ETAR-C58 多肽生物合成及其對(duì)黑色素瘤A375細(xì)胞遷移和侵襲的影響

張飛飛 張夢(mèng) 王中山

1徐州醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院，江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（江蘇徐州 221004）；2徐州市中心醫(yī)院，東南大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科（江蘇徐州 221009）

內(nèi)皮素（endothelin，ET）主要包括三種同分異構(gòu)體亞型，分別是ET-1、ET-2、ET-3，皮膚中主要表達(dá)ET-1［1］。內(nèi)皮素通過(guò)特異性結(jié)合其受體（ETR）而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，其受體分為兩種亞型即內(nèi)皮素A 受體（ETAR）和內(nèi)皮素B 受體（ETBR），兩者都是G 蛋白偶聯(lián)受體。ET 和ETR 構(gòu)成的內(nèi)皮素軸在多種腫瘤包括黑色素瘤中有促進(jìn)腫瘤的作用［2-4］。

黑色素瘤是一種惡性程度較高的皮膚腫瘤［5］，具有發(fā)病年齡早、轉(zhuǎn)移率高、臨床預(yù)后差等特點(diǎn)［6-7］，對(duì)各種化療藥物敏感性低且易產(chǎn)生耐藥。隨著惡性黑色素瘤的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升的趨勢(shì)［8］，迫切需要更有效的治療方法。

研究表明［9-12］，與良性痣相比，ETBR 在黑色素瘤中的表達(dá)增加，ETBR 的激活與黑色素瘤的侵襲密切相關(guān)，對(duì)其進(jìn)行阻斷可達(dá)到一定的治療效果［9，13］。另外β-arrestin1 作為支架蛋白通過(guò)ETR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用［14-16］。ET-1 激活ETR 后，吸引β-arrestin1到細(xì)胞膜聚集，而β-arrestin1 和ETR 之間的相互作用是通過(guò)ETR 的羧基末端識(shí)別介導(dǎo)的［17］。選擇性干擾ETBR 和β-arrestin1 的相互作用，就可能阻止β-arrestin1 介導(dǎo)的信號(hào)通路。因此，研究和開(kāi)發(fā)阻斷ETBR 和β-arrestin1 相互作用的藥物，很有可能具有良好的抗黑色素瘤作用。

在諸多抗腫瘤藥物中，多肽類(lèi)藥物因其相對(duì)分子質(zhì)量小、無(wú)免疫原性、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、副作用小等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受到人們的重視，尤其是來(lái)源于人類(lèi)自身蛋白的多肽。常規(guī)地采用化學(xué)合成法獲得多肽不僅成本較貴，而且合成過(guò)程中可能引入一定的毒性，限制了臨床應(yīng)用范圍。而大腸桿菌表達(dá)體系具有蛋白表達(dá)量高、易操作、培養(yǎng)成本低等優(yōu)勢(shì)，而且純化的重組蛋白可以大規(guī)模生產(chǎn)，為進(jìn)一步研究目的蛋白的生物活性奠定了良好的基礎(chǔ)。

基于此，本研究擬在體外通過(guò)大腸桿菌表達(dá)體系表達(dá)純化獲得ETAR 羧基末端58 個(gè)氨基酸的多肽（ETAR-C58）。在黑色素瘤細(xì)胞中，該多肽很有可能和ETBR 競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合β-arrestin1，從而干擾了ET-1/ETBR/β-arrestin1 信號(hào)通路的傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制了黑色素瘤的發(fā)展。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該多肽緩解了β-arrestin1介導(dǎo)的癌細(xì)胞遷移，侵襲等功能，為進(jìn)一步開(kāi)展對(duì)惡性黑色素瘤的科學(xué)研究和臨床應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料人源性惡性黑色素瘤A375 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)；大腸桿菌克隆宿主菌DH5α、表達(dá)宿主菌BL21（DE3）和表達(dá)質(zhì)粒pWaldo-GFPe 均為本實(shí)驗(yàn)室保存；限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA 連接酶購(gòu)自NEB；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA 聚合酶購(gòu)自南京諾唯贊；ET-1 購(gòu)自北京博奧森；DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自南京凱基；胎牛血清FBS 購(gòu)自L(fǎng)onsera；胰蛋白酶（0.25% Trypsin-EDTA）購(gòu)自Gibco；MatriGel 購(gòu)自BD；8 微米孔徑Transwell 24 孔板購(gòu)自CELLTER；鎳柱和分子篩購(gòu)自GE 公司；GFP 標(biāo)簽抗體和HRP 標(biāo)記的羊抗鼠二抗均購(gòu)自ABclonal；PCR 引物合成及測(cè)序由上海生工完成；FX101 細(xì)胞破碎儀（上海勵(lì)途公司）；蛋白純化系統(tǒng)AKTA Pure（GE 公司）；全能型成像系統(tǒng)（UVItech）；研究級(jí)倒置顯微鏡（OLYMPUS 公司）；Nanodrop 2000、酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo 公司）。

1.2 方法

1.2.1 ETAR-C58多肽基因的克隆提取人結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞的總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄酶的使用說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以獲得的cDNA 為模板，ETARC58F1：5′-CCATCTCGAGATGTACGGTCGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTTATTTTGTGAGCAAGAAATTTAAAA-3′（下劃線(xiàn)處為XhoI 酶切位點(diǎn)，加粗部分為T(mén)AT 穿膜肽序列）和ETAR-C58R1：5′-CGTCGGATCCGTTCATGCTGTCCTTATGGCT-3′（下劃線(xiàn)處為BamHI 酶切位點(diǎn)）為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，純化后的PCR 產(chǎn)物經(jīng)XhoI 和BamHI 酶切后克隆至pWaldo-GFPe 的相同位點(diǎn)，經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證后，獲得重組質(zhì)粒pWaldo-ETAR-C58。

1.2.2 ETAR-C58多肽的誘導(dǎo)表達(dá)與純化將轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒的BL21（DE3）表達(dá)菌株接種于200 mL含30 μg/mL 卡納青霉素的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接50 mL 菌液至1 000 mL LB 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600約為0.6，加入0.2 mmol/L 的IPTG，20 ℃誘導(dǎo)表達(dá)20 h 后，6 000 g 離心15 min收集菌體，并用80 mL 裂解緩沖液懸?。?0 mmol/L Tris-HCl pH8.0，300 mmol/L NaCl），加入50 μg/mL溶菌酶、200 U DNAase I 和1 mmol/L PMSF 后，采用細(xì)胞破碎儀800 MPa 破碎細(xì)胞兩次，4 ℃、8 000 r/min離心30 min去除細(xì)胞碎片。取上清液自然流過(guò)鎳柱，用100 mL 洗滌緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl pH8.0，300 mmol/L NaCl，10%甘油和30 mmol/L咪唑）沖洗柱子，用含高濃度咪唑的洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，300 mmol/L NaCl，10%甘油和300 mmol/L咪唑）洗脫目的蛋白質(zhì)，收集蛋白質(zhì)樣品，過(guò)分子篩柱子（緩沖液含20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，300 mmol/L NaCl，10%甘油），收集有吸收峰的蛋白質(zhì)樣品，SDSPAGE 檢測(cè)樣品的純度，采用Nanodrop 2 000 測(cè)定多肽濃度。

1.2.3 免疫印跡鑒定誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白通過(guò)SDS-PAGE 分離后，通過(guò)濕轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，隨后將膜用含有5%脫脂奶粉的TBST 室溫孵育2 h，加GFP 標(biāo)簽抗體（1∶1 000）于4 ℃孵育過(guò)夜，隨后TBST 洗膜3 × 3 min，加入HRP 標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，TBST 再次洗膜6 × 3 min，加入ECL 發(fā)光液，用UVI-tech 的全能型成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.2.4 A375 細(xì)胞處理及分組干預(yù)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于3.5 cm 培養(yǎng)皿中，在10%FBS+高糖DMEM、37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合率接近80%～90%時(shí)，進(jìn)行無(wú)血清化處理12 h，胰蛋白酶消化后，用血球板計(jì)數(shù)（為保障數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，重復(fù)計(jì)數(shù)3 次并取其平均值），按如下分組加入等數(shù)量的細(xì)胞：對(duì)照組，ET-1 組（10 nmol/L），ET-1 組+ETAR-C58 多肽（2 μmol/L）組，其中ETARC58 多肽在ET-1 干預(yù)前1 h 加入，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2.5 TAT-ETAR-C58 融合多肽穿膜進(jìn)入細(xì)胞的效率當(dāng)接種于3.5 cm 培養(yǎng)皿的A375 細(xì)胞融合率接近80%～90%時(shí)，加入2 μmol/L 純化的多肽，并于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6 h，PBS 洗滌后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)，通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察TATETAR-C58 融合多肽穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的效率。

1.2.6 A375 細(xì)胞的遷移根據(jù)1.2.4 所述進(jìn)行細(xì)胞的處理后，向24 孔板Transwell 上室加入用無(wú)血清DMEM 懸浮的細(xì)胞懸浮液2 × 104個(gè)細(xì)胞，用DMEM 補(bǔ)充至200 μL，下室加600 μL 含10%FBS的培養(yǎng)基。24 h 后移除上、下室的液體，下室加入600 μL 4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞20 min。移除多聚甲醛，PBS 洗滌后，下室加入600 μL 0.5%結(jié)晶紫（PBS 配制）染色15 min。再用PBS 洗滌3 次，用棉棒將上室內(nèi)壁和外壁殘留的結(jié)晶紫擦除，切勿碰到膜的表面。將洗滌好的上室轉(zhuǎn)移到新的24孔里，在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞并拍照。最后用20%乙酸進(jìn)行洗脫，酶標(biāo)儀OD600檢測(cè)。

1.2.7 A375 細(xì)胞的侵襲用無(wú)血清的冷DMEM 按照1∶7 稀釋Matrigel，取50 μL Matrigel 稀釋液加到24 孔板Transwell 上室中，37 ℃培養(yǎng)箱里風(fēng)干0.5 h。根據(jù)1.2.4 所述進(jìn)行細(xì)胞的處理后，向24 孔板Transwell 上室加入用無(wú)血清DMEM 懸浮的細(xì)胞懸浮液5×104個(gè)細(xì)胞，用DMEM 補(bǔ)充至200 μL，下室加600 μL 含10%FBS 的培養(yǎng)基，接下來(lái)的步驟和遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以（）形式表示，采用Graphpad Prism 軟件進(jìn)行分析處理，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ETAR-C58 多肽基因的克隆按照1.2.1 所述的克隆步驟，通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶XhoI 和BamHI 鑒定獲得重組子pWaldo-ETAR-C58，并送往上海生工公司測(cè)序。峰圖整齊有序，ETAR-C58 多肽序列正確，共174 bp，編碼形成6.8 kDa 的多肽，和TAT 穿膜肽（1.6 kDa）、GFP 標(biāo)簽（26 kDa）、TEV 酶切位點(diǎn)（0.9 kDa）融合后其相對(duì)分子質(zhì)量約為35.3 kDa。見(jiàn)圖1。

圖1 ETAR-C58 多肽表達(dá)載體測(cè)序峰圖Fig.1 Sequencing of ETAR-C58 peptide expression vector

2.2 ETAR-C58 多肽的誘導(dǎo)表達(dá)、純化與鑒定將pWaldo-ETAR-C58 轉(zhuǎn)化到E.coli BL21（DE3），經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE 分析，融合蛋白得到很好的表達(dá)，大小與預(yù)期完全一致，且可溶性融合多肽的表達(dá)量約為總蛋白的90%。融合多肽經(jīng)鎳柱和分子篩純化后，SDS-PAGE 檢測(cè)純度較高（＞95%），見(jiàn)圖2A。免疫印跡結(jié)果表明，融合多肽可與GFP 抗體發(fā)生特異性結(jié)合，在相應(yīng)位置有明顯的條帶，說(shuō)明純化獲得的融合蛋白就是需要的目的多肽，見(jiàn)圖2B。

圖2 融合多肽TAT-ETAR-C58 的表達(dá)純化及免疫印跡分析Fig.2 Expression，purification and western blotting analysis of fusion peptide

2.3 TAT-ETAR-C58融合多肽穿膜進(jìn)入細(xì)胞的效率TAT 穿膜肽可以作為載體攜帶多肽或蛋白質(zhì)片段，以非受體依賴(lài)的方式穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。為了檢測(cè)TAT-ETAR-C58融合蛋白穿膜進(jìn)入細(xì)胞的效率，2 μmol/L 多肽和A375 細(xì)胞孵育6 h，顯微鏡整個(gè)視野下幾乎所有的細(xì)胞均呈綠色，即TAT穿膜肽介導(dǎo)的融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞的效率較高。見(jiàn)圖3。

圖3 顯微鏡觀(guān)察TAT-ETAR-C58 融合多肽的穿膜效率Fig.3 Transmembrane efficiency of fusion peptide identified by microscope

2.4 ETAR-C58 多肽對(duì)A375 細(xì)胞遷移和侵襲的影響根據(jù)1.2.4 所述的方法將處理的A375 細(xì)胞分為三組：對(duì)照組（Control）、ET-1 組、ET-1+ETARC58 多肽組，ET-1 組中添加10 nmol/LET-1，可以激活黑色素瘤細(xì)胞里ET-1/ETBR 組成的內(nèi)皮素信號(hào)軸，ET-1+ETAR-C58 多肽組中提前添加2 μmol/L多肽，以期多肽干擾ET-1/ETBR/β-arrestin1 組成的信號(hào)通路，從而阻斷ET-1 所引起的細(xì)胞效應(yīng)。然后按照1.2.6 和1.2.7 所述的方法進(jìn)行Transwell 遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明ET-1 組較對(duì)照組，轉(zhuǎn)移和侵襲的細(xì)胞數(shù)明顯增加，這與已報(bào)道文獻(xiàn)的結(jié)果一致［18］；ET-1+ETAR-C58 多肽組可以部分阻斷ET-1 組引起的細(xì)胞遷移和侵襲效應(yīng)，即ETAR-C58多肽可以降低A375 細(xì)胞的遷移和侵襲能力，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 ET-1 和ETAR-C58 多肽對(duì)A375 細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響Fig.4 The effects of ET-1 and ETAR-C58 peptide on migration and invasion of A375 cells by Transwell

3 討論

TAT 穿膜肽是人類(lèi)免疫缺陷病毒1（HIV-1）來(lái)源的參與病毒復(fù)制的反式轉(zhuǎn)錄激活蛋白，作為經(jīng)典的細(xì)胞穿膜肽被廣泛用于各種物質(zhì)的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)［19-21］。本研究結(jié)果表明大多數(shù)細(xì)胞都具有綠色熒光，即大多數(shù)TAT-ETAR-C58-GFP 融合蛋白可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功能，說(shuō)明TAT 穿膜肽作為一種藥物運(yùn)輸載體具有較大的潛力。

為了提高目的融合肽的表達(dá)量和克服小肽易被蛋白酶所降解的缺點(diǎn)，本研究選擇以綠色熒光蛋白（GFP）作為融合標(biāo)簽，另外GFP 作為一種可以發(fā)出很強(qiáng)熒光的蛋白分子，可以很好地定位和追蹤目的蛋白。為了防止GFP 標(biāo)簽影響多肽的活性，本研究在多肽和GFP 之間添加了TEV 蛋白酶的酶切位點(diǎn)，方便下一步獲得沒(méi)有標(biāo)簽的多肽。β-arrestin1 可作為GPCRs 信號(hào)的轉(zhuǎn)換器，參與多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，引起細(xì)胞增殖、凋亡、組織的炎癥反應(yīng)及血管新生等生物學(xué)效應(yīng)［22-23］。上述生物學(xué)效應(yīng)與多種腫瘤的增殖、遷移、惡化、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。β-arrestin1 作為癌癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵分子，靶向β-arrestin1 的藥物研究將蘊(yùn)含巨大的臨床治療潛力。有研究表明［18］，ET-1/ETBR/β-arrestin1 信號(hào)軸參與調(diào)節(jié)了黑色素瘤細(xì)胞的遷移和血管生成擬態(tài)。ZHANG 等［24］發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤中主要表達(dá)截短的ETAR（缺少了外顯子3 和4），而且該ETAR對(duì)ET-1 的親和力較低。所以在黑色素瘤細(xì)胞中，主要是ET-1 和ETBR 組成的內(nèi)皮素軸發(fā)揮作用，而且β-arrestin1 可以和ETR 羧基末端結(jié)合進(jìn)而介導(dǎo)了信號(hào)通路的傳導(dǎo)［17］，根據(jù)這些特點(diǎn)，本研究創(chuàng)新性設(shè)計(jì)的ETAR-C58 多肽，可能通過(guò)干擾ETBR和β-arrestin1 之間的相互作用，進(jìn)而影響了該信號(hào)通路的傳導(dǎo)，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ETAR-C58 多肽抑制了A375 細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。說(shuō)明ETAR-C58 多肽可以干擾β-arrestin1 和ETBR 兩者的相互作用，進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)展。

本研究目前只是在體外水平，初步驗(yàn)證了ETAR-C58 多肽具有抗腫瘤的作用，下一步將采用TEV 酶切掉GFP 標(biāo)簽后，獲得分子量更小的活性ETAR-C58 小肽，通過(guò)進(jìn)行小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證其抗腫瘤活性，并對(duì)其作用機(jī)制做進(jìn)一步研究，以期開(kāi)發(fā)出一種新型、高效、低毒，具有良好臨床應(yīng)用前景的治療黑色素瘤的藥物。