維生素D 受體基因多態(tài)性與妊娠期糖尿病的關(guān)系

陳慧敏 蕭敏華 孫靜 吳錦暉 羅紅鳳 劉喜紅

廣州醫(yī)科大學(xué)廣州市婦女兒童醫(yī)療中心（廣州 510623）

妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）是指孕期首次發(fā)現(xiàn)的任何程度的糖耐量異常［1-2］。GDM 已成為全球主要的公共衛(wèi)生問題，我國(guó)GDM 的發(fā)病率高達(dá)11.9%～18.9%［3-4］，并逐年上升。GDM嚴(yán)重危害母嬰健康，增加了母嬰圍產(chǎn)期并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［5］，也與母親及后代的2 型糖尿病等代謝性疾病密切相關(guān)［6］。

VDR 基因多態(tài)性的國(guó)內(nèi)外研究在2 型糖尿病患者的人群研究較多，結(jié)果尚不一致［7-9］，而關(guān)于GDM 人群的文獻(xiàn)報(bào)道較少，結(jié)論存在爭(zhēng)議，且存在樣本量偏少，忽視控制混雜因素等問題［10-11］?；蚨鄳B(tài)性還存在國(guó)家、地域的差異性［12］，因此更有必要在中國(guó)GDM 人群中進(jìn)一步開展研究。為深入探索GDM 是否與VDR 基因多態(tài)性有關(guān)系，本研究分析了中國(guó)人群VDR 基因（rs2228570 G ＞A，rs739837 G＞T）的多態(tài)性與GDM 的關(guān)系，探討GDM的遺傳易感因素及可能的發(fā)病機(jī)制，對(duì)妊娠糖尿病的預(yù)測(cè)、從醫(yī)學(xué)營(yíng)養(yǎng)的角度預(yù)防和治療都具有重要的意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象本研究是一項(xiàng)基于中國(guó)人群的病例-對(duì)照研究。2019 年6-11 月，在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心產(chǎn)科門診建檔的孕婦中，招募符合標(biāo)準(zhǔn)的研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡22～40 歲，單胎，孕齡24～28 周，彼此為無(wú)血緣關(guān)系的個(gè)體，自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：孕前原有的糖尿病、多囊卵巢綜合征、高血壓等基礎(chǔ)疾病及其他影響血糖調(diào)節(jié)的疾病，多胎妊娠，不能配合研究實(shí)施者。按我國(guó)的GDM 診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］及2019 年美國(guó)ADA 糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，孕24～28 周時(shí)口服75 g 葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）結(jié)果任何一點(diǎn)達(dá)到或超過臨界值（空腹5.1 mmol/L，1 h 10.0 mmol/L，2 h 8.5 mmol/L）即診斷為GDM。由Quanto1.2.4 軟件根據(jù)等位基因頻率及患病率等估算樣本量，并保證對(duì)照組樣本量大于病例組。篩選符合診斷標(biāo)準(zhǔn)及納入標(biāo)準(zhǔn)的GDM孕婦555 例為病例組，在同一門診選擇與檢測(cè)日期、孕周和孕產(chǎn)次相匹配的646 例正常孕婦為對(duì)照組。本研究獲得廣州市婦女兒童醫(yī)療中心倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（第114A01 號(hào)），并與孕婦簽署了科學(xué)研究知情同意書。通過問卷調(diào)查和半結(jié)構(gòu)式訪談收集一般資料和病史。

1.2 病例資料（1）孕前BMI=孕前體質(zhì)量（kg）/身高（m）2，孕前體質(zhì)量由孕婦提供，身高為招募時(shí)體格測(cè)量值。（2）孕晚期糖化血紅蛋白（HbA1c）是指孕28～32 周的血液檢驗(yàn)數(shù)據(jù)。（3）糖尿病或高血壓家族史定義為一級(jí)親屬（父，母，兄弟姐妹）或二級(jí)親屬（祖父母，外祖父母，父母的同胞）至少1 人患糖尿病或高血壓。（4）不良孕產(chǎn)史包括不孕不育、自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)、生育畸形或智力低下兒等。

1.3 研究方法

1.3.1 候選基因位點(diǎn)的選擇結(jié)合常用的NCBIdbSNP（single nucleotide polymorphism，SNP）數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇的SNP 位點(diǎn)主要位于5′UTR 非編碼區(qū)（5′-untranslatedregion）、3′UTR 和外顯子等基因功能區(qū)域，可以導(dǎo)致與轉(zhuǎn)錄起始因子結(jié)合能力改變、microRNA 結(jié)合能力改變或引起氨基酸改變等，從而導(dǎo)致不同的生理功能。根據(jù)千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)選擇位點(diǎn)在中國(guó)正常人群中最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.05 及低連鎖不平衡（R2＜0.8）。綜合考慮以上因素最終選擇了維生素D 受體基因的2 個(gè)SNP 位點(diǎn)：位于基因5′端第2 外顯子起始密碼子的突變r(jià)s2228570 和3′UTR 的rs739837。

1.3.2 基因多態(tài)性分析所有研究對(duì)象留取EDTA抗凝全血2 mL，用于提取DNA。利用DNA 抽提試劑盒（MaGen 美基生物公司）按標(biāo)準(zhǔn)操作流程提取基因組DNA。將合格DNA 樣品稀釋至10 ng/μL，裝入96 孔板中。引物和探針由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)（ABI）公司合成，采用Taqman SNP 基因分型試劑盒，應(yīng)用ABI Quant StudioTM實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）系統(tǒng)對(duì)這兩個(gè)VDR 的SNP 位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。PCR 的反應(yīng)條件設(shè)置為：95 ℃活化10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，共45 個(gè)循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較分析采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)和百分?jǐn)?shù)描述，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)。對(duì)基因多態(tài)性數(shù)據(jù)進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)（HWE），其中顯性遺傳模型（aa+Aa/AA）、隱性遺傳模型（aa/Aa+AA），a為突變等位基因，A 為野生等位基因。多因素分析采用非條件logistic 回歸。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料病例組和對(duì)照組孕婦的年齡、孕次和產(chǎn)次的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。GDM 患者的孕前BMI、OGTT 血糖值、孕晚期糖化血紅蛋白（HbA1c）、糖尿病家族史、高血壓病家族史和不良孕產(chǎn)史發(fā)生率顯著高于正常孕婦對(duì)照組（P＜0.05），見表1。

表1 病例和對(duì)照組一般資料的比較Tab.1 Comparison of general data between the case and control group

表1 病例和對(duì)照組一般資料的比較Tab.1 Comparison of general data between the case and control group

2.2 維生素D受體基因多態(tài)性與GDM的遺傳易感性關(guān)系對(duì)照組符合HWE 平衡（rs2228570 G ＞A，P=0.692；rs739837，G ＞TP=0.236），證實(shí)本研究的資料具有群體代表性。選擇的兩個(gè)SNPs 位點(diǎn)的基因型分布、等位基因頻率和不同遺傳模型分析見表2，rs2228570 位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在病例和對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在顯性模型下表現(xiàn)出與GDM關(guān)聯(lián)（P＜0.05）；rs739837 位點(diǎn)的多態(tài)性分析在兩組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 VDR 基因的SNPs 位點(diǎn)多態(tài)性和GDM 遺傳易感性的關(guān)系Tab.2 Association between VDR gene SNPs and genetic susceptibility of GDM 例（%）

2.3 VDR 基因多態(tài)性與GDM 發(fā)生的多因素分析以是否GDM 為因變量，年齡、孕前BMI、糖尿病家族史、不良孕產(chǎn)史、高血壓家族史、rs2228570位點(diǎn)多態(tài)性為自變量進(jìn)行l(wèi)ogistic 回歸分析，自變量賦值見表3。結(jié)果顯示：年齡、孕前BMI、不良孕產(chǎn)史、高血壓家族史和rs739837 位點(diǎn)多態(tài)性與GDM 無(wú)關(guān)（均P＞0.05），rs2228570 位點(diǎn)多態(tài)性和糖尿病家族史是GDM 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見表4。

表3 自變量賦值表Tab.3 Independent variable assignment table

表4 GDM 影響因素的logistic 回歸分析Tab.4 Logistic regression analysis of influencing factors for GDM

3 討論

維生素D 受體為親核蛋白，作為配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，是核激素受體家族的一員。人類VDR基因位于第12 染色體長(zhǎng)臂q13～14 區(qū)，整個(gè)基因組由9 個(gè)外顯子和8 個(gè)內(nèi)含子組成。rs2228570 位點(diǎn)，也稱為FokI 限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，位于VDR 蛋白翻譯的起始位點(diǎn)，是目前唯一已知的可以改變蛋白結(jié)構(gòu)的VDR 的單核苷酸多態(tài)性［13］，產(chǎn)生424 或427 個(gè)氨基酸兩種不同的蛋白質(zhì)，在胰島素的代謝途徑中發(fā)揮作用［14］。rs739837 位于3′UTR 非編碼區(qū)，其變異不影響氨基酸序列，不太可能影響VDR 本身的功能，但它可能位于能夠調(diào)節(jié)VDR 表達(dá)的microRNA 的結(jié)合位點(diǎn)，可調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，尤其對(duì)mRNA 的穩(wěn)定性有調(diào)控作用。

目前在GDM 人群中關(guān)于rs2228570（FokⅠ）位點(diǎn)的研究結(jié)果存在矛盾。SIQUEIRA 等［10］報(bào)道了巴西人群GDM 與VDR 受體基因FokⅠ多態(tài)性沒有關(guān)系。ASLANI 等［15］在伊朗人群中的研究發(fā)現(xiàn)rs2228570 多態(tài)性與GDM 的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)聯(lián)。APAYDIN 等［11］在土耳其人群發(fā)現(xiàn)FokⅠ多態(tài)性與GDM 的發(fā)生有關(guān)系，其變異可能導(dǎo)致GDM 患者胰島素抵抗受損和代謝紊亂。本研究樣本量更充足，結(jié)果支持rs2228570 位點(diǎn)多態(tài)性與GDM 的發(fā)病有關(guān)系，可能在GDM 的發(fā)病機(jī)制中起潛在作用這一論點(diǎn)。與對(duì)照組比較，GDM 組等位基因A 的頻率更高。從GDM 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)來看，A 等位基因攜帶者是G 等位基因攜帶者的1.72 倍，GA 基因型攜帶者是GG 基因型的2.80 倍，AA 基因型攜帶者是GG基因型的3.98 倍。在顯性模型下表現(xiàn)出與GDM 有關(guān)聯(lián)，至少攜帶1 個(gè)等位基因A 的個(gè)體是非攜帶者患病風(fēng)險(xiǎn)的3.07 倍。結(jié)果提示AA 基因型為易感基因型，而A 等位基因?yàn)橐赘谢?。活性維生素D需通過與VDR 結(jié)合而顯示其細(xì)胞活性，調(diào)節(jié)胰腺β 細(xì)胞的胰島素分泌［16］。A 等位基因編碼較長(zhǎng)的VDR 蛋白質(zhì)［17］，轉(zhuǎn)錄的活性較弱，從而造成生理功能的下降，可能導(dǎo)致胰島素合成和分泌缺陷，在GDM 發(fā)病機(jī)制中起一定作用?？傊狙芯勘砻鱮s2228570 位點(diǎn)多態(tài)性是GDM 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，今后通過VDR 的基因分型可以發(fā)現(xiàn)GDM 易感人群，從而提供有針對(duì)性的維生素D 補(bǔ)充建議。

研究表明rs739837 與中國(guó)人群2 型糖尿病及其脂質(zhì)代謝有關(guān)系［18-19］，該位點(diǎn)變異增加了2 型糖尿病的患病風(fēng)險(xiǎn)。但在妊娠期人群中沒有觀察到病例和對(duì)照之間rs739837基因型頻率的顯著差異。雖然GDM 和2 型糖尿病可能具有相似的風(fēng)險(xiǎn)因素和遺傳易感性［20］，但本研究的結(jié)果提示rs739837 與GDM 沒有顯著關(guān)聯(lián)，與既往在2 型糖尿病人群的結(jié)果不一致，可能的原因包括：（1）rs739837 的變異并不影響VDR 基因的功能，在GDM 發(fā)病機(jī)制中所起的作用較弱。（2）GDM 發(fā)生在育齡婦女，妊娠后受胎盤分泌的激素影響加重了胰島素抵抗［21］，在發(fā)病年齡、性別和妊娠生理特點(diǎn)等方面與2 型糖尿病有明顯的區(qū)別。（3）不同研究群體的結(jié)果差異可能與地域、環(huán)境、樣本量和實(shí)驗(yàn)方法等因素有關(guān)。

本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于：在中國(guó)人群中發(fā)現(xiàn)了rs2228570 位點(diǎn)與GDM 的關(guān)聯(lián)，為尋找中國(guó)GDM孕婦的易感基因提供了新的理論依據(jù)，并探討了VDR 基因多態(tài)性在GDM 發(fā)病機(jī)制中可能的作用。雖然研究設(shè)計(jì)合理，但也存在一些局限性：首先，沒有檢測(cè)血清維生素D 水平，缺乏相關(guān)的分析。其次，選取了2 個(gè)位于功能區(qū)的SNPs，數(shù)目較少，今后可增加位點(diǎn)數(shù)目以獲得更為全面的結(jié)果。最后，研究對(duì)象來自同一家醫(yī)療機(jī)構(gòu)，缺乏對(duì)地域、環(huán)境及生活方式等因素的分析，今后可開展多中心、大樣本、不同地區(qū)人群的關(guān)聯(lián)研究以及功能學(xué)研究進(jìn)一步證實(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，中國(guó)人群中VDR 基因rs2228570 位點(diǎn)多態(tài)性與GDM 的發(fā)生有關(guān)系，可能是GDM 的易感基因之一。本研究結(jié)果可為鑒定GDM 早期風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物以及發(fā)病機(jī)制的探索提供科學(xué)依據(jù)，為GDM 的預(yù)防和治療提供新的思路。