PCR熒光探針法聯(lián)合DNA微陣列芯片法檢測在肺結(jié)核診斷和治療中的應(yīng)用

王曉紅

江西省上饒市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西上饒 334000

肺結(jié)核是臨床呼吸內(nèi)科常見的一類慢性傳染性疾病，主要是由于結(jié)核分枝桿菌感染肺部而引起，主要癥狀包括發(fā)熱、咳痰、疲乏無力、血液系統(tǒng)異常等，此病亦是中青年人群的重要死因之一，對患者的生命健康造成嚴(yán)重威脅[1-2]。目前對于肺結(jié)核的診斷，多采用醫(yī)生詢問體征及有無病史結(jié)合痰結(jié)核分枝桿菌檢查，以及影像學(xué)檢查等[3]。肺結(jié)核發(fā)病率居高不下，引起國內(nèi)外廣泛關(guān)注，以往通過傳統(tǒng)痰涂片痰培養(yǎng)診斷肺結(jié)核，但此種方法存在檢測陽性率低，所需時間長等不足之處，為臨床診治帶來了難度，因此提高肺結(jié)核的診斷陽性率以及診治速度尤為關(guān)鍵[4-5]。本研究主要探究PCR熒光探針法聯(lián)合DNA微陣列芯片法檢測在肺結(jié)核診斷和治療中的應(yīng)用效果，旨在尋找臨床診斷肺結(jié)核及耐藥鑒定快速準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月至10月上饒市第二人民醫(yī)院收治的128例肺結(jié)核患者為觀察組，另外選取同期40例非肺結(jié)核患者為對照組。對照組中，男30例，女10 例；年齡 24～80 歲，平均（52.15±5.02）歲。觀察組中，男 96例，女 32例；年齡 23～81歲，平均（54.05±4.85）歲。兩組的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)上饒市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①觀察組患者經(jīng)臨床診斷并結(jié)合影像學(xué)資料、實(shí)驗(yàn)室檢查，確診為肺結(jié)核患者；②所有對象均留取晨痰、血清標(biāo)本進(jìn)行痰涂片抗酸染色結(jié)核抗體PCR熒光探針法及DNA微陣列芯片法檢測；③患者及其家屬知曉本次研究，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有惡性腫瘤者；②合并心、肝、腎等重要器官功能障礙者；③合并患有其他傳染疾病者。

1.2 檢測方法

（1）痰涂片抗酸染色法：取痰液標(biāo)本涂在載玻片上，使用抗酸染色液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號：20191021）進(jìn)行染色，染色完成后置于顯微鏡下觀察，連續(xù)觀察300個不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌為抗酸桿菌陰性（－），否則為抗酸桿菌陽性（＋）。（2）PCR熒光探針法：①收集患者痰液標(biāo)本，加入等量4%NaOH溶液于離心管中震蕩搖勻，室溫下液化30 min后放入離心機(jī)（1200 r/min）中離心5 min，棄上清液后加入1 ml生理鹽水后離心，重復(fù)以上操作，棄上清液后加入核酸提取液50 μl，混勻后放入DNA提取儀震蕩5 min，取出放在95℃水浴鍋中加熱5 min；將提取好的核酸加入反應(yīng)體系中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增程序，分別為37℃，30 s；94℃，180 s；94℃，15 s；60℃，30 s； 檢測時選擇FAM、VIC通道，采集熒光點(diǎn)在60℃，30 s。當(dāng)Ct值＜40為陽性，擴(kuò)增曲線非S型或者Ct值為40（或者無數(shù)值）則為陰性[6]。（3）結(jié)核抗體檢測：采用結(jié)核抗體檢測試劑盒（上海奧普生物醫(yī)藥股份有限公司，生產(chǎn)批號：20190915）進(jìn)行檢測，在反應(yīng)板的反應(yīng)孔中間，依次加入2滴封閉液、40 μl血清標(biāo)本、6滴洗滌液、2滴金標(biāo)液、6滴洗滌液，等待薄膜吸入。結(jié)果讀?。罕∧ぶ虚g有紅圓點(diǎn)為陽性，否則為陰性。（4）DNA微陣列芯片法：對PCR擴(kuò)增出結(jié)核分枝桿菌的提取液和結(jié)核基因芯片反應(yīng)液進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行芯片雜交，之后采用結(jié)核分枝桿菌耐藥基因盒（成都博奧晶芯生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：20191102）進(jìn)行利福平和異煙肼耐藥性檢測[7]，洗板使用微陣列掃描儀和相應(yīng)軟件進(jìn)行信號的讀取及結(jié)果判讀，所有操作過程都嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。

1.3 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

①比較痰涂片抗酸染色、血清結(jié)核抗體及PCR熒光探針法檢測結(jié)果及診斷效能，a、b、c、d分別表示真陽性、假陽性、假陰性、真陰性，靈敏度=a/（a+c），特異度=d/（b+d），陽性預(yù)測值=a/（a+b），陰性預(yù)測值=d（c+d），準(zhǔn)確度=（a+d）/（a+b+c+d）。②統(tǒng)計 DNA 微陣列芯片法檢測利福平和異煙肼耐藥性結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 痰涂片抗酸染色、血清結(jié)核抗體及PCR熒光探針法檢測結(jié)果及診斷效能比較

PCR熒光探針法診斷肺結(jié)核的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、準(zhǔn)確度高于痰涂片抗酸染色和血清結(jié)核抗體，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表 1～4）。

表1 痰涂片抗酸染色檢測結(jié)果（例）

表2 血清結(jié)核抗體檢測結(jié)果（例）

表3 PCR熒光探針法檢測結(jié)果（例）

表4 三種檢測方法檢測診斷效能比較（%）

2.2 DNA微陣列芯片法檢測利福平和異煙肼耐藥性的結(jié)果

128例肺結(jié)核患者中，DNA微陣列芯片法檢出利福平敏感45例，耐藥11例；異煙肼敏感44例，耐藥12例；雙重耐藥5例。其中11例利福平耐藥標(biāo)本中，利福平rpoB基因耐藥位點(diǎn)分布為531（TCG→TTG）位點(diǎn) 6例，526 （CAC→TAC） 位點(diǎn) 2例，526 （CAC→CTC）位點(diǎn) 1 例，516（GAC→GGC）位點(diǎn) 1 例，511（CTG→CCG）位點(diǎn)1例；12例異煙肼耐藥標(biāo)本中異煙肼katG基因耐藥位點(diǎn)分布為315（AGC→ACC）位點(diǎn)11例，315（AGC→AAC）位點(diǎn) 1 例。

3 討論

肺結(jié)核是嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全的傳染病之一，兼具感染率高、死亡率高、控制進(jìn)程緩慢等特點(diǎn)，因此早期診斷及盡早制定治療方案對治療肺結(jié)核尤為重要[8]。肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌所引起，因此目前臨床上對于發(fā)現(xiàn)結(jié)核病傳染源的主要手段是對患者痰液中的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測，常用方法有改良羅氏法、結(jié)合抗體檢測等，但這些方法在檢測陽性率、檢測周期等方法存在不足之處[9-10]。近些年來，由于分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，相關(guān)檢測技術(shù)應(yīng)用于肺結(jié)核臨床診斷中，PCR熒光探針具有檢測周期短、敏感度高等優(yōu)勢，可精準(zhǔn)檢測患者痰液中的結(jié)核分枝桿菌；DNA微陣列芯片法操作簡單且可以同時檢測多種分枝桿菌多種耐藥情況，可有效減少患者診斷和治療時間[11-12]。

PCR熒光探針法診斷肺結(jié)核的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、準(zhǔn)確度高于痰涂片抗酸染色和血清結(jié)核抗體，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示PCR熒光探針法可作為臨床分枝桿菌感染診斷的重要檢測手段。PCR熒光探針法主要是將雙重PCR技術(shù)和Taqman探針技術(shù)相結(jié)合，再根據(jù)結(jié)核分枝桿菌的特異性序列，設(shè)計引物以及探針；探針標(biāo)記不同的熒光發(fā)光基因，根據(jù)不同的熒光通道的熒光信號變化，判定是否感染結(jié)核分枝桿菌，操作簡便、快速，且準(zhǔn)確率高[13]。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用DNA微陣列芯片法檢出利福平敏感45例，耐藥11例；異煙肼敏感44例，耐藥12例；雙重耐藥5例，提示DNA微陣列芯片法可快速檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平異煙肼耐的耐藥性，具有較高的檢測效能。DNA微陣列芯片法是通過檢測抗結(jié)核藥物利福平和異煙肼的耐藥基因的野生型、不同突變型來判斷是否耐藥；同時可快速檢測標(biāo)本中的分枝桿菌利福平基因和耐異煙肼基因突變的變位點(diǎn)，特異性高[14-15]；此外設(shè)計PCR擴(kuò)增引物與核苷酸探針，在芯片上固定，并經(jīng)與針對性擴(kuò)增受檢樣本的DNA片段雜交，通過芯片掃描儀對雜交后的芯片熒光信號進(jìn)行掃描獲取菌種信息[16-17]。DNA微陣列芯片法檢測結(jié)核分枝桿菌的耐藥與傳統(tǒng)藥物敏感法有較高的一致性，較為可靠且檢測所需時間短，可以作為臨床肺結(jié)核耐藥性的快速篩查方法[12]。

綜上所述，PCR熒光探針法聯(lián)合DNA微陣列芯片法既能提高結(jié)核分枝桿菌的陽性率，也能快速檢測結(jié)核分枝桿菌的耐藥性，48 h即可獲得診斷及耐藥結(jié)果，可以協(xié)助早期診斷，制定有效的治療方案，對改善肺結(jié)核患者預(yù)后具有重要意義，臨床價值高。