β-E2對大鼠低氧性肺動(dòng)脈高壓的改善作用

韓志富

(聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四一醫(yī)院，西寧 810000)

女性易發(fā)原發(fā)性肺小動(dòng)脈高壓 (pulmonary hypertension，PH)，具有明顯的性別差異性。已有很多研究發(fā)現(xiàn)雌激素對肺動(dòng)脈具有保護(hù)作用[1，2]，但在低氧性肺動(dòng)脈高壓(Hypoxic pulmonary hypertension，HPH)的發(fā)生、發(fā)展過程中，β-E2是否具有保護(hù)作用尚未定論。本研究擬明確β-E2對大鼠HPH的相關(guān)作用及可能作用機(jī)制。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性SD大鼠(體重：150±20g)購自蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SYXK(甘)2018-0003。

1.1.2 儀器及試劑

JY92-II超聲波細(xì)胞粉碎儀購自寧波新芝生物儀器公司；RPMI 1640培養(yǎng)液購自美國Hy-Clone公司；Eppendorf-5430型臺(tái)式超高速低溫離心機(jī)購自德國Eppendorf公司；萊卡RM224-5型石蠟切片機(jī)購自德國萊卡生物儀器公司；Motic SMZ140解剖顯微鏡購自香港MOTIC公司；ZTE-202型恒溫干燥箱購自上海器特儀器有限責(zé)任公司；M-MuLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自英國Invitrogen公司；瓊脂糖及嗅化乙錠(EB)購自美國Amresco公司；β-E2購自美國SA公司；DNA Ladder Marker 2000購自西安舟鼎生物試劑有限責(zé)任公司；酶標(biāo)儀購自美國POWERWAVE公司；GeneAmp 9700型RT-PCR儀購自美國Life Technologies公司；Biosens SC810型凝膠成像系統(tǒng)購自上海Biosens公司；PowerPac Basic電泳儀購自美國Bio-Rad公司。抗大鼠P27kip 1抗體購自美國Millipore公司；抗大鼠Skp-2抗體購自英國Abcam公司；抗大鼠AKT-P抗體購自美國Ce1lSignaling公司；抗大鼠p-actin抗體購自美國Sigma-Aldrich公司；HRP標(biāo)記的山羊-抗鼠二抗及商品化免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物試劑有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

1.2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將約200 g的成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為常氧組和低氧組。常氧組大鼠置常氧動(dòng)物室中(大氣壓強(qiáng)約580mmHg，PO2為120mmHg，O2濃度約為18%)中飼養(yǎng)；低氧組大鼠置低壓低氧艙(大氣壓強(qiáng)約為380mmHg，PO2為79.6mmHg，O2濃度約為10%)中飼養(yǎng)。

1.2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)分組

實(shí)驗(yàn)分常氧組(Normoxia)、低氧組(Hypoxia)、β-E2干預(yù)組(10-5、10-7、10-9mol/L)。

1.2.2 大鼠PASMCs原代培養(yǎng)與鑒定

取各組大鼠原代肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞行細(xì)胞貼壁法培養(yǎng)。一周后在顯微鏡下可見肺小動(dòng)脈組織周圍有呈梭形的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞生長(圖1 A )，且融合生長的原代PASMCs在對數(shù)期的細(xì)胞呈長梭形，且細(xì)胞形態(tài)較整齊、透光性良好，細(xì)胞群在對數(shù)期內(nèi)都呈現(xiàn)渦旋狀分布 (圖1B )。通過a-SM-actin免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)多數(shù)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞熒光染色為深紅色，表達(dá)為陽性(+)，說明本次培養(yǎng)的細(xì)胞就是肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，而且陽性率高達(dá)95%以上(圖1a )。

(A)PASMCs grew from lung arterial explants；(B)Confluence PASMCs(×100)(a)Fluorescence staining of a-SMA in rat PASMCs(×400)；(b)Hoechst Staining of cell PASMCs；(c)Mix picture of(a)/(b)

1.2.3 平滑肌細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將對數(shù)生長期的肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞用胰蛋白酶消化混勻后，按4×104個(gè)/孔的濃度接種在96孔板中，運(yùn)用血清饑餓法誘導(dǎo)細(xì)胞同步分裂，即先行饑餓培養(yǎng)48 h，再加入1640培養(yǎng)液(含有5%血清)和不同濃度的β-E2培養(yǎng)，在常氧條件和低氧條件下進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后分別加入MTT(5mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入DMSO(每孔150μL)震蕩10 min，在490 nm波長處檢測吸光度值。

1.2.4 檢測

1.2.4.1 Western Blot實(shí)驗(yàn)

在1.2.3的實(shí)驗(yàn)中，收集細(xì)胞后提取總蛋白，用Western Blot檢測Skp-2、P27kip1的蛋白表達(dá)水平。

1.2.4.2 RT-PCR實(shí)驗(yàn)

在1.2.3的實(shí)驗(yàn)中，收集細(xì)胞提取RNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測P27kip1、Skp-2的mRNA表達(dá)水平。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 21.0軟件，分析各組數(shù)據(jù)間的差異性選用方差分析法，多組間的差異比較采用LSD法，視P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.結(jié)果

2.1 β-E2對低氧環(huán)境所誘導(dǎo)肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響

圖2顯示，較常氧組，低氧組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞數(shù)增加了約1.5倍，說明低氧可以明顯刺激肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖。β-E2干預(yù)組的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖量顯著低于低氧組，β-E2濃度為10-5mol/L時(shí)，較低氧組細(xì)胞增殖數(shù)量減少了43%，說明β-E2的干預(yù)有效減少了低氧肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖量。

*：P<0.01，vs normoxia group.#：P<0.01，vs hypoxia group.Values are expressed as

2.2 β-E2對肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Skp-2、P27kip1表達(dá)的影響

圖3a顯示，較常氧組，經(jīng)低氧刺激的細(xì)胞的P27kip 1表達(dá)水平顯著降低，Skp-2表達(dá)水平顯著升高；相比低氧組，經(jīng)β-E2干預(yù)后的細(xì)胞P27kip 1、Skp-2表達(dá)水平呈下降趨勢。

圖3b 顯示，常氧組和低氧組P27kip 1轉(zhuǎn)錄mRNA的表達(dá)差異并不顯著、Skp-2表達(dá)差異顯著，說明低氧刺激對P27kip 1的表達(dá)水平未產(chǎn)生明顯影響。即β-E2干預(yù)對P27kip 1轉(zhuǎn)錄的mRNA的量無顯著影響，對Skp-2的表達(dá)存在影響。

2.3 β-E2對肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的磷酸化AKT水平的影響

(a)Representative Western blotting analysis of P27kip1 and Skp-2 protein levels in rat lungs(b)Representative RT-PCR analysis of P27kip1 and Skp-2 mRNA levels in rat.*：P<0.05，vs hypoxia group.#：P<0.05，vs normoxia group

圖4顯示，低氧組肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的磷酸化AKT的表達(dá)水平明顯高于常氧組，而經(jīng)β-E2干預(yù)后，有效降低了低氧刺激后的磷酸化AKT水平。

Representative Western blotting analysis of AKT-P protein levels in cultured rat PASMCs.*：P<0.01，vs hypoxia group.#：P<0.05，vs normoxia group.Values are expressed as mean±SD(n=3)

3.討論

在HPH的發(fā)生發(fā)展過程中會(huì)出現(xiàn)肺小動(dòng)脈小血管的重構(gòu)，且肺小動(dòng)脈血管的重構(gòu)機(jī)制非常復(fù)雜，目前尚未完全闡明。已有研究發(fā)現(xiàn)在治療血管性疾病時(shí)，可以把控制細(xì)胞周期作為一個(gè)重要的方法[3]。近年來P27kip1引起了很多學(xué)者的關(guān)注，作為影響細(xì)胞周期抑制因子和表達(dá)抑癌蛋白，其具有抑制癌細(xì)胞增殖和刺激血管增生的作用[4]。Diez等研究發(fā)現(xiàn)P27kip 1具有抑制動(dòng)脈粥樣硬化和血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用[5]。由于Skp-2既是P27kip 1的降解酶，同時(shí)也是一種致癌基因蛋白，因而備受關(guān)注[6-8]。目前已經(jīng)將Skp-2作為癌癥及心血管疾病的治療靶點(diǎn)[9-10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)低氧刺激后，血管平滑肌細(xì)胞P27kip 1、Skp-2和磷酸化AKT的表達(dá)增多，而采取β-E2干預(yù)后，P27kip 1、Skp-2和磷酸化AKT水平都較低氧組有了明顯改善，出現(xiàn)了表達(dá)逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。因此，通過調(diào)節(jié)Skp2、P27kip1、AKT信號(hào)通路抑制肺動(dòng)脈肌細(xì)胞的增殖是β-E2發(fā)揮保護(hù)作用的一個(gè)可能機(jī)制。