2型糖尿病患者循環(huán)CD4+T細胞亞群與腎臟損傷的相關性研究

程 亮，徐 永

(1.徐州醫(yī)科大學附屬淮安醫(yī)院內分泌科，江蘇 淮安 223002；2.徐州醫(yī)科大學附屬淮安醫(yī)院腎內科，江蘇 淮安 223002)

糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease,DKD)是2型糖尿病(type 2 diabetes milletus,T2DM)最常見的慢性并發(fā)癥，也是導致T2DM患者病死率增加的主要原因之一。DKD早期表現為腎小球濾過率(glomerular filtration rate,GFR)增加，特征是腎小球肥大，腎小球系膜細胞增生和細胞外基質增加；隨著病情的發(fā)展，患者GFR水平逐漸下降，表現為腎小球基底膜彌漫性增厚，系膜基質增生，甚至腎小管萎縮，并最終進展為終末期腎臟病(end stage renal disease,EASD)[1]。傳統(tǒng)觀點認為，代謝紊亂和血流動力學異常是DKD的主要致病因素[2]。然而，隨著慢性低級別炎癥狀態(tài)與T2DM之間的關系被揭示，免疫與炎癥機制在DKD發(fā)展過程中作用受到了廣泛關注，T細胞激活、單核-巨噬細胞募集、以及釋放炎癥細胞因子被認為參與了DKD的發(fā)生發(fā)展[3]。基于此，本研究通過檢測T2DM患者外周血CD4+T細胞亞群，并分析其與腎功能變化之間的關系，旨在探討CD4+T細胞在DKD發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究在徐州醫(yī)科大學附屬淮安醫(yī)院開展研究受試者招募工作，招募日期為2019年1月—2020年12月。T2DM診斷符合1999年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)公布的糖尿病診斷標準。排除標準：①嚴重肝、腎功能不全的患者；②合并糖尿病急性并發(fā)癥、感染性疾病、自身免疫性疾病或腫瘤的患者；③近期有創(chuàng)傷或手術病史的患者；④近3個月曾接受過全身糖皮質激素或其他可能影響免疫系統(tǒng)藥物治療的患者。共有113例T2DM患者納入研究。依據是否合并DKD，入組T2DM患者被分為兩組，T2DM組和DKD組。DKD診斷參照《糖尿病腎臟病診治專家共識》，即微量白蛋白尿[尿白蛋白/肌酐比值(urinary albumin to creatinine ratio，ACR)30～<300 mg/g)]或大量白蛋白尿(ACR≥300 mg/g)或估算腎小球濾過率(estimate the glomerular filtration rate，eGFR)下降[eGFR<60 mL·min-1·1.73 m-2][4]。T2DM患者中，T2DM組63例，男性25例，女性28例，年齡44～74歲，平均(59.6±12.8)歲；DKD組50例，男性20例，女性30例，年齡46～77歲，平均(60.9±11.9)歲。另外選取30例于2019年1月—2020年12月在徐州醫(yī)科大學附屬淮安醫(yī)院體檢的健康志愿者作為對照組(NC組)，要求血糖在正常范圍內、無T2DM家族史、且無臨床確診疾病。正常對照組30例，男性13例，女性17例，年齡46～72歲，平均(58.2±10.0)歲。三組性別和年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者均已簽署了書面知情同意書。

1.2研究方法 收集受試者的性別、年齡、身高、體重、收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)等人口統(tǒng)計數據，并計算體重指數(body mass index,BMI)。禁食8 h后，留取空腹靜脈血，檢測空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)、糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglycerides，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)。血糖和血脂采用全自動生化分析儀檢測(HITACHI-7180，日本)，HbA1c采用高效液相色譜分析法檢測(BIO-RAD D-10TM，美國)。eGFR計算公式為：186×血清肌酐(serum creatinine，SCr)-1.154×(年齡)-0.203×0.742(女性)。BMI計算公式為：體重(kg)/身高2(m2)。

1.3流式細胞術分析 肝素抗凝管采集受試者外周肘靜脈血約5 mL，Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。采用FITC-anti-CD4、PE-anti-CD25和APC-anti-FOXP3標記，流式細胞儀檢測Treg(CD4+CD25+Foxp3+)細胞占CD4+T淋巴細胞的比例；采用PerCP-Cy5.5-anti-CD3、FITC-anti-CD8和PE-anti-IFN-γ標記，流式細胞儀檢測Th1(CD3+CD8-IFN-γ+)占CD3+T細胞比例；采用PerCP-Cy5.5-anti-CD3、FITC-anti-CD8和PE-anti-IL-4標記，流式細胞儀檢測Th2(CD3+CD8-IL-4+)占CD3+T細胞比例。

1.4統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料的多組間比較采用單因素方差分析檢驗，在組間比較時，方差齊性選擇LSD-t檢驗，方差不齊選擇LSD-t′檢驗。CD4+T細胞亞群與臨床參數之間的相關性采用Spearman相關性分析，并采用多元線性回歸分析確定CD4+T細胞亞群的影響因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1兩組臨床指標及T細胞亞群的比較 與對照組比較，T2DM組和DKD組的SBP、FPG、HbA1c和TC水平明顯升高(P<0.05)；且與T2DM組相比，DKD組SBP、HbA1c、SCr和ACR水平明顯升高(P<0.05)，eGFR水平明顯下降(P<0.05)。通過流式細胞儀檢測發(fā)現，與對照組相比，T2DM組和DKD組的外周血Th1細胞比例和Th1/Th2比值明顯升高(P<0.05)，但Tregs細胞比例卻顯著降低(P<0.05)。而且，與T2DM患者相比，DKD組的外周血Th1細胞比例和Th1/Th2比值升高(P<0.05)，Tregs細胞比例下降(P<0.05)。見表1。

表1 受試者的基本臨床特征比較

2.2T2DM患者eGFR與外周血CD4+T細胞亞群的相關性分析 T2DM患者外周血Th1/Th2比值與eGFR呈負相關關系(r=-0.211,P=0.025)；Tregs細胞比例與eGFR呈正相關關系(r=0.276,P=0.003)。

2.3多元線性回歸分析T2DM患者腎功能變化的影響因素 為了明確T2DM患者腎功能變化的影響因素，采用多元逐步回歸分析，以eGFR為因變量，年齡、性別、BMI、SBP、DBP、FPG、HbA1c、TC、TG、LDL-C、HDL-C、Th1、Th2、Th1/Th2比值、以及Tregs為自變量進行分析。結果發(fā)現，SBP、Tregs、Th1/Th2比值和TC是T2DM患者eGFR變化的影響因素，回歸方程為eGFR=131.842-0.479×SBP+10.654×Tregs-0.623×Th1/Th2比值+3.169×TC。見表2。

表2 多元逐步回歸分析新診斷T2DM患者eGFR的影響因素

3 討 論

DKD是一種由多種因素共同作用導致的慢性腎臟疾病(chronic kidney disease,CKD)，特征為持續(xù)性蛋白尿和腎功能進行性下降。在此過程中，腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)(renin angiotensin aldosterone system,RAAS)激活導致腎臟血流動力學異常被認為是DKD的主要致病因素[5]。然而，近年來的研究發(fā)現，腎臟組織中單核巨噬細胞募集和T淋巴細胞激活，并釋放炎癥細胞因子參與了DKD的發(fā)病過程[6]。一方面，長期高血糖可以導致糖基化終末產物(advanced glycation end products,AGEs)蓄積，并與淋巴細胞發(fā)生交聯反應，促進淋巴細胞激活和釋放炎癥介質[7]。另一方面，RAAS激活和內皮細胞損傷是淋巴細胞活化增殖和炎癥反應發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[8]。

T淋巴細胞可以被分為CD4+輔助性T細胞和CD8+細胞毒性T細胞，分別識別主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ類和Ⅰ類分子遞呈的肽類分子。根據功能與細胞因子分泌情況，CD4+T細胞可被分為促炎的Th1和Th17，以及抗炎的Th2和Tregs。一旦被激活，Th1和Th2可以表現出多種炎癥跡象，包括釋放大量的細胞因子。Th1能夠分泌干擾素γ(interferon-γ,INF-γ)、白細胞介素(interleukin，IL)2和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)，并觸發(fā)細胞免疫和吞噬細胞依賴性炎癥反應；Th2分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13,主要調節(jié)抗體反應。相比之下，Tregs是一類主要發(fā)揮免疫抑制功能的T細胞亞群，通過細胞接觸抑制效應T細胞增殖，并表達IL-10、轉化生長因子β等細胞因子抑制Th1、Th2和Th17等細胞的免疫應答反應，減輕炎癥反應[9]。本研究中，與對照組相比，T2DM患者外周血Th1細胞比例升高，Tregs細胞比例下降，且Th1/Th2細胞比值明顯升高。這些結果與既往研究結果相符，提示T2DM患者體內Tregs細胞免疫抑制功能下降，Th1、Th2等效應T細胞被激活并參與免疫應答，促進慢性炎癥反應的發(fā)生。將T2DM患者進一步分為T2DM組和DKD組后，與T2DM患者相比，DKD組的外周血Th1細胞比例和Th1/Th2比值進一步升高升高，Tregs細胞比例進一步下降。而且，Spearman相關性分析發(fā)現，T2DM患者外周血Th1/Th2比值與eGFR呈負相關關系； Tregs細胞比例與eGFR呈正相關關系。多元逐步回歸分析提示Tregs和Th1/Th2是T2DM患者eGFR變化的影響因素。這些研究結果提示，T2DM患者體內存在CD4+T穩(wěn)態(tài)失衡，CD4+T細胞亞群向促炎方向極化，并與T2DM患者腎功能下降密切相關。

既往研究顯示，DKD患者腎活檢標本中存在CD4+T細胞浸潤，并與腎功能下降密切相關，提示CD4+T細胞浸潤與T2DM患者腎臟損傷和DKD進展有關[10]?；罨腡細胞可以通過細胞毒作用直接損傷腎臟組織，并可以刺激系膜細胞分泌集落刺激因子1(colony stimulating factor,CSF-1)和單核細胞趨化因子1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)間接導致腎損傷[11]。T細胞表達AGEs受體，與AGEs結合后被激活，IFN-γ合成和分泌增加，加重腎臟組織的免疫炎癥損傷[12]。T2DM患者體內Th1細胞在腎小球歸巢與細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICMA-1)、巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)和P選擇素水平升高有關，這些細胞因子可以引起進一步的腎損傷[13]。而且，動物實驗中，CKD大鼠血清中Th1細胞比例升高，Tregs比例下降，且腎組織中IFN-γ、TNF-α mRNA和蛋白表達水平明顯下降[14]。臨床研究發(fā)現，Th1細胞相關炎癥因子在CKD患者腎臟組織損傷中發(fā)揮重要作用，包括IFN-γ和IL-2等[15]。

綜上所述，DKD患者體內存在CD4+T細胞穩(wěn)態(tài)失衡，表現為CD4+T細胞亞群向促炎方向極化，外周血促炎Th1表達升高，抗炎Tregs表達下降。而且，T2DM患者外周血CD4+T細胞異常與eGFR水平下降密切相關，提示CD4+T細胞穩(wěn)態(tài)失衡或參與了DKD發(fā)生發(fā)展。