏡（JSZ5A、上海博迅實業(yè)有限公司）等.

3 試驗方法

3.1 物候期及花部特征觀察

在試驗中進行油茶鱗片松動期、花蕾期、初綻期、盛花期、凋落期、果實膨大期6 個時期的觀察，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù).花蕾期、盛花期、衰落期、凋謝期、果實膨大期均以第1次出現(xiàn)日期為記錄標準.觀察日期從2018年9月25日起至2019年4月5日止.

在觀察油茶物候期期間，發(fā)現(xiàn)油茶上午8∶00?9∶00 開花，下午16∶00 花瓣會閉合.油茶鱗片松動期為9月30日至8日；花蕾期為10月10至12日；初綻期為10月13日至15日；盛開期為10月18日至23日；凋落期為10月24日至29日；果實膨大期為3月15日至3日.

隨機標記18 株生長健壯無病蟲害的植株且在每株樹上選取3 朵當日綻放的花朵，用游標卡尺測定其花瓣（數(shù)量、長度、寬度、顏色）、雄蕊（數(shù)量、長度）、雌蕊（數(shù)量、長度）、柱頭、胚珠大小等.

3.2 花粉活力、柱頭可授性以及花粉量和胚珠數(shù)比率的測定

利用TTC 法和I2?KI 法測定花粉活力［16］，聯(lián)苯胺?過氧化氫法測定柱頭可授性［17］，通過Cruden R W［18］的標準計算花粉量與胚珠數(shù)之比（P/O），并鑒定其繁育系統(tǒng)類型.

3.3 雜交指數(shù)估算、傳粉者的觀察及人工授粉及套袋試驗

根據(jù)Dafni A［19］的方法標準判斷其雜交指數(shù)，利用韋維等［20］方法對傳粉者進行觀察，根據(jù)張麗芳等［21］方法進行人工授粉及套袋7 個不同處理試驗：CK 為不做任何處理；T1為不去雄直接套袋；T2為同株異花授粉；T3為異株異花授粉；T4為去雄不套袋；T5為去雄套網(wǎng)袋；T6為去雄去雌套袋.（每個處理50朵花且重復(fù)3次，共計1050朵花）.

3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

本試驗數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2010軟件錄入，后采用SPSS 23.0進行數(shù)據(jù)分析，花部特征采用描述統(tǒng)計、坐果率采用SNK法（P<0.05）進行方差分析.

4 試驗結(jié)果與分析

4.1 油茶花部特征觀察

‘長林3 號’油茶的花瓣為5 瓣，花白色并呈分離狀態(tài)，花瓣形態(tài)各異，倒卵形，頂端常凹入或二裂，長2.78 cm，寬1.77 cm；花冠直徑4.46 cm；雄蕊106 枚，長1.34 cm；花藥淡黃色，長0.14 cm；花絲淡黃綠色，外輪花絲與基部連合，長短不一，形成杯狀體子房；淡綠色的雌蕊1枚，長1.17 cm，柱頭先端三淺裂，當柱頭在被未綻放的花瓣包裹時，呈現(xiàn)弧形彎曲，花瓣綻放完全時，柱頭頂部變尖、顏色偏綠色，略高于雄蕊群；子房上位，密被白色絲狀絨毛；胚珠13 枚，白色，背圓腹扁；蜜腺位于子房外側(cè)花絲內(nèi)側(cè)，分泌出的花蜜保存于花絲形成的杯狀體中；花期10?11月（圖1、表1）.

表1 油茶花部特征

圖1 油茶花部特征（A為油茶花朵，B為胚珠數(shù)與胚珠形態(tài)）

油茶單花花期為6?7天，花開放前鱗片松動（圖2a），花瓣大部分于左右張開.花瓣張開后花藥開始開裂，并在內(nèi)全部裂開.但是如果氣溫較低（低于17℃）時，花藥則在1天內(nèi)逐步開裂.花瓣張開的第1天花藥顏色為淡黃色，產(chǎn)生少量花蜜時，花瓣重新卷起閉合（圖2b）.第2天早上后花瓣重新張開，產(chǎn)生大量花蜜，并伴有淡淡花香氣味，花藥從淡黃色變成金黃色，傍晚時花瓣不再卷起（圖2c）.第3天仍然有很多花蜜，花瓣顏色鮮艷（圖2d）.第4天上午花瓣顏色鮮艷度略有降低，但不明顯，同時還有花蜜下午花瓣開始進一步萎蔫（圖2e）.第5天花瓣有些萎蔫，顏色鮮艷度更有所降低.第6天花瓣開始脫落，花藥顏色變深，出現(xiàn)少部分萎蔫（圖2f）.第7天花瓣萎蔫，花謝（圖2g）.

圖2 油茶開花進程

4.2 花粉活力與柱頭可授性

采用TTC 染色法和碘化鉀（I2?KI）染色法進行染色觀察，發(fā)現(xiàn)花粉的顏色均有明顯變化.TTC 染液能夠?qū)⒒ǚ廴境杉t色或者淡紅色的，說明花粉具有活力，無色或者不變色則說明花粉沒有活力，采用I2?KI 染液能夠?qū)⒒ǚ廴境缮詈稚蛘吆稚?，說明花粉具有活力，無色或者不變色則說明花粉沒有活力.因此，有活力的花粉說明花藥開裂散粉，無活力的花粉可能沒有花藥或花藥無法開裂散粉.

使用TTC 染色試劑染色時，需1 h 后才能明顯地看到染色的花粉，這可能是因為油茶花粉對TTC 染色劑不太敏感；I2?KI 染色法染色10 min 后便能清楚看到染色的花粉.兩者進行比較后發(fā)現(xiàn)TTC 染色法能直觀清晰區(qū)分顏色，而I2?KI 染色法因顏色相近，不易分辨.試驗結(jié)果表明：TTC染色法油茶盛花期花粉活力68.80 %，而I2?KI 染液法油茶盛花期花粉活力則為63.67 %，說明TTC 染色法更適合用于油茶花粉活力的測定.但遇到連續(xù)陰天，雄蕊發(fā)育不良，出現(xiàn)少量雄蕊瓣化，或者只有花絲沒有花藥，或者花藥無法開裂散粉的現(xiàn)象.

油茶柱頭可授期4～5 天，由圖3 可知，在開花前1 天至開花后第7 天柱頭可授性呈現(xiàn)先增強后減弱的趨勢，開花前1天，產(chǎn)生47個氣泡，柱頭表面有些濕潤；開花第1天產(chǎn)生87個氣泡，較前1天的氣泡增加52.02%，柱頭可授性增強，便于昆蟲訪花時黏附更多花粉；在其花蕾綻放后的第2天，較開花第1天的氣泡增加32.03%，柱頭可授性達到最大值，柱頭表面變得更加柔軟濕潤；在開花后第3天的柱頭上可看到較前1天的氣泡個數(shù)減少32.03%，柱頭表面逐漸失去水分變得干燥；在開花后第4 天，產(chǎn)生70 個氣泡，較前1 天減少45.31%，柱頭表明失水更為明顯，可授性降低；當花蕾綻放后的第5天時花瓣開始萎蔫，產(chǎn)生63個氣泡，較前1天減少10.00%，可授性逐漸降低；第6天時花柱開始失水干枯甚至有的花柱開始變成褐色，氣泡個數(shù)為0，說明失去可授性.結(jié)合光學(xué)顯微鏡（10×10）觀察，油茶在授粉前，柱頭上沒有分泌物的產(chǎn)生；授粉后柱頭上開始有分泌物覆蓋，并黏住花粉，讓其成為油茶花粉萌發(fā)的基質(zhì)，當油茶在開花后的第5 天柱頭則慢慢失去可授性直至開花后第6 天和第7 天失去可授性.因此，油茶柱頭長約5 天的可授期可保證受精的正常進行，提高植物的結(jié)實率.

圖3 不同開花時期對油茶柱頭可授性的影響

4.3 P/O測定及雜交指數(shù)估算

測定單花的花粉量，其結(jié)果表明單花粉量為33117.00±109.57粒，胚珠數(shù)目為13±0.28枚，P/O為2547.46，根據(jù)Cruden R W［18］提出的標準將油茶繁育系統(tǒng)鑒定為兼性異交.有效花粉數(shù)量是異花授粉成功與否的關(guān)鍵，盡管油茶的花粉活力不高，壽命也不長，但由于花粉量較大（P/O 為2547.46），因此從總體上提高了油茶的生殖成功率.按照Dafni A［19］的方法對油茶的雜交指數(shù)進行測量（表1）.花冠直徑平均值為4.46±0.13 cm.花藥開始開裂散粉，隨后柱頭具有可授性.柱頭可授期較花粉壽命更長，但由于花藥后期的花粉數(shù)量較少、活力降低且花絲干枯松動，少有昆蟲訪花，因此雌雄在時間上并沒有分離（表1）.在空間上，剛開放時雄蕊緊貼子房與柱頭，隨后雄蕊向上且向外伸長，雄蕊（1.34±0.13 cm）略高于雌蕊（1.17±0.02 cm），因此花內(nèi)雌雄繁殖器官存在一定的空間分離，使得油茶雜交指數(shù)達到4（表2）.根據(jù)Dafni A［19］的劃分評判標準，油茶繁育系統(tǒng)為異交型，有較低的自交親和性，傳粉時需要傳粉者.

表2 油茶雜交指數(shù)（OCI）值

4.4 傳粉者的種類

蟲媒傳粉對花粉流的形成起著決定性作用.試驗期間，觀察發(fā)現(xiàn)，訪花昆蟲類群包括蜂類（圖4A和D），蟻類、鞘翅目的金龜子（圖4C）及半翅目的蝽（圖4B）等4種訪花昆蟲.

圖4 傳粉者種類（A、B、C、D分別表示大分舌蜂、菜蟲春、金龜子和油茶地蜂）

大分舌蜂Colletes gigas和油茶地蜂Andrena Comellia訪花部位均是花朵，訪花時直接落于花中間，連續(xù)訪花3?4朵，訪花時間為9∶00?17∶00.參與油茶花授粉主要是雌蜂，雄蜂一般只采食花蜜不能進行有效傳粉［20?23］.蜂類一般具有訪花速率快、飛行距離遠、傳粉效率高的特點，易于采集花粉.油茶地蜂比大分舌蜂更耐寒，成蟲的活動期從10 月開始至翌年1 月，與油茶的花期高度吻合；油茶地蜂的蜜粉源植物與大分舌蜂一致，也具有寡訪花性，也是油茶花期主要傳粉昆蟲［24?25］.金龜子在花朵中間采食雌蕊，易于攜帶花粉，常常數(shù)只長時間聚集于同一朵花上活動，花間遷移較少，因此有利于自花授粉.

4.5 人工授粉及套袋處理

經(jīng)授粉及套袋處理后，油茶坐果率有所提高（0?53.33%），且坐果率依次為T6

由圖5 可見，在p<0.05 標準下，T2、T3、T4、CK 之間均無顯著差異；T1、T4、CK 之間均無顯著差異；T1、T4、T5之間均無顯著差異；T1、T5、T6之間均無顯著差異.坐果率T3>T2、>T6.坐果率之間出現(xiàn)差異性，可能是因為處理方式不同（T3為異株異花授粉、T2為同株異花授粉、T6為去雄去雌，無法進行有效授粉），因此，T3、T2與T6極顯著差異.

圖5 不同處理方式對坐果率的影響

5 結(jié)論與討論

5.1 結(jié)論

油茶花期從當年10 月至11 月，單花花期為6?7 天，利用TTC 染色法花粉活力為68.8%，高于I2?KI 染色法花粉活力63.67%，單花花粉粒為33117.00±109.57 粒，13 枚胚珠，OIC 為4，P/O值為2547.46，坐果率0?53.33%，其大小為T6

5.2 討論

對大部分的植物來說，開花是在綻放之后至花瓣開始凋謝而終止整個開花進程，而油茶開花進程則是開放和閉合交替進行的，有研究工作者將其稱之為“二次開合”［22］.油茶8∶00?16∶00開花，16∶00后開始閉合花瓣，可節(jié)約能量以延長花的壽命，適應(yīng)訪花昆蟲少的情況.次日上午9∶00再次綻放，本試驗與王湘南［23］研究一致，這與油茶開花習(xí)性和當?shù)貧夂颦h(huán)境有關(guān).

影響植物坐果率的內(nèi)在因子是花粉活力和柱頭可授性，外在因子是外界條件，要完成有效授粉需要有活力的花粉和柱頭具有可授性，兩者缺一不可［24］.這與王湘南［23］研究一致.本試驗發(fā)現(xiàn)，油茶的花粉活力與柱頭可授性達到相對一致性.

植物會通過花朵下垂來提高昆蟲訪問頻率，提高授粉成功率，避免花粉因陽光直射活力降低，延長雄性特征表達時間.試驗過程中，發(fā)現(xiàn)了4 種傳粉者.油茶地蜂是高度特化的傳粉者，其選擇向更特化的方向發(fā)展.油茶地蜂為寡食性的獨居型昆蟲，但主要取食普通油茶的花粉及花蜜，油茶地蜂在油茶林下的土中，油茶林附近的喬木林緣、空地處，油茶林周邊的小路兩旁、土坎下及空地草叢的地下筑巢.陰雨或低溫天氣，林間基本見不到訪花傳粉者，這與黃墩元［25］研究結(jié)果一致，可能油茶在冬季開花，限制了許多傳粉者的活動.影響油茶傳粉者有效傳粉的兩個重要因素是氣溫和光照，有效傳粉者的缺乏和較短的柱頭可授期是影響油茶坐果率低的主要原因.

據(jù)相關(guān)研究報道，自花傳粉是被子植物進化的一種普遍趨勢，是植物在惡劣環(huán)境中保證繁育成功的一種適應(yīng)機制之一［26］.在自然條件下，油茶能夠結(jié)實，但坐果率較低，說明油茶自花授粉能結(jié)果.在自然條件下植物會自交的原因來源自身的單花花粉量、傳粉者數(shù)量以及自花花粉和異花花粉在獲得受精機會上的競爭能力有關(guān)［27］.

傳統(tǒng)觀念認為油茶是異花授粉植物，且自花不孕［28］.本試驗與高超等［28］研究不一致.廖婷等［29］以‘湘林’系列為試驗材料，通過自花授粉研究其自交親和性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)‘湘林’系列的油茶存在較低的自交親和性.本試驗不去雄直接套袋，坐果率達20.00%，表明‘長林3號’油茶具有自花自交的能力，但自交坐果率較低.國家油茶科技攻關(guān)組曾在無性系間首次發(fā)現(xiàn)自花可孕植株，而且自花授粉率還很高［30］，故‘長林3號’油茶自交不親和性有待進一步證實.