鐵過載對原代神經(jīng)元衰老的影響

李沖,陳蕾蕾,謝俊霞

(青島大學(xué)腦科學(xué)與疾病研究院(山東省神經(jīng)相關(guān)疾病的機制與防治重點實驗室，山東省沿海地區(qū)神經(jīng)退變疾病協(xié)同創(chuàng)新中心),山東 青島 266071)

帕金森病是世界第二大神經(jīng)退行性疾病，典型病理特征是黑質(zhì)致密帶多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失，α-突觸核蛋白的聚集和鐵沉積[1-3]。越來越多的證據(jù)表明鐵沉積會導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元死亡，鐵過載是神經(jīng)元死亡的誘因而非結(jié)果[4-5]。除了可以通過氧化損傷途徑促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元死亡，大量的鐵可以促進(jìn)α-突觸核蛋白的表達(dá)[6]，也可從蛋白翻譯后水平影響其磷酸化[7-8]，促進(jìn)蛋白聚積，進(jìn)而損傷神經(jīng)元[9-10]。隨著年齡增加，多種器官發(fā)生鐵聚積，腦內(nèi)鐵沉積隨之不斷加劇[11]，過量鐵導(dǎo)致的氧化水平升高又會進(jìn)一步引發(fā)鐵蛋白釋放[12]。細(xì)胞衰老是細(xì)胞無法進(jìn)入細(xì)胞周期而處于停滯狀態(tài)，是防止細(xì)胞不受調(diào)控持續(xù)增殖的機制，主要表現(xiàn)為炎性因子的分泌、β-半乳糖苷酶活性增加以及衰老相關(guān)分泌表型[13]。隨著年齡的增加，衰老細(xì)胞在體內(nèi)逐漸累積，衰老的細(xì)胞部分喪失生理活性，影響機體正常生理功能。在主要的神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病以及亨廷頓癥病人腦內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了衰老的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞[14-15]。在疾病狀態(tài)下的神經(jīng)元也會出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，據(jù)文獻(xiàn)報道，在γ射線誘導(dǎo)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞衰老模型中，衰老細(xì)胞的鐵水平是正常細(xì)胞的30倍之多[16]。另有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)毒素百草枯可誘發(fā)與帕金森病相關(guān)的細(xì)胞衰老和神經(jīng)病理特征[17]。最近有研究表明，誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化的多巴胺能神經(jīng)元也觀察到衰老表型[18]。已有實驗證實，衰老細(xì)胞內(nèi)鐵含量明顯升高，衰老導(dǎo)致的鐵攝取和儲存異常會影響鐵介導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程[11,16]，衰老的細(xì)胞若不及時清除，會進(jìn)一步損傷周圍細(xì)胞[19]。為了探討鐵過載能否引發(fā)神經(jīng)元衰老進(jìn)而引發(fā)死亡丟失，本研究用枸櫞酸鐵銨(FAC)對原代神經(jīng)元進(jìn)行處理，檢測其衰老發(fā)生情況。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

FAC(Sigma)，胎牛血清(依科賽(澳洲源))，SA-β-Gal染色試劑盒(CST，9860S)，DMEM高糖培養(yǎng)液(Gibco，1210038)以及DMEM/F12培養(yǎng)液(Hyclone，SH30023.01)，D-多聚賴氨酸、B27(Gibco)，β-阿糖胞苷、青鏈霉素混合液、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)(索萊寶)和倒置顯微鏡(OLYMPUS，IX73)。

1.2 實驗方法

1.2.1中腦腹側(cè)原代神經(jīng)元培養(yǎng) 將深度麻醉的孕12～14 d的Wistar大鼠用醫(yī)用乙醇噴灑消毒后，用手術(shù)剪沿大鼠的腹中線剪開至腹腔完全暴露，用鑷子取出串珠樣胚胎，放在預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)液中，迅速轉(zhuǎn)移至超凈工作臺上。用尖鑷將胎鼠剝離出來，先在解剖顯微鏡下將中腦組織塊取出轉(zhuǎn)移至新鮮的DMEM培養(yǎng)液中，再在鏡下修剪掉多余組織塊和血管膜，保留蝴蝶狀腹側(cè)，加入適量胰蛋白酶，置37 ℃培養(yǎng)箱中孵育消化，5 min后加入終止液終止消化。用1 mL移液槍輕柔地吹打盡量使組織塊分散，靜置片刻后吸取上清至50 mL離心管中，重新加入新鮮的DMEM培養(yǎng)液5 mL，重復(fù)上述步驟3次。將上清以1 000 r/min離心5 min后棄上清，加入含有B27的DMEM/F12完全培養(yǎng)液，輕輕吹打成均勻的單細(xì)胞懸液，接種到12孔板上，每孔1×105個細(xì)胞，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1 d后更換一半培養(yǎng)液，此后每隔2 d更換新鮮培養(yǎng)液，7 d后成熟的神經(jīng)元可用于后續(xù)實驗。經(jīng)β-阿糖胞苷處理，神經(jīng)元純度達(dá)90%以上，符合實驗要求。

1.2.2實驗分組及處理 將細(xì)胞隨機分為對照組和實驗組。實驗組細(xì)胞加入100 μmol/L的FAC作用24 h，對照組細(xì)胞用不含F(xiàn)AC的低血清培養(yǎng)液進(jìn)行處理。

1.2.3細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性檢測 應(yīng)用SA-β-Gal染色試劑盒檢測細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性。FAC處理24 h后，用0.01 mol/L PBS潤洗細(xì)胞2次，每次30 s，每孔細(xì)胞加入1 mL固定液，室溫固定15 min，用0.01 mol/L PBS沖洗細(xì)胞2次，每次30 s，棄掉洗液，每孔加入1.5 mL染色液，用封口膜密封細(xì)胞培養(yǎng)板防止染液蒸發(fā)，置37 ℃恒溫箱中孵育過夜。用0.01 mol/L PBS潤洗細(xì)胞2次，每次30 s，在奧林巴斯倒置顯微鏡明場下觀察并獲取圖像，陽性細(xì)胞顯示為亮藍(lán)色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

與對照組相比較，實驗組細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶陽性染色明顯增強(圖1)，對照組著色細(xì)胞比例為(2.077±0.440)%，實驗組著色細(xì)胞比例為(25.200±1.164)%，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(n=3，t=18，P<0.05)。提示100 μmol/L FAC作用于原代神經(jīng)元24 h，細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性增加，表明100 μmol/L FAC可以誘導(dǎo)原代神經(jīng)元發(fā)生衰老。

3 討 論

鐵是維持生命活動的關(guān)鍵微量金屬元素之一，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，參與腦內(nèi)線粒體呼吸、軸突髓鞘化以及神經(jīng)遞質(zhì)的形成[12]。鐵作為活潑金屬，也可以催化多種生化反應(yīng)，增加氧化應(yīng)激，過量的活性氧損傷細(xì)胞膜、核酸及蛋白結(jié)構(gòu)，引發(fā)細(xì)胞毒性[20]。枸櫞酸是鐵的天然螯合劑，枸櫞酸鐵為枸櫞酸與鐵離子形成的鐵鹽，是美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)的補鐵藥劑[21]。本實驗所用的FAC是枸櫞酸鐵更具溶解性的形式，添加FAC可模擬高鐵環(huán)境，以探討鐵過載對神經(jīng)元細(xì)胞衰老的影響。

對于體外培養(yǎng)細(xì)胞的衰老研究，衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶的活化是常用的生物學(xué)特征[22-23]。β-半乳糖苷酶是溶酶體水解酶，通常在pH值為4時表現(xiàn)出活性；而在衰老的細(xì)胞中，pH值為6時有活性，利用β-半乳糖苷酶底物進(jìn)行染色，就能從正常細(xì)胞中區(qū)分出衰老細(xì)胞[24]。本實驗采用100 μmol/L FAC處理原代神經(jīng)元24 h，觀察到β-半乳糖苷酶的陽性染色明顯增強，提示細(xì)胞衰老的發(fā)生。

越來越多的證據(jù)表明，鐵穩(wěn)態(tài)失衡促進(jìn)神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展[25-28]，鐵沉積是帕金森病一個主要的病理特征，也是人們普遍認(rèn)為的發(fā)病誘因。有研究證實，細(xì)胞內(nèi)鐵過載會增加氧化還原水平[29-30]，促進(jìn)α-突觸核蛋白的聚積，進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，如二價鐵可以通過與α-突觸核蛋白mRNA的C端ASP-121、Asn-122、Glu-123位結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)α-突觸核蛋白表達(dá)，也可以在轉(zhuǎn)錄后水平參與蛋白磷酸化等修飾過程，促進(jìn)蛋白聚集發(fā)揮細(xì)胞毒性作用[31-32]，并且α-突觸核蛋白寡聚過程產(chǎn)生活性氧是鐵依賴性的[33]。鐵過載增加細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平可能是誘導(dǎo)衰老的重要機制。本實驗結(jié)果表明，鐵過載會誘發(fā)神經(jīng)元衰老，這為后續(xù)進(jìn)行神經(jīng)元變性死亡研究提供了新的思路。但處于衰老狀態(tài)的神經(jīng)元細(xì)胞是通過何種通路逐漸死亡丟失，神經(jīng)元衰老與目前已知凋亡、壞死和鐵死亡之間是否存在因果或先后關(guān)系，衰老在神經(jīng)元變性死亡過程中的具體機制還有待進(jìn)一步的研究探討。