HIV-1 感染者免疫活化對(duì)宿主限制因子SAMHD1表達(dá)和HIV-1 DNA 水平的影響

饒和平 姚水洪 王煒 靳昌忠

1衢州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院“衢州市病毒致瘤研究科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)”（浙江衢州 324000）；2衢州市疾病預(yù)防控制中心艾滋病實(shí)驗(yàn)室（浙江衢州 324000）；3浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（杭州 310003）

不育-α-基序結(jié)構(gòu)域和組氨酸/天冬氨酸殘基雙聯(lián)體結(jié)構(gòu)域包涵蛋白1（sterile alpha motif domain and HD domain 1，SAMHD1）是一種HIV-1 宿主限制因子，它通過(guò)水解dNTP 降低細(xì)胞內(nèi)dNTP水平，使病毒逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程由于缺乏足夠的dNTP而受阻［1-4］。SAMHD1 的表達(dá)受干擾素調(diào)控［5-6］，HIV-1 感染者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中的SAMHD1表達(dá)與血漿IFNα濃度呈正相關(guān)［7］。HIV-1 DNA水平是HIV-1儲(chǔ)藏庫(kù)的指標(biāo)，SAMHD1 可以限制HIV-1 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成DNA，進(jìn)而影響HIV-1 儲(chǔ)藏庫(kù)的形成［8-10］。體外研究發(fā)現(xiàn)SAMHD1 可以影響靶細(xì)胞內(nèi)的HIV-1 DNA 水平［11-12］，但HIV-1 感染者體內(nèi)SAMHD1 是否對(duì)CD4+T 細(xì)胞HIV-1 DNA 水平有影響目前還不清楚。本文研究了SAMHD1 表達(dá)與免疫活化和HIV-1 DNA 水平的關(guān)系，初步探索SAMHD1 與HIV-1 儲(chǔ)藏庫(kù)的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象HIV-1 感染者來(lái)自2019 年8-11 月期間浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：年滿18 周歲且不超過(guò)（含）75 周歲，經(jīng)初篩和確認(rèn)試驗(yàn)HIV-1 抗體陽(yáng)性；排除標(biāo)準(zhǔn)為：近期有機(jī)會(huì)性感染，或并發(fā)腫瘤或風(fēng)濕免疫性疾病，或合并HBV/HCV 感染。共選取57 例未接受抗病毒治療的HIV-1 感染者作為未治療組，62 例接受抗病毒治療1 年以上且病毒載量低于檢測(cè)限的HIV-1 感染者作為治療組，48 例健康體檢者作為健康對(duì)照組。本研究得到浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究方案均告知患者本人，并簽訂了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 HIV-1 RNA 及DNA 檢測(cè)HIV-1 RNA 檢測(cè)采用HIV-1 Monitor 1.5（Roche 公司，瑞士）試劑盒，在COBAS Amplisemsor-PCR 儀上，對(duì)血漿樣品的HIV-RNA 作定量分析，操作按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，結(jié)果以每毫升血漿含病毒拷貝數(shù)表示，最低檢測(cè)限50 拷貝/mL。細(xì)胞內(nèi)的HIV-1 DNA 檢測(cè)先使用QIAamp DNA Blood Mini kit（凱杰公司，德國(guó)）提取外周血總DNA，按說(shuō)明書操作進(jìn)行。采用HIV-1 DNA Detection Kit（PCR-Fluorescent Probing）（廣州海力特公司）試劑盒檢測(cè)HIV-1 感染者外周血HIV-1總DNA。取5 μL DNA 模板，加入45 μL PCR 預(yù)混液中。反應(yīng)條件為：（1）37 ℃5 min，95 ℃10 min；95 ℃15 s，65 ℃15 s，72 ℃20 s，反應(yīng)5 循環(huán)；（2）95 ℃15 s，62 ℃15 s，72 ℃20 s，反應(yīng)40 循環(huán)；（3）95 ℃15 s，52 ℃15 s，72 ℃32 s，反應(yīng)10 循環(huán)。細(xì)胞中HIV DNA 含量結(jié)果計(jì)算：同步擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別定量每份樣本中HIV DNA（單位：拷貝/mL），除以PBMC 定量結(jié)果（單位：個(gè)/mL），再乘以106得出標(biāo)本中每106個(gè)細(xì)胞中HIV DNA 含量（單位：拷貝/兆細(xì)胞）。

1.2.2 CD4+T細(xì)胞定量和免疫活化檢測(cè)以CD4+T細(xì)胞表面CD38 分子的表達(dá)作為CD4+T 細(xì)胞免疫活化的標(biāo)志［13-14］，使用美國(guó)Coulter 公司流式細(xì)胞儀和三色標(biāo)記CD3/CD4/CD38 單抗絕對(duì)定量試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，取全血50 μL，用20 μL 單克隆抗體混合物孵育1 h，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞之后上機(jī)檢測(cè)。用systemU 軟件進(jìn)行分析。

1.2.3 血漿IFNα 水平檢測(cè)采用人IFNαELISA檢測(cè)試劑盒（R&D 公司）檢測(cè)血漿IFNα 水平，操作按照說(shuō)明書所述步驟進(jìn)行。

1.2.4 SAMHD1表達(dá)定量檢測(cè)每人抽取EDTA抗凝血5 mL，用密度梯度離心法分離PBMC，并進(jìn)一步用CD4+T 細(xì)胞分選磁珠（美天旎公司，德國(guó)）分選CD4+T 細(xì)胞。用TRIzol 溶液（Invitrogen，美國(guó)）提取PBMC 和CD4+T 細(xì)胞總體RNA 后，采用PrimeSciptTM逆轉(zhuǎn)試劑盒和SYBR 定量檢測(cè)試劑（大連寶生物有限公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件為：先在95 ℃反應(yīng)30 s，再在95 ℃5 s 和60 ℃30 s 反應(yīng)40 循環(huán)。SAMHD1 mRNA 檢測(cè)上游引物為：5′-AAAACCAGGTTTCACAACTTCTGC-3′，下游引物為：5′-TGCGGCATACAAACTCTTTCTGT-3′，以GAPDH 為內(nèi)參（上游引物：5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′下游引物：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′）。利用2-ΔΔCt相對(duì)定量法來(lái)計(jì)算SAMHD1 的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，HIV-1 病毒載量、HIV-1 DNA 和SAMHD1 mRNA 水平以M（P25，P75）表示，其余數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)及方差不齊的正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)，正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)兩兩比較采用student-t檢驗(yàn)，三組比較采用單因素方差分析，采用Pearson 檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)的相關(guān)性，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIV-1 感染者基本情況57 例未接受抗病毒治療者CD4+T 細(xì)胞數(shù)（276.1±104.8）個(gè)/μL，病毒載量63 055（5 149，525 371）拷貝/mL；62 例接受抗病毒治療者平均抗病毒治療（3.6±2.1）年，平均CD4+T 細(xì)胞數(shù)（405.3±131.2）個(gè)/μL，病毒載量均低于檢測(cè)限，見(jiàn)表1。

表1 研究對(duì)象臨床信息及免疫學(xué)和病毒學(xué)指標(biāo)Tab.1 Clinical information，immunological and virological indexes of subjects

表1 研究對(duì)象臨床信息及免疫學(xué)和病毒學(xué)指標(biāo)Tab.1 Clinical information，immunological and virological indexes of subjects

2.2 HIV-1 感染者CD4+T 細(xì)胞免疫活化和干擾素IFN-α 水平HIV-1 感染者未治療組平均CD4+CD38+T 細(xì)胞百分比為（40.7 ± 5.3）%，高于治療組（29.8 ± 3.6）%（P＜0.01），兩組均顯著高于健康對(duì)照組（17.5 ± 1.3）%（P＜0.01）。HIV-1 感染者血漿IFN-α 濃度顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01），升高約2～3 倍；未治療組和HAART 治療組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.3 HIV-1 感染者外周血HIV-1 DNA 水平未治療組HIV-1 DNA水平為781.3（427.6，963.5）拷貝/兆PBMC，或902.6（493.9，1 265.3）拷貝/mL 全血，高于治療組117.2（73.4，163.1）拷貝/兆PBMC，或201.8（132.7，248.2）拷貝/mL 全血（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

2.4 HIV-1 感染者PBMC 和CD4+T 細(xì)胞中SAMHD1 表達(dá)水平未治療組HIV-1 感染者PBMC 中SAMHD1 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平為12.2（7.9，16.1）×10E-4，治療組HIV-1感染者PBMC中SAMHD1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平為15.7（8.1，18.9）×10E-4，均高于健康對(duì)照組［3.7（0.7，5.6）×10E-4］（P＜0.01）。未治療組HIV-1 感染者CD4+T 細(xì)胞中SAMHD1 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平為1.3（0.8，1.9）×10E-4，治療組HIV-1感染者CD4+T 細(xì)胞中SAMHD1mRNA 相對(duì)表達(dá)水平為1.7（0.9，2.4）×10E-4，均低于健康對(duì)照組［4.1（3.3，5.2）×10E-4］（P＜0.01）。治療組和未治療組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.5 HIV-1感染者SAMHD1 mRNA表達(dá)與HIV-1 DNA 和細(xì)胞免疫活化相關(guān)性兩組感染者CD4+T細(xì)胞SAMHD1 mRNA 的表達(dá)與免疫活化均呈負(fù)相關(guān)，未治療組R值為-0.81（P＜0.01），治療組R值為-0.78（P=0.015）；未治療組PBMC 中SAMHD1 mRNA 的表達(dá)與CD4+T 細(xì)胞免疫活化呈負(fù)相關(guān)，R值為-0.31（P=0.03），治療組R值為-0.42（P=0.15）。兩組感染者PBMC和CD4+T細(xì)胞中SAMHD1 mRNA的表達(dá)水平與外周血HIV-1 DNA 水平均無(wú)顯著相關(guān)性，見(jiàn)表2。

表2 SAMHD1 表達(dá)與免疫活化和HIV-1 DNA 水平的相關(guān)性Tab.2 Correlation between SAMHD1 expression and immune activation and HIV-1 DNA level

3 討論

SAMHD1 是髓系細(xì)胞（如樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）中HIV-1 感染的主要限制因子［15］，靜息CD4+T 細(xì)胞高表達(dá)SAMHD1 并可以減少HIV-1 的感染［16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)HIV-1 感染者PBMC 中SAMHD1 表達(dá)升高，這與先前的研究一致［6］，但是CD4+T 細(xì)胞中SAMHD1 表達(dá)有所下降。對(duì)于PBMC 和CD4+T 細(xì)胞中SAMHD1 表達(dá)趨勢(shì)相反的現(xiàn)象，可能與以下原因有關(guān)：HIV-1 感染者CD4+T 細(xì)胞數(shù)量下降，導(dǎo)致PBMC 的組成比例發(fā)生改變，髓系細(xì)胞比例相對(duì)升高；HIV-1 感染者高表達(dá)SAMHD1 的靜息CD4+T 比例明顯降低，活化細(xì)胞比例上升［6］，從而導(dǎo)致平均SAMHD1 表達(dá)水平下降。

干擾素α 可以誘導(dǎo)SAMHD1 的表達(dá)［7］，HIV-1感染者PBMC 中SAMHD1 表達(dá)升高可能與干擾素水平升高有關(guān)。CD4+T 細(xì)胞中SAMHD1 表達(dá)受免疫活化影響更大。筆者發(fā)現(xiàn)HIV-1 感染者CD4+T細(xì)胞中SAMHD1 mRNA 表達(dá)均較健康對(duì)照顯著下降，與CD4+T 細(xì)胞免疫活化呈顯著的負(fù)相關(guān)性，這可能與HIV-1 感染者CD4+T 細(xì)胞廣泛活化，靜息細(xì)胞比例減少有關(guān)。及早抗病毒治療不僅可以抑制HIV-1 的復(fù)制，還可以降低CD4+T 細(xì)胞免疫活化［13］。

SAMHD1 對(duì)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程的抑制會(huì)導(dǎo)致HIV-1總DNA 的產(chǎn)生減少［18-19］研究發(fā)現(xiàn)，與未治療組比，抗病毒治療患者外周血中HIV-1 總DNA 水平顯著降低。CD4+T 細(xì)胞SAMHD1 表達(dá)與HIV-1 總DNA水平之間沒(méi)有顯著相關(guān)性。HIV-1 總DNA 水平受很多因素影響，除SAMHD1 以外還包括HIV-1 RNA 水平、活化CD4+T 細(xì)胞數(shù)量、外泌體2LTR等［19-20］。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，HIV-1 感染者CD4+T 細(xì)胞中SAMHD1 的表達(dá)與CD4+T 細(xì)胞免疫活化負(fù)相關(guān)，與總HIV-1 DNA 水平無(wú)明顯相關(guān)性。本研究顯示了及早抗病毒治療以抑制CD4+T 細(xì)胞免疫活化的重要性，較低的CD4+T 細(xì)胞免疫活化水平不僅可以減少HIV-1 的靶細(xì)胞，還可以提高SAMHD1的表達(dá)水平，抑制HIV-1 的整合，從而降低HIV-1的感染及儲(chǔ)藏庫(kù)的形成。